本研究提出了一种整合的可视化工作流程，该流程结合了标准化的支气管肺泡灌洗液采集与处理、七色流式细胞术检测面板、13种分析物的多重细胞因子检测以及统一的数据分析流程。
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本文内容
摘要
摘要
支气管肺泡灌洗液（BALF）是研究下呼吸道炎症最直接可获取的样本基质，然而传统的分析方法依赖于单标记流式细胞术结合逐项进行的酶联免疫吸附测定（ELISA），这种方法限制了信息密度，并掩盖了细胞与因子之间的关联。本研究提出了一种整合式可视化工作流程，该流程结合标准化的样本采集与预处理，采用七标记中性粒细胞和单核细胞流式细胞术检测 panel、十三项细胞因子多重检测，以及基于均匀流形近似与投影（UMAP）、FlowSOM 元聚类、层次聚类、Spearman 相关性网络和主成分分析（PCA）的统一分析流程。
该工作流程应用于一项单中心前瞻性队列研究，共纳入112名接受支气管镜检查的成年患者，其中包括64名经微生物学确诊的肺部感染患者和48名非感染对照者。细胞学和流式细胞术检测结果显示，感染期间肺泡免疫谱从以巨噬细胞为主显著转变为以中性粒细胞为主，中性粒细胞比例从中位数3.2%上升至68.4%，绝对中性粒细胞浓度增加约50倍。多重因子分析揭示出协调的三模块细胞因子反应，趋化因子、促炎因子和调节因子模块均上调，其中CXCL8/IL-8、IL-1β、IL-6、CXCL1/GRO-α和G-CSF在研究队列中表现出最强的单标志物鉴别能力（曲线下面积[AUC]为0.89至0.94）。通过主成分分析（PCA）、相关性矩阵和网络图进行整合可视化，发现个体水平上中性粒细胞与趋化因子之间存在紧密耦合的轴线关系，支气管肺泡灌洗液（BALF）中性粒细胞计数成为网络的核心枢纽。
该工作流程仅使用临床指征支气管肺泡灌洗（BAL）中常规获取的材料，无需额外样本量，为解析呼吸道感染中的气道炎症提供了一个信息密集的分析框架，可在配备多参数流式细胞仪和多重微球阵列平台的三级医疗机构实验室中实施，并可拓展至纵向研究、单细胞分析及治疗效果评估研究。各分析物作为生物标志物的更广泛临床应用，需在独立的多中心队列中进行前瞻性验证。
引言
尽管在疫苗策略和治疗手段方面已取得进展，但下呼吸道感染导致的传染性死亡仍是全球死亡的重要原因，尤其在儿童和老年人群中尤为显著1。中性粒细胞是呼吸系统受累部位先天免疫反应早期阶段的主要细胞，这一过程对清除入侵病原体至关重要；然而，失控的中性粒细胞炎症会导致肺泡毛细血管屏障破坏、组织氧化损伤，并引发急性呼吸窘迫综合征（ARDS）2,3。肺泡腔内的中性粒细胞还表现出与其它组织不同的募集动力学、滞留模式和效应功能，这些差异影响着感染是得以清除还是进展为重症肺炎4。
支气管肺泡灌洗液（BALF）是了解肺泡微环境的重要信息来源，能够最接近地反映该部位的临床免疫状态5。趋化因子CXCL8通过其受体CXCR1和CXCR2，与其他趋化因子（包括CXCL1、CXCL2和CXCL5）共同在招募中性粒细胞至肺部过程中发挥关键作用6。细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α进一步增强这一过程，而IL-10则作为拮抗性细胞因子发挥作用。这些因子在BALF中的水平已被证明与细菌性、病毒性及非典型性肺炎所致肺部感染的严重程度以及肺部并发症的发展密切相关7，目前多联检测BALF生物标志物谱正被用于下呼吸道感染的早期诊断及病原体鉴别8。
常规的支气管肺泡灌洗液（BALF）检测通常无法全面涵盖检测背后的生物学机制。细胞计数可通过人工对细胞离心涂片样本中的细胞进行分类计数来估算，而可溶性介质则通过单独的酶联免疫吸附试验（ELISA）进行测定，并以柱状图形式展示。趋化因子、细胞因子及各类细胞通常被独立评估，未能在特定趋化因子浓度梯度与其影响的细胞群体之间建立相关性。在缺乏多变量分析的情况下，细胞因子模块组合、趋化因子-中性粒细胞的剂量-反应关系以及具有各自炎症特征的患者亚群往往被忽视9。
计算技术的进步使得这种整体性方法正逐步成为现实。将多参数流式细胞术和光谱流式细胞术与降维方法（如t分布随机邻域嵌入（t-SNE）或统一流形逼近与投影（UMAP））相结合，可将高维免疫表型映射到二维空间，其中UMAP在应用于流式细胞术数据时表现出更优的全局拓扑结构保留能力和可重复性10。通过多指标细胞因子检测面板，再结合层次聚类和相关性网络分析，有助于识别出单细胞因子方法无法察觉的与疾病严重程度相关的特征谱型11。尽管该领域已取得进展，但目前尚无研究流程能将这些方法整合，用于在同一份呼吸道感染患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）样本中同步研究中性粒细胞募集和细胞因子特征。本研究描述了一种整合式可视化工作流程：首先利用细胞学和多参数流式细胞术分析中性粒细胞的募集情况，随后通过多重免疫分析检测细胞因子特征，并结合UMAP、层次聚类、相关性矩阵以及主成分分析进行综合解析。该工作流程生成一种整合式可视化图谱，将气道中的细胞和可溶性免疫指标整合于单一张图中，所用样本为下呼吸道感染患者临床指征行支气管镜检查时常规获取的BALF样本。
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方案
研究人群与伦理
本研究是一项单中心前瞻性观察性研究，于2026年1月至2026年4月在一家三级教学医院开展。研究方案获得批准号2026HL-038的伦理批准，所有参与者在进行任何研究操作前均签署了书面知情同意书。
连续招募年龄在18至75岁之间、因常规临床诊疗需要接受诊断性可弯曲支气管镜检查并行支气管肺泡灌洗（BAL）的成年患者，并根据其最终的临床和微生物学诊断结果将其分配至感染组或非感染对照组。从患者招募到整合可视化结果输出的完整可视化工作流程概览如图1所示。
图 1：基于支气管肺泡灌洗液（BALF）分析中性粒细胞招募及炎症性细胞因子反应的整合可视化工作流程概览。 五个阶段从左至右依次为：通过支气管镜检查和支气管肺泡灌洗（BAL）对感染组与对照组进行前瞻性招募、将BALF预处理为细胞沉淀和上清液组分、并行开展细胞学分析（Wright–Giemsa染色细胞学和多参数流式细胞术）与可溶性因子分析（13重磁珠法免疫测定）、统一的可视化分析流程（包括UMAP结合FlowSOM元聚类、分层热图、主成分分析和Spearman相关性网络），以及最终的整合可视化结果。缩写：BAL = 支气管肺泡灌洗；BALF = 支气管肺泡灌洗液；UMAP = 均匀流形近似与投影。 请点击此处查看该图的放大版本。
感染组的纳入标准如下：（1）根据美国感染病学会（IDSA）和美国胸科学会（ATS）指南，被诊断为社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎（HAP）或呼吸机相关性肺炎（VAP）的患者；（2）通过支气管肺泡灌洗液（BALF）培养检测到≥104 菌落形成单位（CFU）/mL 的一种或多种病原体，或通过呼吸道多重聚合酶链反应（PCR）、BALF 的宏基因组高通量测序，或配对呼吸道/血清标本的特异性抗原/抗体检测确认病原体。
对照组纳入标准如下：（1）行支气管镜检查的原因为非感染性因素，包括评估肺部不确定结节、影像学检查结果异常但不提示感染，或慢性咳嗽的检查；（2）支气管镜检查时微生物学检测结果为阴性，且无任何炎症或全身感染迹象，证实无急性肺部感染；（3）参与研究前30天内未使用抗生素。对照组受试者来自因其他临床指征需行支气管镜检查的患者，而非健康志愿者，以反映该研究中心常规获取临床指征支气管肺泡灌洗液（BAL）的患者群体。
排除标准包括：（1）过去六个月内患有恶性肿瘤和/或接受过细胞毒性化疗；（2）HIV 血清阳性；（3）接受过实体器官或造血干细胞移植；（4）持续使用免疫抑制治疗，每日相当于泼尼松剂量 > 0.3 mg/kg，持续超过 3 周；（5）妊娠或哺乳期女性；（6）有出血性疾病史或存在柔性支气管镜检查的任何禁忌证；（7）已存在的严重慢性呼吸系统疾病（慢性阻塞性肺疾病 [COPD] 慢性阻塞性肺疾病全球倡议 [GOLD] III/IV 期、特发性肺纤维化、重度持续性哮喘或具有临床意义的支气管扩张）；（8）活动性结核病；（9）在过去 30 天内参与过其他干预性研究。支气管肺泡灌洗（BAL）在首次支气管镜检查期间进行，对于感染患者，应在入院后 72 小时内完成；对于接受机械通气的感染患者，应在插管后 48 小时内完成。
样本量计算主要针对主要的细胞学结局指标：各组支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞的数量。根据预计感染与非感染气道之间的效应量为0.6个标准差，并考虑15%的脱落率，在双侧α=0.05、统计效能为80%的条件下，每组至少需要45名受试者。在156名符合条件的候选者中，27人未满足入组标准（其中18人主要因在规定时间内无法确定致病病原体或不接受研究操作程序而未能满足纳入标准；9人因违反排除标准，主要包括存在活动性恶性肿瘤、曾接受化疗、长期使用皮质类固醇、严重的基础慢性肺部疾病或出血倾向）。剩余129名参与者接受了支气管镜检查。随后，17名受试者被退出研究（7人因BALF回收量不足<40%；4人因住院期间撤回知情同意；6人因最终微生物学评估后重新分类——其中4名对照组候选者根据培养结果诊断为隐匿性感染，2名感染组候选者经培养分析后缺乏感染证据）。最终纳入分析的研究对象共112人：其中64人为感染组，48人为非感染组。
支气管肺泡灌洗液的采集与预处理
支气管镜检查由经验丰富的操作人员按照标准的机构方案进行，符合已发表的支气管肺泡灌洗技术建议12。局部使用利多卡因，患者接受中度静脉镇静，同时给予辅助氧气以维持血氧饱和度（SpO₂）>92%。将可弯曲支气管镜插入并定位至存在放射学异常的支气管肺段。当放射学异常呈弥漫性或无法定位时，选择右中叶或左舌段。每次灌注后，采用轻柔的手动负压吸引，负压<100 mmHg。共进行3至5次灌注，每次灌注37°C的无菌生理盐水20–40 mL，总体积为100–150 mL。回收率定义为回收液体积与灌注液体积的比值，仅回收率≥40%的样本纳入分析。
将第二次及后续冲洗收集的样本合并，以减少支气管污染，获得富含肺泡的样本。支气管肺泡灌洗液（BALF）合并样本置于冰上保存，并在采集后2小时内完成处理，以考虑近期研究发现的人体BALF样本在长时间储存和升温后细胞组成及分类计数发生变化的影响13。使用孔径为70微米的无菌尼龙滤网过滤样本以去除黏液，该过程仅通过机械过筛完成，未添加黏液溶解剂或抗聚集剂（如二硫苏糖醇），因为预实验表明此方法足以去除黏液团块，且不会显著影响下游表面表位的完整性。随后，样本在4 °C条件下以400 × g离心10分钟。弃去上清液，并将上清液分装至低蛋白结合冻存管中用于细胞因子分析；细胞沉淀则重悬于含0.5%牛血清白蛋白和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，部分细胞用于细胞学和流式细胞术分析。细胞因子样本在液氮中速冻后于–80 °C保存，使用前经历不超过一次冻融循环。
中性粒细胞细胞学及流式细胞术定量分析
在细胞病理学方面，取100 µL支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞悬液，使用细胞离心涂片机（见材料表）以300 ×g离心5分钟，涂片后自然干燥，并用瑞氏-吉姆萨染色。由不知晓患者临床背景的血液学技术人员进行分类计数，每张涂片至少计数400个细胞，计算巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的百分比。鉴于现有证据表明中性粒细胞百分比有助于鉴别肺部浸润患者中感染性与非感染性肺部疾病，因此将BALF中性粒细胞百分比作为细胞病理学的主要结局指标14。
流式细胞术定量分析方案基于近期对四色支气管肺泡灌洗液（BALF）白细胞分化方案的验证15，并额外添加了用于鉴定中性粒细胞的标记物。具体而言，从 BALF 中分离出约 5 × 105 个细胞，先在 4 °C 下用抗人 Fc 受体阻断试剂（见材料表）封闭 10 分钟，随后在 4 °C 下与针对 CD45（克隆 HI30）、CD66b（克隆 G10F5）、CD15（克隆 HI98）、CD16（克隆 3G8）、CD11b（克隆 ICRF44）、CD14（克隆 M5E2）和 HLA-DR（克隆 L243）的抗体以及一种可固定活力染料（见材料表）共同孵育染色 20 分钟。红细胞裂解使用商用红细胞裂解液（见材料表），室温处理 10 分钟。红细胞裂解后，细胞用含 2% 胎牛血清的 PBS 洗涤两次，并重悬于流式缓冲液中，随后使用多色流式细胞仪进行分析（见材料表）。补偿通过单染补偿微球（见材料表）进行校正，每个抗体组合均设置荧光减一（fluorescence-minus-one）和未染色对照管。
每个样本至少采集 1 × 105 个 CD45⁺ 事件。首先在 FSC-A/FSC-H 图中圈选单细胞群，随后圈选活细胞（活力染料阴性）CD45⁺ 白细胞，再排除 CD14⁺HLA-DR⁺ 单核-巨噬细胞，以筛选出侧向散射光较强的 CD66b⁺ 粒细胞。中性粒细胞则在粒细胞群体中定义为 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 事件。该主要 CD66b⁺ 粒细胞门控范围较宽，围绕所有高侧向散射光事件绘制，而非局限于 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 边界，以确保 CD16 低表达、CD11b 高表达的活化中性粒细胞及其他较不成熟的粒细胞亚型仍被纳入总自动化中性粒细胞计数中；而更严格的 CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 定义仅用于表征下游聚类分析中单独报告的成熟中性粒细胞亚群。支气管肺泡灌洗液（BALF）中的中性粒细胞计数（细胞/µL）根据中性粒细胞百分比及使用自动化血液分析仪测定的总有核细胞计数进行估算（见材料表）。补偿矩阵、设门策略及各样本的质量控制报告均已存档，分析人员在整个采集和分析过程中对受试者分组保持盲态。
多重炎症细胞因子分析
BALF 上清液在湿冰上解冻一次，随后短暂涡旋振荡，并在 10,000 × g 5 分钟 4 °C 在检测前立即进行。使用定制磁珠面板的多重磁珠免疫分析平台，实现了对三个功能类别中13种分析物的检测（见 材料表）。促炎因子组包括 IL-1β、IL-6、IL-17A 和 TNF-α；趋化因子组包括 CXCL8/IL-8、CXCL1/GRO-α、CXCL10/IP-10、CCL2/MCP-1 和 CCL3/MIP-1α；调节因子组包括 IL-10、IFN-γ、IL-1RA 和 G-CSF。所选检测分析物基于肺炎或重症呼吸道感染研究中支气管肺泡灌洗液（BALF）或血清细胞因子多重分析中最常报道的具有信息价值的指标7,11稀释倍数（在检测缓冲液中为1:2）是根据对具有代表性的感染样本和对照样本子集进行的预实验确定的，以确保 >90% 的测量值落在标准曲线范围内。
标准曲线采用制造商提供的重组标准品进行七点连续稀释，每块板上设复孔，并设一个空白孔用于扣除背景。曲线拟合通过仪器专用的采集与分析软件（见材料表）采用五参数逻辑（5PL）回归法进行。定量下限（LLOQ）定义为能够获得80%至120%回算回收率且板内变异系数（CV）≤ 20%的最低标准品浓度。低于LLOQ的数值以LLOQ/√2替代。每块板上均加入两份混合的支气管肺泡灌洗液（BALF）质控样本，分别来自一名代表性感染患者和一名未受影响的受试者，用于监测长期检测性能。质量保证标准基于一项持续12年、多中心、基于多重微球的检测能力验证项目所形成的最佳实践建议16，包括：复孔间的板内CV ≤ 10%，质控样本的板间CV ≤ 20%，以及每个分析物每孔的最低微球计数≥ 50。未达到上述标准的板需重新检测。所有分析在四周内使用同一批号试剂盒完成，感染样本与对照样本随机穿插排列进行检测。
可视化分析流程
首先使用商业流式细胞术软件（见材料表）分析流式细胞术标准（FCS）文件，以进行补偿并圈选活的CD45⁺单细胞群体，随后导出数据用于R语言v4.4中的无偏分析。对每个样本，下采样10,000个CD45⁺事件并进行合并，信号强度使用arcsinh函数转换，系数为150。使用uwot包进行降维和UMAP投影分析，设置15个最近邻和0.1的最小距离，并同时使用Rtsne包进行并行t-SNE嵌入分析，困惑度设为3010。采用FlowSOM方法识别表型簇，设置100个自组织图节点，并通过基于优化的元聚类方法进一步划分为12–15个簇，该方法近期已在高维流式细胞术数据中得到验证17。每个簇根据其谱系和活化标志物的中位表达水平进行注释，并与手动设门结果进行比对审核。
对于多重细胞因子数据的分析，首先对原始值进行以10为底的对数转换（log₁₀），然后通过z分数标准化对不同分析物进行归一化，再进行后续分析。对分析物和患者均采用欧氏距离及Ward.D2连接法进行层次聚类；结果以行和列均聚类的热图形式展示。该方法用于识别共表达的细胞因子模块，并对多重炎症队列中的患者亚群进行分类9。所有细胞和可溶性生物标志物之间的相关性矩阵通过成对Spearman秩相关计算生成。相关性矩阵的热图与网络图并列展示，其中节点代表生物标志物，边表示经过多重检验校正（Benjamini–Hochberg法，BH法）后仍显著的相关性。边的宽度根据相关系数绝对值 |ρ| 进行缩放，仅当 |ρ| ≥ 0.30 且校正后 p < 0.05 时才保留边。主成分分析（PCA）在包含细胞和细胞因子的标准化矩阵上进行，使用 prcomp() 函数并采用单位方差缩放。将受试者投影至前两个主成分上，并叠加感染组与对照组。所有分析中一致的下采样和标准化处理确保了在所有可视化结果中细胞与可溶性生物标志物读数之间的可比性。
统计学分析
对于连续变量，若根据Shapiro–Wilk检验呈非正态分布，则以中位数（四分位间距，IQR）描述；否则以均值（标准差，SD）描述。分类变量以频数和构成比进行描述。组间比较时，连续变量若呈非正态分布，采用Mann–Whitney U 检验；若呈正态分布，采用Welch t检验；分类变量则根据情况采用卡方检验或Fisher精确检验。连续变量之间的关联性通过Spearman秩相关系数进行评估。为控制多重细胞因子分析和相关性分析中的假阳性发现率（FDR），采用Benjamini–Hochberg方法对p值进行校正，校正后q值 < 0.05视为具有统计学意义。所有主要分析中，双侧p < 0.05被认为具有统计学显著性。在可能的情况下，保留个别变量存在缺失数据的病例，并针对该变量采用完整病例分析；同时使用链式方程多重插补法（m = 20）进行敏感性分析。使用R语言中的pROC包在全部研究队列中为单个细胞因子生成受试者工作特征曲线及相应的曲线下面积（AUC）；未使用独立的外部验证队列。预先设定的敏感性分析在排除支气管镜检查前72小时内接受过抗生素治疗的受试者后，重复主要的组间比较；此外还根据感染组的机械通气状态以及肺炎亚型（社区获得性、医院获得性或呼吸机相关性）进行分层分析。统计分析使用R v4.4中的rstatix、FlowSOM、uwot、ComplexHeatmap、igraph、pROC和mice软件包完成。图表使用商业科学绘图软件生成（见材料表）。
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结果
研究人群与样本特征
最终分析队列共纳入112名受试者，其中感染组64名，非感染对照组48名。两组基线人口学特征相似，而与感染相关的实验室参数在感染组中较高，如表1所示。感染主要由革兰阴性菌引起，主要致病菌为Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa和Acinetobacter baumannii。其他病原体包括Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、非典型病原体、病毒以及混合感染。
所有保留样本的支气管肺泡灌洗液（BALF）回收率均达到预设的 ≥40% 阈值，感染组的回收率略低于对照组（中位数分别为 48.3% 与 53.3%，p = 0.03），这与感染气道中更明显的气道炎症和黏膜充血一致。由于两组间回收体积也存在差异（58 mL 与 64 mL，
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讨论
本方案的稳健性取决于分析前及分析过程中的一些关键决策。将回收率的下限设定为40%，并将第二份及后续等分试样合并，是出于有意考虑：第一份等分试样富含支气管气道物质，而回收率会系统性地随年龄、性别、吸烟史以及目标支气管的不同而变化18。阻断Fc受体，并对针对各个克隆的抗体进行滴定，以确保成熟的CD15⁺CD16⁺CD11b⁺中性粒细胞与CD14⁺HLA-DR⁺肺泡巨噬细胞（BALF样本中占主导地位的细胞，具有最高的非特异性染色和自发荧光背景）之间的设门边界准确，这对于维持两组之间的一致性至关重要19,20。多重分析中冻融次数的限制以及2小时的时间窗口也并非随意设定。人类BALF的研究数据显示，即使在4 °C保存，中性粒细胞比例在6至24小时内也会显著下降，而巨噬细胞和淋巴细胞比例则保持稳定13。t-SNE和UMAP算法的参数，以及FlowSOM 100节点网格和12–15个元簇（metaclusters）的参数，均在分析各组之前预...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢所有参与本研究的患者和志愿者，感谢他们宝贵的合作。我们诚挚感谢伦理委员会在整个研究过程中给予的伦理批准（批准号：2026HL-038）以及规范性指导。
感谢呼吸科、支气管镜中心和临床检验科医务人员在临床标本采集、支气管肺泡灌洗液处理及微生物检测方面提供的支持。同时感谢医院中心实验室在高维流式细胞术和多重细胞因子谱分析实验中提供的技术平台支持。
本研究未从公共、商业或非营利机构的资助方获得任何专项资助。
感谢所有参与本项目的科研人员、技术人员和护理人员在患者筛选、样本管理、实验操作和数据整理方面所付出的努力。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗人 CD11b 抗体，Brilliant Violet 421，克隆号 ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | 中性粒细胞活化标志物；紫色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 CD14 抗体，APC/Cyanine7，克隆号 M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | 单核-巨噬细胞排除标志物；红色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 CD15 抗体，PE，克隆号 HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | 中性粒细胞谱系标志物；蓝色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 CD16 抗体，Brilliant Violet 510，克隆号 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | 中性粒细胞成熟及 NK 细胞标志物；紫色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 CD45 抗体，PerCP，克隆号 HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | 泛白细胞标志物；蓝色激光通道 URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| 抗人 CD66b 抗体，FITC，克隆号 G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | 粒细胞标志物；蓝色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 HLA-DR 抗体，PerCP/Cyanine5.5，克隆号 L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | 抗原呈递细胞标志物；蓝色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 全自动血液分析仪（Sysmex XN-1000） | Sysmex Corporation | 仪器（型号 XN-1000） | 用于测定有核细胞总数以计算绝对中性粒细胞计数 URL: https://www.sysmex.com |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | 用于流式细胞术染色缓冲液（PBS 中含 0.5% w/v 和 2 mM EDTA） URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap 软件包（R/Bioconductor） | Bioconductor Project | v2.20（开源） | 用于多重细胞因子数据的层次聚类热图分析 URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| 细胞离心涂片机（Cytospin 4） | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | 用于制备支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞悬液的细胞学涂片 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| 红细胞裂解液（BD FACS 裂解液，10 倍浓缩液） | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | 用于表面染色后红细胞的裂解 URL: https://www.bdbiosciences.com |
| 乙二胺四乙酸（EDTA），0.5 M，pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | 流式细胞术染色缓冲液中使用浓度为 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| 可固定活力染料（Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒） | BioLegend | Cat. No. 423105 | 门控前排除死细胞；红色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 可弯曲视频支气管镜 | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | 仪器（型号 BF-1TQ290） | 用于中度镇静下进行支气管肺泡灌洗（BAL） URL: https://www.olympus-global.com |
| 多色流式细胞仪（CytoFLEX LX） | Beckman Coulter Life Sciences | 仪器（型号 CytoFLEX LX，六激光配置） | 用于七色标记中性粒细胞/单核细胞流式检测面板的数据采集 URL: https://www.beckman.com |
| 流式细胞术分析软件（FlowJo） | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | 用于 FCS 文件的补偿调节和手动设门 URL: https://www.flowjo.com |
| FlowSOM 软件包（R/Bioconductor） | Bioconductor Project | v2.12（开源） | 用于流式细胞术数据的自组织图聚类和元聚类分析 URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism（统计绘图软件） | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | 用于生成最终图表 URL: https://www.graphpad.com |
| 人 Fc 受体阻断试剂（Human TruStain FcX） | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | 抗体染色前进行 Fc 受体封闭 URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph 软件包（R） | CRAN | v2.0（开源） | 用于构建和可视化相关性网络图 URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| 低蛋白吸附冷冻管，2.0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | 用于支气管肺泡灌洗液（BALF）上清液分装以进行细胞因子分析 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Luminex 多重磁珠免疫分析平台（MAGPIX） | Luminex Corporation (DiaSorin) | 仪器（型号 MAGPIX） | 用于多重细胞因子检测的数据采集 URL: https://www.luminexcorp.com |
| May-Grünwald-Giemsa 染色液 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | 用于细胞离心涂片的差异细胞计数 URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| mice 软件包（R） | CRAN | v3.16（开源） | 用于敏感性分析中的链式方程多重插补法 URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| 多重磁珠细胞因子/趋化因子检测试剂盒（13 重，定制；MILLIPLEX MAP 人细胞因子/趋化因子） | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | 定制面板，检测第 2.4 节所述的 13 种分析物 URL: https://www.merckmillipore.com |
| 尼龙网细胞筛，70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | 用于支气管肺泡灌洗液（BALF）的机械过滤，以去除黏液团块 URL: https://www.corning.com |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | 细胞重悬和染色的基础缓冲液 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| pROC 软件包（R） | CRAN | v1.18（开源） | 用于生成 ROC 曲线和 AUC 值 URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R（统计计算环境） | R Core Team | v4.4（开源） | 统计分析和可视化的平台 URL: https://www.r-project.org |
| rstatix 软件包（R） | CRAN | v0.7（开源） | 用于组间比较和相关性统计分析 URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne 软件包（R） | CRAN | v0.17（开源） | 用于 t-SNE 降维嵌入分析 URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| 单染补偿微珠（UltraComp eBeads 补偿微珠） | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | 用于单色补偿对照 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| 注射用氯化钠溶液，0.9%（无菌生理盐水） | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | 用于支气管肺泡灌洗（BAL）灌注（100–150 mL，分次 20–40 mL，37 °C） URL: https://www.baxter.com |
| uwot 软件包（R） | CRAN | v0.2（开源） | 用于 UMAP 降维分析 URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT（多重检测数据采集与曲线拟合软件） | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | 仪器专用软件，用于五参数逻辑（5PL）标准曲线拟合 URL: https://www.luminexcorp.com |
参考文献
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