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线粒体呼吸链超级复合物的功能性重建

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DOI：

10.3791/72243

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2026年8月21日

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

通讯作者： James A. Letts <james.letts@monash.edu>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出一种简单方案，将功能性线粒体呼吸体超级复合物重组到结构明确的蛋白脂质体中，用于结构与功能的关联表征。

摘要

线粒体是生物能量代谢的核心枢纽，也是ATP的主要来源。线粒体内膜上含有氧化磷酸化系统，包括电子传递链复合物（CI、CII、CIII）2，以及 CIV）和ATP合酶（CV）。在哺乳动物中，CI、CIII2, 以及CIV形成称为超复合物（SCs）的高级结构，例如SC I+III2+IV，SC I+III2，以及 SC III2+IV. 尽管有利于呼吸链超复合物（SC）形成的生理因素尚不明确，但有研究提出，SC的形成可能有助于增强复合物间的电子传递速率、减少活性氧的产生，或防止在线粒体内膜高密度排列环境下发生非特异性蛋白质聚集。对呼吸链SC的结构与功能研究在很大程度上依赖于去垢剂提取的复合物。尽管这些研究加深了我们对电子传递链的理解，但由于缺乏完整的膜双分子层结构，限制了对其组装功能优势的深入探究。然而，近期技术进展表明，膜蛋白可在重建的、类似天然的膜环境中进行结构表征，从而为相关研究提供了更接近生理状态的体系。本文介绍一种简单、快速且可重复的将呼吸链SC重组至脂质体中的实验方案。该方法可用于检测不同脂质组成、蛋白浓度及膜电位对呼吸链SC功能的影响，为后续机制研究提供了有力工具。

引言

线粒体是真核生物呼吸作用的核心。线粒体内膜（IMM）上存在氧化磷酸化系统，包括电子传递链复合物（CI–CIV）和ATP合酶（CV）1。CI和CII将来自还原性底物的电子传递给泛醌（CoQ），生成泛醇（CoQH2），后者通过CIII2并将电子经细胞色素c传递至CIV，在CIV处氧气被还原为水。CI、CIII2和CIV的质子泵作用建立质子动力势（PMF），CV利用该势能将ADP和无机磷酸（P）合成为ATP1。

除了独立发挥作用外，复合物I（CI）、复合物III二聚体（CIII2）和复合物IV（CIV）还可组装成具有确定化学计量比的高级超复合物（SC）结构，例如SC I+III2+IV（也称为呼吸体）、SC I+III2 和 SC III2+IV2,3,4,5。这些组装体的功能优势目前尚不明确6。关于其功能的假说涵盖从参与组装过程和底物通道化作用，到仅仅是线粒体内膜（IMM）中高蛋白密度所导致的副产物等多种观点3,7,8,9,10,11,12,13,14,15。最近的研究表明，膜的特性（包括由疏水不匹配引起的膜应变、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-脂质相互作用）有助于超复合物的形成与稳定性16。

膜蛋白的结构与功能研究传统上依赖于去污剂溶解的复合物，这种方法会破坏天然膜环境，限制了对依赖膜电位和离子梯度过程的探究。相比之下，近年来的研究进展表明，膜蛋白可以在重建17,18,19或天然膜20,21,22,23中进行结构表征，显著提升了我们研究依赖膜电位和离子梯度的膜蛋白功能机制的能力。

本实验方案描述了一种简单且可重复的方法，用于将线粒体呼吸链超复合物（SCs）重建到成分明确的蛋白脂质体中。所构建的体系为在可控的、类似天然的膜环境中研究呼吸链超复合物的形成、稳定性和功能等基本问题提供了有力平台。通过在重建过程中加入CoQ10和细胞色素c，我们证实了蛋白脂质体中的超复合物能够支持NADH驱动的耗氧反应，表明这些复合物在脂双层中仍保持功能活性。我们进一步展示了利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）可清晰观察蛋白脂质体中的超复合物，从而实现结构构象与生化活性之间的直接关联分析。

尽管该方法具有稳健性且易于重复，但成功的重组依赖于对脂质组成、去污剂浓度、蛋白质与脂质比例的仔细优化，以及有效的膜封闭，以维持超复合物的稳定性和活性。

本方法的总体目标是在定义明确的膜条件下，实现对呼吸链超复合物（SCs）的整合性结构与功能分析。该方法通过将超复合物恢复至封闭的脂双层中，克服了基于去垢剂体系的关键局限性，从而支持膜电位的形成以及生理相关的蛋白质-脂质相互作用。此外，该系统可精确控制脂质组成、辅因子和蛋白质含量，非常适合系统性地测试膜特性如何影响超复合物的稳定性和活性。与去垢剂溶解的样品或原位（in situ）方法相比，该方法具有显著优势，即可将功能测定（如NADH驱动的氧气消耗）与基于冷冻电镜（cryo-EM）的结构分析相结合，从而实现其他系统难以达到的结构-功能关联研究。

方案

从市售猪心脏中分离线粒体膜 从用于人类食用而屠宰的动物身上采集的组织。本方案未专门使用活体动物。由于该组织是屠宰副产品，其使用被认定无需经过动物伦理审批。 用于人类食用而被屠宰的动物

1. 从猪心线粒体洗涤膜中纯化线粒体超复合物 SC I+III2/SC I+III2+IV

  1. 解冻40 mg（4 mL）经洗涤的线粒体膜，分装为10 mg/mL的等份（经洗涤的线粒体膜按先前报道的方法制备）24,25).
  2. 在4 mL缓冲液MX（30 mM HEPES，pH 7.7，150 mM醋酸钾，10%甘油，1 mM EDTA，0.002% (w/v) 苯甲基磺酰氟，0.1% (w/v) CHAPS（3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐），1 mM铁氰化钾）中稀释膜样品。加入8 mL含2% (w/v) 数字苷（8 mL中含160 mg数字苷）的缓冲液MX（最终比例为4:1，mg数字苷:mg总膜蛋白）。终体积为16 mL。
  3. 在Dounce匀浆器中手动匀浆（50次），注意避免引入气泡。4 ℃孵育（旋转）1小时 °C.
  4. 将匀浆在16,000 × g条件下离心 × g, 4 °30 分钟内收集上清液。
  5. 使用截留分子量为100 kDa的离心过滤浓缩器，在3000 × g条件下将上清液浓缩至1 mL × g, 4 °C. 以10分钟为一个浓缩周期，离心间充分混匀，直至达到所需体积（若离心周期之间未重新悬浮，样品易发生聚集，原因是滤膜附近去垢剂局部浓度升高所致）。
  6. 将浓缩的样品均分为四份，每份250 µL 等分试样。 
  7. 用尺寸排阻层析缓冲液（SEC缓冲液；30 mM HEPES pH 7.8，150 mM醋酸钾，1 mM EDTA，0.005% Glycocide去污剂）平衡尺寸排阻层析柱（柱体积：24 mL），流经体积为48 mL（2个柱体积）。
  8. 设置层析程序，从洗脱体积6 mL开始收集1 mL的组分，持续收集至洗脱体积24 mL。注入250 µ将L等分试样（来自步骤1.6）上样至24 mL凝胶过滤层析树脂中。使用预先用凝胶过滤层析缓冲液（来自步骤1.7）平衡的层析柱。在开始下一次运行前，收集分馏收集器中的各组分。
  9. 重复步骤 1.7 和 1.8，处理步骤 1.6 中剩余的浓缩分装样品。
  10. 运行 10 µL 从 SEC 洗脱的各组分与 5 混合 µ在3%–12%丙烯酰胺梯度胶上加入L型蓝-native聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）上样染料，并进行NADH/氮蓝四唑氯化物复合物I原位凝胶活性检测26  检测各组分的CI活性。 
    注意：呼吸系统干细胞在约11.5 mL的洗脱体积下从24 mL交联琼脂糖凝胶过滤介质中洗脱出来。
  11. 合并CI原位活性凝胶检测中显示最高高分子量CI活性的组分。按照上述1.5步骤所述方法浓缩样品。
    注意：浓缩的SCs可在含有30%（v/v）甘油的糖苷类去垢剂glyco-diosgenin GDN中保存，最终浓度约为10 mg/mL，储存于液氮中240 mg 的洗涤线粒体复合物经BCA法测定，得到总蛋白3.4 mg。

2. 脂质混合物的制备

注意：修改自先前报道的实验方案27,28。氯仿具有毒性、易挥发，且可能具有致癌性。仅可在经认证的化学通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备。戊烷高度易燃，应远离点火源。仅可在经认证的化学通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备。有机溶剂废液应根据机构环境健康与安全（EH&S）政策，弃置于经批准的含卤/非含卤溶剂废液容器中。

  1. 在通风橱中操作，配制25 mg/mL的POPC（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱），POPE（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）和CL（心磷脂：1,3-双(sn-3’-磷脂酰-sn-甘油；来自牛心组织）分别溶于氯仿中。 
  2. 配制 10 mM CoQ10 在氯仿中。对于25 mg的总脂质混合物，加入0.4 mL（10 mg）POPC、0.4 mL（10 mg）POPE、0.2 mL（5 mg）CL以及50 µ10 mM CoQ 溶液10 （最终浓度 500 nmol CoQ）10 （20 nmol CoQ10将储备液中的 POPC、POPE 和 CL 按质量比 2:2:1 的比例加入至 13 mL 玻璃试管中。
  3. 在惰性气体流（氩气或氮气）下干燥混合物，以去除氯仿，同时轻轻旋转试管，使脂质混合物在管壁上形成一层薄膜。持续通入惰性气体干燥10分钟。
  4. 用1 mL戊烷重新溶解干燥的脂质层，并重复步骤2.3，以促进去除残留的氯仿。
  5. 将干燥的脂质管置于室温下的真空干燥器中孵育过夜，以彻底去除溶剂。 
  6. 加入5 mL蛋白脂质体缓冲液（PLB；10 mM MOPS pH 7.4，150 mM KCl）以重新水合脂质混合物，密封管口防止溢出，轻轻涡旋至脂质完全溶解（管壁表面不再可见干燥脂质）。
  7. 移除封口，用惰性气体（氩气或氮气）填充试管，重新密封，并在室温下孵育1 h。孵育1 h后，制备300 µ将脂质混合物分装成 L 体积的等份，于 −20 ℃ 保存 °C. 
    注意：选择POPC:POPE:心磷脂（2:2:1）混合物是基于经验优化的结果，且因为磷脂酰乙醇胺（PE）和心磷脂是线粒体内膜的主要组分；然而，本方案可轻松调整以测试其他脂质组成。

3. 将线粒体SCs重构至脂质体中

  1. 解冻保存在液氮中的SC冻存管  （步骤 1.12）置于冰上。通过将样品重悬于 SEC 缓冲液中进行缓冲液置换，以去除样品中的甘油。使用截留分子量为 100 kDa 的离心过滤器，在 3000 × g 条件下浓缩样品 × g 4 ℃时 °C. 在浓缩离心过程中（约每5分钟），通过将样品重悬于SEC缓冲液中继续进行缓冲液置换。
  2. 使用BCA法（二辛可宁酸蛋白检测试剂盒）检测SC的最终浓度。
  3. 解冻一个300 µ取步骤2.7中制备的脂质混合物适量，使用装有100 nm聚碳酸酯膜的挤出器在室温下挤出六次（每个循环指将脂质混合物从左侧注射器推至右侧注射器再返回）。完成挤出循环后，从起始侧相对的注射器中收集所得的100 nm脂质体。 alternatively，脂质体也可通过超声处理制备。 
  4. 加入9 µ20% (w/v) 去垢剂 0.6% (w/v) 终浓度，加至 250 L µ在另一试管中加入挤出的脂质混合物 L。
    注意：可以尝试不同的去垢剂。在这些实验中，阴离子胆盐去垢剂胆酸钠的效果最佳。
  5. 轻柔倒置混匀，4℃孵育 °30 分钟，30 °C 
  6. 加入120 µg（或更大）线粒体SC和3 µ10 mM 细胞色素 c 的 L（终浓度为 100） µM）加入混合物中，加水定容至 300 µL 与 PLB 混合。最终脂质与蛋白质的比例约为 10:1（w:w）。作为额外对照，通过将 SEC 缓冲液（30 mM HEPES，pH 7.8，150 mM 醋酸钾，1 mM EDTA，0.005% 糖苷类去垢剂）加入脂质-去垢剂混合物中，代替线粒体 SCs 和细胞色素，平行制备空脂质体。 c. 
  7. 轻柔倒置混匀，4 ℃孵育 °30 分钟，30°C 
  8. 用PLB缓冲液通过重力流洗涤含有G-25树脂的预装脱盐离心柱四次。随后，在1,000 × g下离心洗涤柱子 × g 2 分钟。
  9. 将蛋白脂质体样品加入经洗涤的预装G-25脱盐旋转柱中，于1,000 × g离心该柱 × g 4 ℃时 °C 下孵育 2 分钟以去除去垢剂。收集洗脱液。
    注意：通过挤出法制备的脂质体比超声处理制备的脂质体具有更均匀的粒径分布。预装脱盐离心柱的离心时间不得超过制造商推荐时长，以避免样品被去垢剂污染。蛋白脂质体于4℃保存。 °C，通常在36小时内使用，以尽量减少活性损失并保持超复合物的完整性。

4. 脂质浮选实验29

  1. 在 PLB 中配制 27% 和 7% (w/v) 的蔗糖溶液。在 3.5 mL 离心管中，依次加入 1.5 mL 27% 蔗糖溶液和 0.9 mL 7% 蔗糖溶液，制备成阶梯梯度。
  2. 将 300 µL 含 SC 的蛋白脂质体（来自步骤 3.9）小心地铺在蔗糖梯度上层。在 4 °C 条件下，使用固定角转子以 100,000 × g 离心 2 小时。
  3. 从上至下小心收集 9 份 300 µL 的组分（或 10 份 270 µL 的组分），尽量避免混合。若存在沉淀，将其重悬于最后一份组分中，并作为第 9 或第 10 份收集。任何未重组的 SC 应富集在第 9 或第 10 份中。
    注意：漂浮实验有助于将重组的蛋白脂质体与空脂质体及未重组的蛋白复合物分离，用于优化重组效率。

5. 细胞色素c氧化酶光谱法铁氰化物活性检测及细胞色素c氧化酶凝胶内活性检测

  1. 配制所需量的铁氰化物反应缓冲液（FRB；20 mM Tris HCl，pH 7.4，50 mM NaCl，0.1% w/v 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐（CHAPS），1 mM 铁氰化钾）。
  2. 将990 µL反应缓冲液分装至1 mL比色皿中。向比色皿中加入5 µL样品（来自每个梯度组分），然后向反应体系中加入5 µL 20 mM NADH（终浓度为100 µM）。用透明封膜密封比色皿，并通过倒置混匀。
  3. 在分光光度计中于25 °C下监测340 nm处吸光度下降的速率。340 nm处吸光度的降低表明NADH被氧化。对所有组分进行三次重复实验。使用5 µL PLB代替样品作为空白对照。
  4. 扣除空白值后计算NADH氧化速率，并绘制各组分的总活性图。
    注意：也可在96孔板中进行该实验。
  5. 合并总活性最高的组分（避免收集试管底部含有活性的组分，因其对应未重组的蛋白）。用PLB将合并后的组分调节至总体积20 mL，以稀释蔗糖。
  6. 在4 °C下，使用固定角转子以150,000 × g 离心1 h。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL PLB中。
  7. 取上述步骤中重悬的沉淀25 µL，与25 µL含2% w/v Digitonin的PLB混合，在4 °C下孵育（旋转）1 h。
  8. 在16,000 × g 下离心20 min，沉淀未提取的蛋白质，收集上清液。
  9. 向30 µL上清液中加入10 µL BN-PAGE上样染料，加载至3%–12%梯度BN-PAGE凝胶。运行两块凝胶，用于进行CI和CIV胶内活性检测26。
  10. 首先使用深蓝色BN-PAGE电泳缓冲液（25 mM Tris，0.192 g甘氨酸，200 mg考马斯亮蓝）在150 V下电泳30 min。随后更换为浅蓝色缓冲液（25 mM Tris，pH 8.3，0.192 g甘氨酸，20 mg考马斯亮蓝），在200 V下继续电泳2 h。
  11. 电泳结束后，将凝胶转移至合适的容器中，进行CI和CIV胶内活性检测26。
    注意：若需对脂质体中重组的复合物进行结构与功能研究，可使用步骤5.6中剩余的重悬蛋白脂质体。一旦重组条件完全优化，可跳过步骤4和5，直接使用步骤3中获得的重组蛋白脂质体。

6. 采用ACMA荧光淬灭实验检测重建蛋白脂质体的膜完整性29

  1. 配制所需体积的ACMA（9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶）反应缓冲液（10 mM MOPS，pH 7.4，15 mM KCl，4 µM ACMA，0.5 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA），2 mM 2-巯基乙醇）。 
  2. 将930 µL反应缓冲液分装至1 mL比色皿中。加入50 µL重建的蛋白脂质体至比色皿中，密封比色皿，并通过倒置混匀。避光孵育8分钟。
  3. 将光谱仪参数设置为：激发波长410 nm，发射波长490 nm。 
  4. 孵育结束后，再次通过倒置混匀比色皿，并在室温下使用光谱仪读取荧光信号，持续8分钟。
  5. 向比色皿中加入4 µL 20 µM缬氨霉素（终浓度为80 nM），倒置混匀，继续测量8分钟。
  6. 向比色皿中加入6 µL 1 mM CCCP（羰基氰化物m-氯苯腙）（终浓度为6 µM），倒置混匀，继续测量8分钟。
  7. 为建立空脂质体对照，重复步骤6.2–6.6，但将重建的蛋白脂质体替换为“空脂质体”。空脂质体的制备过程与重建的蛋白脂质体相同，仅在重建步骤（步骤3.6）中以SEC缓冲液替代SCs的加入。
  8. 对重建的蛋白脂质体和空脂质体均进行三次重复测量，并绘制其随时间变化的相对荧光强度。
    注意：重建的蛋白脂质体或空脂质体的数据均按 (Fi − Fmin)/(Fmax−Fmin) 进行归一化处理，其中Fmax为该样品初始基线荧光值，Fmin为加入CCCP后该样品的最低基线荧光值。
    警告：CCCP为有毒的线粒体解偶联剂，操作时应在通风橱内佩戴手套进行。

7. 通过耗氧量的呼吸测量法评估重建的 SCs 的功能30。

注意：使用克拉克型氧电极系统测定耗氧率。重组SC的功能测定直接在脱盐柱洗脱液（步骤3.9）上进行。

  1. 根据制造商的说明设置氧电极系统仪器，并打开仪器控制软件。向测量室中加入 2 mL 超纯水。
  2. 调节搅拌速度，直至氧浓度曲线在搅拌速度增加时保持不变（从 10 开始，以 10 为增量逐步增加）。移除 MQ 水，加入已充氧的水（剧烈震荡过的 MQ 水）。
  3. 单击“校准” > “液相校准” > “空气饱和水”，等待校准稳定（速率为 0 nmol/分钟）。使用小刮勺向反应室中加入少量（4–6 粒）连二亚硫酸钠晶体，以建立室内零氧状态。
  4. 等待信号达到平台期后再继续操作。保存校准结果，并用 5 × 1 mL 70% 乙醇、5 × 1 mL 0.1 mM EDTA、5 × 1 mL MQ 水以及 5 × 1 mL 氧电极反应缓冲液（ORB；150 mM KCl、50 mM MOPS pH 7.4、5 mM MgCl2、5 mM KH2PO4、0.02 mM EGTA、0.5 mg/mL BSA）依次清洗反应室。
  5. 加入 2 mL ORB，单击软件中的“开始读取”按钮，等待曲线稳定。在将蛋白脂质体（样品）加入反应室的同时，在软件中标记以显示样品的添加。
    注：蛋白脂质体样品中的蛋白浓度根据加入脂质体的总蛋白量估算。蛋白:脂质比为 1:12，且在氧电极系统腔室（2 mL）中最终蛋白浓度为 50 µg/mL 时效果最佳。未测定蛋白脂质体的确切产率。
  6. 待氧电极系统读数稳定后，向反应室中加入 NADH，并同时在软件中标记以指示 NADH 的添加。继续读取 5 分钟。
  7. 加入 CCCP 并在软件中标记其添加，继续读取 5 分钟。
  8. 加入一种抑制剂（例如复合体 I 抑制剂（Piericidin A）、复合体 III2 抑制剂（Myxothiazol）或复合体 IV 抑制剂（NaN3）），并在软件中标记该添加，读取 2 分钟后停止读取。 
  9. 保存曲线，并在进行下一次测量前，用 5 × 1 mL 70% 乙醇、5 × 1 mL 0.1 mM EDTA、7 × 1 mL MQ 水以及 5 × 1 mL ORB 清洗反应室。
  10. 为对数据进行背景速率校正，计算背景速率，即添加 NADH 前读数的斜率，并将该速率线性外推至整个测量时间过程，计算每个时间点的预期背景 [O2]。然后从每个时间点测得的 [O2] 值中减去外推的背景 [O2] 。
  11. 将添加各试剂后的背景校正 [O2] 浓度测量值的斜率作为氧消耗速率（OCR）进行计算。
  12. 为计算相对于添加 NADH 后的 OCR 的相对速率，对每条独立曲线，将测得的每个 OCR（例如分别添加 NADH、CCCP 和抑制剂后的 OCR）除以添加 NADH 后测得的 OCR。     
    注：警告：连二亚硫酸钠是一种强还原剂，可能与氧化剂或水分剧烈反应。操作时需佩戴手套。含抑制剂的废液应按照机构指南作为危险化学品废物处理。

8. 使用动态光散射法估算重建脂质体的大小

  1. 打开动态光散射（DLS）仪器电源，激光器预热约 30 分钟以达到稳定状态。
  2. 启动仪器采集软件，并关闭任何先前打开的文件。
  3. 用 0.2 μm 滤膜过滤蛋白脂质体，以去除颗粒物。
  4. 将 70 µL 蛋白脂质体转移至洁净的比色皿中，避免留下指纹或污渍。
  5. 将比色皿放入仪器中，并牢固关闭盖子。
  6. 创建新文件，选择手动测量 > 粒径（Manual Measurement > Size）。
  7. 设定温度为 25 °C，衰减指数保持自动模式。
  8. 定义分散介质的性质（黏度和折射率；例如，水/缓冲液的 RI = 1.330）。
  9. 设置采集参数（自动时长、约 3 次测量、通用处理模式）。
  10. 开始测量，监测粒径、多分散系数（PDI）和计数率（目标值约为 100–500 kcps）。
  11. 分析结果：检查粒径分布（强度/体积）、PDI（<0.3 为可接受）和自相关函数质量（平滑衰减、基线稳定）；保存数据。

9. 冷冻电子显微镜载网制备与筛选

  1. 使用第5.11步（若跳过第4和第5步，则使用第3.9步）的蛋白脂质体样品制备电镜载网。如有需要，可重复第5.6步并通过重悬于更小体积的PLB缓冲液中浓缩蛋白脂质体。
  2. 使用辉光放电清洗系统，在300目铜网上进行90秒、20 mA的空气辉光放电处理，铜网预先涂有打孔碳膜。
  3. 设置一台自动化冷冻投入仪，用于在95%湿度和15℃条件下进行冷冻投入 °C，参数设置为：转印时间10 s，转印力度−8，等待时间10 s，排水时间0。
  4. 将镊子及其夹持的辉光放电载网连接到冷冻投入装置系统上。
  5. 加入 4.0 µ将蛋白脂质体样品的 L 加载到自动 plunging 仪的辉光放电载网上。
  6. 将载网孵育10秒，然后用滤纸吸去多余液体10秒，迅速投入液态乙烷中进行冷冻。小心将载网转移至液氮中的载网盒内2 腔室，随后转移至液氮2 储存杜瓦瓶
  7. 使用冷冻样品载入装置，在透射电子显微镜上加载冷冻网格并进行筛选。所用透射电子显微镜配备直接电子探测器。
  8. 根据制造商的说明设置显微镜，并对重组蛋白脂质体的载网进行筛选。保存图像。
    注意：警告：液态乙烷高度易燃且为低温液体；操作时须佩戴适当的个人防护装备，并远离点火源，以防引发火灾及冻伤。液氮为低温液体，可能导致严重冻伤，并引起氧气置换。操作时须佩戴适当的低温个人防护装备，且仅可在通风良好的区域使用。

结果

通过本方案，我们确定了从猪心线粒体中分离的线粒体超复合物（SCs）的最佳重建条件（图1A、B）。蔗糖阶梯梯度法可有效将重建的蛋白脂质体与空囊泡及未整合蛋白分离，从而实现快速检测和条件优化。 图2 所示的代表性结果展示了离心前后上样样品在梯度中的分布情况。此外，我们优化了用于将呼吸链超复合物重建入脂质体的去垢剂。分别使用四种不同的去垢剂——阴离子胆汁盐去垢剂、CHAPS、毛地黄皂苷（digitonin）和糖苷去垢剂——进行超复合物的重建。通过NADH-铁氰化物氧化还原测定法检测每种去垢剂处理后各组分中的总复合物I（CI）活性（图3A–D）。在成功重建的情况下，复合物I的最大活性出现在两种蔗糖浓度（27% w/v 蔗糖和7% w/v 蔗糖）界面处的组分中。值得注意的是，在使用阴离子胆汁盐去垢剂和CHAPS时，第#10组分中检测到的活性最低；而使用毛地黄皂苷和糖苷去垢剂时，第#10组分仍表现出显著活性，表明毛地黄皂苷和糖苷去垢剂不能有效地将超复合物重建入脂质体。因此，后续所有重建实验均采用阴离子胆汁盐去垢剂。

对经皂苷（digitonin）提取的POPC:POPE:CL（2:2:1）蛋白脂质体进行蓝-native聚丙烯酰胺凝胶电泳（blue-native polyacrylamide electrophoresis）后，通过CI和CIV的凝胶内活性检测，展示了重组后呼吸链超复合物（SC）及各电子传递链（ETC）复合物的相对含量（图4）。结果表明，在经皂苷再提取并进行BN-PAGE分析后，蛋白脂质体中CI与CIII2之间的相互作用仍基本保持。尽管在超复合物条带中可检测到部分CIV活性，但在较低分子量处也观察到强信号，与单独的CIV一致，表明部分解离。通过ACMA荧光淬灭实验检测了重组脂质体的膜通透性，结果显示蛋白脂质体对质子泄漏不显著（图5A、B）。利用动态光散射（DLS）估测了重组脂质体的尺寸，表明在重组前经过挤出处理后，空脂质体的平均直径为82.9 ± 0.8 nm，而重组超复合物蛋白脂质体（RSPs）的平均直径为110.6 ± 0.4 nm（图6）。通过检测蛋白脂质体的耗氧情况评估超复合物功能，结果显示存在明显的抑制剂敏感性NADH驱动耗氧（图7A）。将OCR值相对于加入NADH后的OCR作图，可直接反映RSPs内部的偶联程度，即加入CCCP后的OCR相较仅加入NADH时提高了约1.5倍（图7B）。冷冻电镜（Cryo-EM）载网的筛选实现了蛋白脂质体膜中超复合物的可视化，证实了重组成功（图8A–I）。

色谱过程，紫外吸收图，BN-PAGE 凝胶，蛋白质纯化，检测结果
图1: 从猪心线粒体中分离和表征去垢剂溶解的超复合物 (A) 猪线粒体膜复合物经皂苷提取后，采用尺寸排阻色谱法（SEC）纯化的代表性色谱图。B) 分离组分的蓝非变性PAGE（BN-PAGE） A 通过CI凝胶内活性染色法进行可视化。 请点击此处以查看此图的放大版本。

密度梯度离心，蛋白脂质体分离示意图；囊泡和蛋白层分析。
图 2：含蛋白脂质体的蔗糖阶梯梯度。 离心前（左），超速离心机中以 100,000 × g 离心 2 小时后（右）。加样至梯度中的蛋白脂质体样品被分离为空囊泡、蛋白脂质体以及底部的聚集蛋白。随后按所述方法对梯度进行分段收集，用于进一步表征。各组分的大致范围已标示并标注。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示不同去垢剂中酶活性的柱状图：牛磺胆酸钠、CHAPS、GDN、皂苷。
图 3： 利用漂浮实验评估不同去垢剂中的蛋白重组效率。在使用(A)阴离子胆汁盐去垢剂、(B) 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐（CHAPS）（0.6% (w/v)）、(C) 皂苷（0.6% w/v）、(D) 糖苷去垢剂（GDN）（0.6% (w/v)）进行重组后，蔗糖阶梯梯度各组分中的CI NADH-铁氰化物活性。第#10组分是通过将最终组分中的任何沉淀重新悬浮获得的。第#10组分中的活性表明蛋白质未成功重组。n = 3，误差线表示标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示蛋白质分离结果的电泳凝胶示意图；标记的条带表示蛋白质类型。
图 4： 在3%–12% BN-PAGE上运行的经皂苷素提取的蛋白脂质体的凝胶内活性检测。 复合物I（左侧）和复合物IV（右侧）的凝胶内活性检测。R = 呼吸体（SC I+III2+IV），SC1,3（SC I+III2），IGA CI =（复合物I凝胶内活性检测）；IGA = 凝胶内活性检测，CIV =（复合物IV凝胶内活性检测）。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光淬灭图，空脂质体与蛋白脂质体，缬氨霉素和CCCP处理。
图5：利用ACMA荧光淬灭实验检测重建蛋白脂质体中的质子渗漏。使用pH敏感性染料（ACMA），在依次加入缬氨霉素和CCCP后，比较重建蛋白脂质体（青色）与空脂质体（橙色）内部的pH变化。图中显示了来自不同蛋白脂质体制备样品的代表性ACMA荧光轨迹，用于对比分析。（A） 膜结构受损（渗漏）的重建脂质体。（B） 膜结构完整的重建脂质体。请点击此处查看该图的放大版本。

比较蛋白脂质体和空脂质体的粒径分布图；体积与粒径分析。
图6：空脂质体与重组SC蛋白脂质体的动态光散射测量结果。图中显示了挤出后的空脂质体（橙色）和SC重组蛋白脂质体（青色）的平均体积加权粒径分布。实验进行了三次技术重复。空脂质体的平均流体力学直径为82.9 ± 0.8 nm，而RSPs的平均流体力学直径为110.6 ± 0.4 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞呼吸、氧气消耗图以及分析NADH、CCCP、Piericidin A效应的柱状图。
图7： 通过氧气消耗实验评估重建的超复合物（SCs）在脂质体中的偶联状态。通过测量氧气消耗来评估电子传递链复合物在挤出法制备的脂质体中重建后的呼吸活性及偶联情况。（A） 代表性背景校正后的氧电极曲线，显示依次加入NADH以启动CI驱动的呼吸、CCCP以消除质子梯度并测量最大非偶联氧消耗速率（OCR）、Piericidin A以抑制CI、Antimycin A以抑制CIII2、或NaN3（叠氮化钠）以抑制CIV后，氧气浓度的变化。（B） 在指定条件下OCR的定量分析，并根据步骤7.10进行校正。每个曲线对应的NADH加入后的OCR相对值以数据点表示，同时显示均值 ± 标准差（误差线）。请点击此处查看该图的放大版本。

脂质囊泡形成的冷冻电镜分析；箭头标示囊泡结构；比例尺为10-50 nm。
图8: 蛋白脂质体膜中重建的SCs的冷冻电镜可视化。(A–C) 筛选载网的代表性电镜图像，显示与蛋白脂质体膜相关的重建SCs。重建的SCs以黄色箭头标示。比例尺 = 50 nm。(D–I) 在蛋白脂质体膜上以更高倍数观察的代表性SC颗粒。比例尺 = 10 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种简单且可重复的方法，用于将线粒体呼吸链超复合物（SCs）重建到定义明确的蛋白脂质体中，从而实现对其结构和功能的可控研究。该方案中有多个步骤对成功重建至关重要。据我们经验，通过挤出法制备的脂质体比超声处理法制备的脂质体具有更均一的粒径分布（通过动态光散射评估）。使用预装脱盐离心柱有效去除去垢剂对于促进膜的封闭以及SCs正确整合入脂双层至关重要；若去垢剂去除不完全，可能导致渗漏或不稳定的蛋白脂质体。优化脂质组成、蛋白与脂质比例以及去垢剂的选择同样重要，因为这些参数会显著影响重建效率和SCs的稳定性。蔗糖梯度漂浮实验适用于初步优化；然而，一旦条件确定，建议在使用预装脱盐离心柱后直接使用蛋白脂质体进行后续的结构与功能分析，以避免在梯度分馏过程中造成样品损失和破坏。不同制备样品中检测活性所需的加样体积可能有所不同，请根据具体制备情况调整加入反应体系的体积。呼吸链超复合物在蛋白脂质体膜中的取向会显著影响呼吸活性的测量结果。本重建方法并未优化以强制实现单一拓扑结构；因此，尽管预期存在混合取向的群体，但CI铁氰化物可及性实验表明，复合物I（CI）的外周臂主要倾向于朝向外侧。

通过实验评估了重建的超复合体的取向，并在有无去垢剂存在的情况下测定了复合体I（CI）的铁氰化物活性。在完整的外周小体（RSPs）中，外源添加的NADH只能接触到其外周臂暴露于外部介质中的复合体I分子，而去垢剂透化则允许NADH进入所有复合体。因此，该检测方法估计的是面向外部介质的功能性可接触的复合体I外周臂数量所占的比例，而非提供蛋白脂质体拓扑结构的完整解析。在上述条件下测得的活性比较表明，83.1% ± 0.04%的呼吸小体（即超复合体SC）其复合体I的外周臂朝向外侧，揭示了在重建过程中存在显著的取向偏好性。

多种修饰和故障排除策略可提高可重复性和稳定性。对蔗糖梯度离心后收集的组分经十二烷基麦芽糖苷提取后进行CI和CIV的凝胶内活性检测，结果显示存在超复合物（SC）条带，表明在重组过程中SC并未完全解离。然而，CI活性凝胶上的SC条带比CIV活性凝胶更强，表明CIV在重组后可能部分从CI和CIII2中解离（图4）。调整脂质组成可能增强SC的稳定性。CIV的部分解离也可能源于去垢剂的选择或重组过程中去垢剂的快速去除，这可能会破坏超复合物内较弱的蛋白质–蛋白质相互作用。进一步优化去垢剂交换条件可能有助于提高CIV的保留率。此外，尽量减少机械应力、避免不必要的纯化步骤以及谨慎处理样品，均有助于维持蛋白脂质体的完整性。在功能测定中，确保蛋白脂质体完全封闭至关重要，因为膜通透性会阻碍跨膜质子梯度的耦合。在冷冻电镜载网制备过程中，使用连续碳支持膜载网非常重要，因为已有研究表明这可改善颗粒在载网孔内的分布19。

尽管该方法具有优势，但仍存在局限性。蛋白脂质体无法完全重现天然线粒体内膜的组成和动态复杂性，且呼吸链超复合体（SC）组分（尤其是复合体IV，CIV）的部分解离仍然是一个挑战。功能检测结果也可能受到偶联不完全或重建效率异质性的影响。然而，与去垢剂溶解体系相比，该方法能够保留脂质-蛋白质相互作用，并提供类似天然的膜环境，同时相较于原位（in situ）方法具有更高的实验可控性。因此，该方法为系统研究脂质组成和膜特性如何调控呼吸链超复合体的稳定性与活性提供了一个有价值的平台。

理解这些关系尤为重要，因为呼吸链超复合体结构的破坏已被证实与多种线粒体及代谢性疾病相关31,32,33,34,35,36,37,38,39,40。电子传递链（ETC）复合体组装、心磷脂合成或脂质重塑的缺陷——如在Leigh综合征41,42,43,44,45,46,47、Barth综合征48,49,50,51,52,53,54和Sengers综合征48中所观察到的——可导致超复合体不稳定，损害电子传递，降低ATP生成，并增加活性氧（ROS）的产生。这些生物能量缺陷对心脏、骨骼肌和大脑等高能量需求组织的影响尤为显著，可导致心肌病、运动不耐受和神经退行性病变等表型36,37,38。相反，新兴证据表明，在应激条件下，超复合体的形成可通过稳定ETC复合体并限制病理性ROS的生成，发挥代偿性和保护性作用55,56。本文所述的重建蛋白脂质体平台提供了一个可控系统，可直接检验与疾病相关的脂质重塑、基因突变或药物干预如何改变超复合体的组装与功能，从而推动对线粒体功能障碍的机制研究，并为未来的治疗策略提供依据。

低耗氧速率可能源于超复合物整合不良、复合物IV部分解离、残留去垢剂、辅酶Q10或细胞色素c不足、NADH降解，或氧电极室中蛋白浓度过低。应通过浮力测定法或BN-PAGE验证重组效果，利用ACMA荧光淬灭实验确认膜完整性，制备新鲜NADH，并优化蛋白与脂质比例、辅因子浓度、去垢剂去除效率及样品浓度。蛋白脂质体泄漏可能由去垢剂去除不完全、去垢剂浓度过高、操作剧烈、反复冻融循环或脂质受损引起。若在ACMA实验中观察到质子泄漏，应使用新平衡的脱盐柱重复去垢剂去除步骤，避免过度离心柱子，制备新鲜脂质体，尽量减少机械应力，并在重组后立即使用蛋白脂质体。在浓缩过程中可能发生聚集，原因包括浓缩膜处局部蛋白或去垢剂浓度过高。建议采用短时间（10分钟）离心循环进行样品浓缩，每次离心后轻柔重悬样品，避免过度浓缩，保持样品处于4 °C，并在后续使用前通过低速离心去除可见聚集体。浮力行为不一致可能反映脂质体尺寸不均、去垢剂去除不完全、发生聚集、蔗糖梯度分层不当，或在加样或收集成分时梯度遭到破坏。应制备新鲜蔗糖溶液，缓慢分层以避免界面混合，使用均一挤出的脂质体，保持离心条件恒定，并从上至下轻柔收集各组分。冷冻电镜颗粒分布不佳可能由蛋白脂质体浓度过低、存在聚集、优先吸附于碳膜、载网润湿不良、冰层过厚或 blotting 过度引起。应优化蛋白脂质体浓度，在制网前去除聚集体，调整辉光放电条件，测试 blotting 时间与力度，筛选不同类型的载网或碳支持膜，并尽可能使用新鲜制备的样品。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

网格样品在加州大学戴维斯分校生物电镜中心设施中进行筛选。感谢郭飞博士在筛选工作中的协助。本工作由美国国立卫生研究院下属国家过敏与传染病研究所资助，资助编号为 R35GM137929（JAL）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）Avanti Research860320
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（POPE）Avanti Research850757
1,3-双(sn-3’-磷酸基)-sn-甘油（心磷脂，来源于牛心组织）Avanti Research840012
2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸 — HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）Sigma-AldrichM12545
3,3′-二氨基联苯胺 — DABBSigma-AldrichD4293
羰基氰化物间氯苯腙 — CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
氯仿Sigma-Aldrich650948
辅酶Q10Sigma-AldrichC9538
来源于马心的细胞色素cSigma-AldrichC2506
皂苷Sigma-Aldrich300410
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸 — EGTASigma-AldrichE3889
乙二胺四乙酸 — EDTASigma-AldrichE6758
甘油Sigma-AldrichG7893
糖基二氢薯蓣皂苷AnatraceGDN101去垢剂
新戊二醇月桂基麦芽糖苷 — LMNGSigma-AldrichNG310
氯化镁Sigma-AldrichM8266
粘噻唑Sigma-AldrichT5580
NADH，二钠盐Sigma-Aldrich481913
氯化硝基四氮唑蓝Sigma-AldrichN6876
吡啶霉素ASigma-Aldrich96861
乙酸钾Sigma-AldrichP5708
氯化钾Sigma-AldrichP3911
铁氰化钾Sigma-Aldrich702587
磷酸二氢钾 — KH2PO4Sigma-AldrichP0662
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002
水合胆酸钠Sigma-AldrichC1254
氯化钠Sigma-AldrichS9888
连二亚硫酸钠Sigma-Aldrich71699
蔗糖Sigma-AldrichS9378
TRISSigma-AldrichT1503
ACMA（9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶）Sigma-AldrichSML4162
设备与试剂盒
Amicon® Ultra 离心滤过装置，100 kDa MWCO，0.5 mLMilliporeUFC5100
Amicon® Ultra 离心滤过装置，100 kDa MWCO，15 mLMilliporeUFC9100
Beckman Optima TLX 超速离心机Beckman Coulter
BN-PAGE 凝胶蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶
Beckman Optima XE 超速离心机Beckman Coulter
辉光放电清洗系统辉光放电清洗系统
配备Gatan K3探测器的Glacios 2 冷冻透射电镜Thermo Fisher Scientific透射电子显微镜
KIMBLE Dounce 组织研磨器套装Sigma-AldrichD9188
Leica 自动GP2 捕获仪Leica
Microfuge 16Beckman CoulterA46474
NGC Discover 10 层析系统Bio-Rad7880009
Oxygraph+氧电极系统
PD-10 脱盐柱Cytiva28918007尺寸排阻离心柱
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Fisher Scientific23225双辛可宁酸蛋白检测试剂盒
Q-125 超声破碎仪Q-sonicaQ125-110
Sephadex G-25 M 柱预装G-25树脂脱盐离心柱
SpectraMax M2 微孔板读板仪Molecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GLCytiva29091596交联琼脂糖凝胶过滤介质
TLA-100.3 固定角转子套装Beckman Coulter349490
Type 50.2 Ti 固定角转子Beckman Coulter337901
Milli-Q (MQ) 水超纯水
Malvern Zetasizer ZS 动态光散射（DLS）Malvern Paranytical
Hansatech Oxygraph+ 系统Hansatech Instruments
PELCO easiGlow 辉光放电清洗系统TED PELLA, INC
Vitrobot Mark IV 系统Thermo Fisher Scientific冷冻制样仪
Quantifoil R 1.2/1.3 300目铜网格，覆2 nm碳膜TED PELLA, INC668-300-Cu-100带孔碳膜涂层
Avanti 微型挤出器Avanti Lipids610000

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