本研究提出了一种整合的可视化工作流程，该流程结合了标准化的支气管肺泡灌洗液采集与处理、七色流式细胞术检测面板、13种分析物的多重细胞因子检测以及统一的数据分析流程。
本文内容
摘要
摘要
支气管肺泡灌洗液（BALF）是研究下呼吸道炎症最直接可获取的样本基质，然而传统的分析方法依赖于单标记流式细胞术结合逐项进行的酶联免疫吸附测定（ELISA），这种方法限制了信息密度，并掩盖了细胞与因子之间的关联。本研究提出了一种整合式可视化工作流程，该流程结合标准化的样本采集与预处理，采用七标记中性粒细胞和单核细胞流式细胞术检测 panel、十三项细胞因子多重检测，以及基于均匀流形近似与投影（UMAP）、FlowSOM 元聚类、层次聚类、Spearman 相关性网络和主成分分析（PCA）的统一分析流程。
该工作流程应用于一项单中心前瞻性队列研究，共纳入112名接受支气管镜检查的成年患者，其中包括64名经微生物学确诊的肺部感染患者和48名非感染对照者。细胞学和流式细胞术检测结果显示，感染期间肺泡免疫谱从以巨噬细胞为主显著转变为以中性粒细胞为主，中性粒细胞比例从中位数3.2%上升至68.4%，绝对中性粒细胞浓度增加约50倍。多重因子分析揭示出协调的三模块细胞因子反应，趋化因子、促炎因子和调节因子模块均上调，其中CXCL8/IL-8、IL-1β、IL-6、CXCL1/GRO-α和G-CSF在研究队列中表现出最强的单标志物鉴别能力（曲线下面积[AUC]为0.89至0.94）。通过主成分分析（PCA）、相关性矩阵和网络图进行整合可视化，发现个体水平上中性粒细胞与趋化因子之间存在紧密耦合的轴线关系，支气管肺泡灌洗液（BALF）中性粒细胞计数成为网络的核心枢纽。
该工作流程仅使用临床指征支气管肺泡灌洗（BAL）中常规获取的材料，无需额外样本量，为解析呼吸道感染中的气道炎症提供了一个信息密集的分析框架，可在配备多参数流式细胞仪和多重微球阵列平台的三级医疗机构实验室中实施，并可拓展至纵向研究、单细胞分析及治疗效果评估研究。各分析物作为生物标志物的更广泛临床应用，需在独立的多中心队列中进行前瞻性验证。
引言
尽管在疫苗策略和治疗手段方面已取得进展，但下呼吸道感染导致的传染性死亡仍是全球死亡的重要原因，尤其在儿童和老年人群中尤为显著1。中性粒细胞是呼吸系统受累部位先天免疫反应早期阶段的主要细胞，这一过程对清除入侵病原体至关重要；然而，失控的中性粒细胞炎症会导致肺泡毛细血管屏障破坏、组织氧化损伤，并引发急性呼吸窘迫综合征（ARDS）2,3。肺泡腔内的中性粒细胞还表现出与其它组织不同的募集动力学、滞留模式和效应功能，这些差异影响着感染是得以清除还是进展为重症肺炎4。
支气管肺泡灌洗液（BALF）是了解肺泡微环境的重要信息来源，能够最接近地反映该部位的临床免疫状态5。趋化因子CXCL8通过其受体CXCR1和CXCR2，与其他趋化因子（包括CXCL1、CXCL2和CXCL5）共同在招募中性粒细胞至肺部过程中发挥关键作用6。细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α进一步增强这一过程，而IL-10则作为拮抗性细胞因子发挥作用。这些因子在BALF中的水平已被证明与细菌性、病毒性及非典型性肺炎所致肺部感染的严重程度以及肺部并发症的发展密切相关7，目前多联检测BALF生物标志物谱正被用于下呼吸道感染的早期诊断及病原体鉴别8。
常规的支气管肺泡灌洗液（BALF）检测通常无法全面涵盖检测背后的生物学机制。细胞计数可通过人工对细胞离心涂片样本中的细胞进行分类计数来估算，而可溶性介质则通过单独的酶联免疫吸附试验（ELISA）进行测定，并以柱状图形式展示。趋化因子、细胞因子及各类细胞通常被独立评估，未能在特定趋化因子浓度梯度与其影响的细胞群体之间建立相关性。在缺乏多变量分析的情况下，细胞因子模块组合、趋化因子-中性粒细胞的剂量-反应关系以及具有各自炎症特征的患者亚群往往被忽视9。
计算技术的进步使得这种整体性方法正逐步成为现实。将多参数流式细胞术和光谱流式细胞术与降维方法（如t分布随机邻域嵌入（t-SNE）或统一流形逼近与投影（UMAP））相结合，可将高维免疫表型映射到二维空间，其中UMAP在应用于流式细胞术数据时表现出更优的全局拓扑结构保留能力和可重复性10。通过多指标细胞因子检测面板，再结合层次聚类和相关性网络分析，有助于识别出单细胞因子方法无法察觉的与疾病严重程度相关的特征谱型11。尽管该领域已取得进展，但目前尚无研究流程能将这些方法整合，用于在同一份呼吸道感染患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）样本中同步研究中性粒细胞募集和细胞因子特征。本研究描述了一种整合式可视化工作流程：首先利用细胞学和多参数流式细胞术分析中性粒细胞的募集情况，随后通过多重免疫分析检测细胞因子特征，并结合UMAP、层次聚类、相关性矩阵以及主成分分析进行综合解析。该工作流程生成一种整合式可视化图谱，将气道中的细胞和可溶性免疫指标整合于单一张图中，所用样本为下呼吸道感染患者临床指征行支气管镜检查时常规获取的BALF样本。
方案
研究人群与伦理
这是一项于2026年1月至2026年4月期间在中国台湾一家三级教学医院开展的单中心前瞻性观察性研究。研究方案获得批准号为2026HL-038的伦理批准，所有参与者在进行任何研究操作前均签署了书面知情同意书。
连续招募因常规临床诊疗需要接受诊断性可弯曲支气管镜检查并行支气管肺泡灌洗（BAL）的18至75岁成年患者，并根据其最终的临床和微生物学诊断结果将其分配至感染组或非感染对照组。从患者招募到整合可视化结果输出的集成可视化工作流程概览如图1所示。
图1：基于支气管肺泡灌洗液（BALF）分析中性粒细胞募集和炎症细胞因子反应的整合可视化工作流程概览。 从左至右，五个阶段依次概括了感染组与对照组的前瞻性招募及支气管镜肺泡灌洗（BAL）操作、BALF预处理为细胞沉淀物和上清液组分、并行的细胞学检测（Wright–Giemsa染色细胞学与多参数流式细胞术）和可溶性因子检测（13重磁珠免疫分析）、统一的可视化分析流程（包括UMAP结合FlowSOM元聚类、层次聚类热图、主成分分析和Spearman相关性网络图）以及最终的整合可视化结果。缩写：BAL = 支气管肺泡灌洗；BALF = 支气管肺泡灌洗液；UMAP = 均匀流形近似与投影。 请点击此处查看本图的放大版本。
感染组纳入标准如下：（1）根据美国感染病学会（IDSA）和美国胸科学会（ATS）指南，诊断为社区获得性肺炎（CAP）、医院获得性肺炎（HAP）或呼吸机相关性肺炎（VAP）的患者；（2）通过支气管肺泡灌洗液（BALF）培养检测到一种或多种病原体，浓度≥104 菌落形成单位（CFU）/mL，或通过呼吸道多重聚合酶链反应（PCR）、支气管肺泡灌洗液宏基因组高通量测序，或配对呼吸道/血清标本的特异性抗原/抗体检测确认病原体。
对照组纳入标准如下：（1）行支气管镜检查的原因为非感染性因素，包括评估肺部不确定结节、影像学检查结果异常但不提示感染，或慢性咳嗽的病因排查；（2）支气管镜检查时微生物学检测结果为阴性，且无任何炎症或全身性感染的临床表现，证实无急性肺部感染；（3）参与研究前30天内未使用抗生素。对照组受试者来自因其他临床指征需行支气管镜检查的患者，而非健康志愿者，以反映该研究中心常规获取临床指征支气管肺泡灌洗液（BAL）的人群特征。
排除标准包括：（1）近六个月内患有恶性肿瘤和/或接受过细胞毒性化疗；（2）HIV 血清阳性；（3）接受过实体器官或造血干细胞移植；（4）持续使用免疫抑制治疗，每日泼尼松等效剂量 > 0.3 mg/kg，持续超过 3 周；（5）妊娠或哺乳期女性；（6）有出血性疾病史或存在支气管镜检查的禁忌证；（7）已存在的严重慢性呼吸系统疾病（慢性阻塞性肺疾病［COPD］慢性阻塞性肺疾病全球倡议［GOLD］III/IV 期、特发性肺纤维化、重度持续性哮喘或具有临床意义的支气管扩张）；（8）活动性结核病；（9）在过去 30 天内参与过其他干预性研究。支气管肺泡灌洗（BAL）在首次支气管镜检查期间进行，对于感染患者，应在入院后 72 小时内完成；对于因感染接受机械通气的患者，应在插管后 48 小时内完成。
样本量计算主要针对主要的细胞学结局指标：各组支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞的数量。根据预计感染与非感染气道之间的效应量为0.6个标准差，并考虑15%的脱落率，在双侧α=0.05、统计效能为80%的条件下，每组至少需要45名受试者。在156名符合条件的候选者中，27人未满足入组标准（其中18人主要因在规定时间内无法确定致病病原体或不愿接受研究操作而未满足纳入标准；9人因存在活动性恶性肿瘤或曾接受化疗、长期使用皮质类固醇、严重的基础慢性肺病或出血倾向等排除标准而被排除）。剩余129名参与者接受了支气管镜检查。随后，17名受试者被退出研究（7人因BALF回收量不足<40%；4人因住院期间撤回知情同意；6人因微生物学最终评估后重新分类——其中4名对照组候选者根据培养结果被诊断为隐匿性感染，2名感染组候选者经培养分析后缺乏感染证据）。最终研究队列共包括112名参与者：64名为感染组，48名为非感染组。
支气管肺泡灌洗液的采集与预处理
支气管镜检查由经验丰富的操作人员根据本机构的标准操作规程进行，该规程符合已发表的支气管肺泡灌洗技术建议12。局部使用利多卡因，患者接受中度静脉镇静，同时提供辅助氧气以维持血氧饱和度（SpO₂）>92%。将可弯曲支气管镜插入并定位至存在影像学异常的支气管肺段。当影像学异常呈弥漫性或无法定位时，则选择右中叶或左舌段。每次灌注后，采用轻柔的手动负压吸引，负压<100 mmHg。共进行3至5次灌注，每次使用37°C的无菌生理盐水20–40 mL，总灌注体积为100–150 mL。回收率定义为回收液体积与灌注液体积的比值，仅回收率≥40%的样本纳入分析。
将第二次及后续冲洗收集的样本合并，以减少支气管污染，获得富含肺泡的样本。支气管肺泡灌洗液（BALF）合并样本置于冰上保存，并在采集后2小时内完成处理，以考虑近期研究发现的人体BALF样本在长时间储存和升温后细胞组成及分类计数发生变化的影响13。使用孔径为70微米的无菌尼龙滤网过滤样本以去除黏液，该过程仅通过机械过筛完成，未添加黏液溶解剂或抗聚集剂（如二硫苏糖醇），因为预实验表明此方法足以去除黏液团块，且不会显著影响下游表面表位的完整性。随后，将滤液在4 °C条件下以400 × g离心10分钟。弃去上清液，并将上清液分装至低蛋白吸附冻存管中用于细胞因子分析；细胞沉淀则重悬于含0.5%牛血清白蛋白和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，部分细胞用于细胞学和流式细胞术分析。细胞因子样本在液氮中速冻后，保存于–80 °C，使用前经历的冻融循环不超过一次。
中性粒细胞细胞学及流式细胞术定量分析
在细胞病理学方面，取100 µL支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞悬液，使用细胞离心涂片机（见材料表）以300 ×g离心5分钟，涂片后自然风干，并用瑞氏-吉姆萨染色法染色。由不了解患者临床背景的血液学技术员进行分类计数，每张涂片至少计数400个细胞，并计算巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的百分比。鉴于现有证据表明，BALF中性粒细胞百分比在鉴别肺部浸润患者的感染性与非感染性肺部疾病方面具有重要价值，因此将其作为细胞病理学的主要结局指标14。
流式细胞术定量分析方案基于近期对四色支气管肺泡灌洗液（BALF）白细胞分化方案的验证15，并额外添加了用于鉴定中性粒细胞的标记物。具体而言，从 BALF 中分离出约 5 × 105 个细胞，先在 4 °C 下用抗人 Fc 受体阻断试剂（见材料表）封闭 10 分钟，随后在 4 °C 下与针对 CD45（克隆 HI30）、CD66b（克隆 G10F5）、CD15（克隆 HI98）、CD16（克隆 3G8）、CD11b（克隆 ICRF44）、CD14（克隆 M5E2）和 HLA-DR（克隆 L243）的抗体以及一种可固定活力染料（见材料表）共同孵育染色 20 分钟。红细胞裂解使用商用红细胞裂解液（见材料表），室温处理 10 分钟。红细胞裂解后，细胞用含 2% 胎牛血清的 PBS 洗涤两次，并重悬于流式缓冲液中，随后使用多色流式细胞仪进行分析（见材料表）。补偿通过单染补偿微球（见材料表）完成，每个抗体组合均设置荧光减一（fluorescence-minus-one）对照管和未染色对照管。
至少 1 × 105 CD45⁺ 对每个样本采集事件。首先在FSC-A/FSC-H图中圈选单细胞群体，随后根据活细胞（活力染料）进行门控。⁻CD45⁺ 白细胞，随后排除 CD14⁺HLA-DR⁺ 单核-巨噬细胞通过高侧向散射光筛选CD66b⁺ 粒细胞。随后在粒细胞群体中将中性粒细胞定义为CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 事件。该初级 CD66b⁺ 粒细胞门控范围广泛地圈选所有高侧向散射事件，而非局限于CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 边界，使得CD16-dim、CD11b-high活化中性粒细胞及其他较不成熟的粒细胞形态仍包含在全自动中性粒细胞计数中；而更严格的CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ 定义仅用于表征在后续聚类分析中单独报告的成熟中性粒细胞亚群。支气管肺泡灌洗液（BALF）中的中性粒细胞计数（细胞/µL) 根据使用全自动血液分析仪测定的中性粒细胞百分比和有核细胞总数进行估算（见 材料表补偿矩阵、设门策略及各样本的质量控制报告均被存档，分析人员在整个数据采集和分析过程中对受试者的分组信息保持盲态。
多重炎症细胞因子分析
支气管肺泡灌洗液上清在湿冰上解冻一次，随后短暂涡旋混匀，并于10,000 × g离心澄清 × g 5 分钟 4 °C 在检测前立即进行。使用定制的磁珠面板多重 bead-based 免疫分析平台，测量了三个功能类别中的 13 种分析物（参见 材料表）。促炎因子组包括 IL-1β，IL-6，IL-17A 和 TNF-α；趋化因子组包括CXCL8/IL-8、CXCL1/GRO-α，CXCL10/IP-10、CCL2/MCP-1 和 CCL3/MIP-1α；调节性细胞因子组包括 IL-10、IFN-γ，IL-1RA 和 G-CSF。分析物的选择依据是在肺炎/重度呼吸道感染研究中，支气管肺泡灌洗液（BALF）或血清细胞因子多重分析中最常被报道具有信息价值的指标。7,11稀释倍数（在检测缓冲液中为1:2）是根据对具有代表性的感染样本和对照样本子集进行的预实验确定的，以确保 >90% 的测量值落在标准曲线范围内。
标准曲线通过在每块板上设置厂家提供的重组标准品的七点连续稀释浓度（每个浓度设复孔），并包含一个空白孔用于扣除背景信号。曲线拟合采用仪器配套的专有采集与分析软件进行五参数逻辑回归（5PL）分析（见材料表）。定量下限（LLOQ）定义为能够产生80%至120%回算回收率且批内变异系数（CV）≤20%的最低标准品浓度。低于LLOQ的数值以LLOQ/√2替代。每块板均加入两个混合的支气管肺泡灌洗液（BALF）质控样本（分别来自一名典型感染患者和一名未受感染的对照个体），分装后用于监测长期检测性能。质量保证标准基于一项持续12年、多中心、基于多重微球的检测能力验证项目的最佳实践建议16，包括：复孔检测的批内CV ≤10%，质控样本的板间CV ≤20%，以及每个分析物每孔最低微球计数不少于50个。未达到上述标准的板需重新检测。所有分析在四周内使用同一批号试剂盒完成，并将感染样本与对照样本随机交错排布进行检测。
可视化分析流程
首先使用商业流式细胞术软件（参见材料表）对流式细胞术标准（FCS）文件进行分析，以校正补偿并圈选活的CD45⁺单细胞群体，随后导出数据用于在R v4.4中进行无偏分析。对每个样本，随机下采样10,000个CD45⁺事件并合并，信号强度使用arcsinh函数进行转换，辅因子设为150。采用uwot软件包进行降维和UMAP投影分析，设定最近邻数为15，最小距离为0.1；同时使用Rtsne软件包进行并行t-SNE嵌入分析，困惑度设为3010。使用FlowSOM对表型聚类进行识别，设定100个自组织映射节点，并通过基于优化的元聚类方法进一步划分为12–15个聚类，该方法近期已在高维流式细胞术数据中得到验证17。每个聚类根据其谱系和活化标志物的中位表达水平进行注释，并与人工设门结果进行比对复核。
在分析多重细胞因子数据时，首先对原始数值进行 log₁₀ 转换，然后通过 z 分数法对不同分析物进行标准化，再进行后续分析。对分析物和患者均采用欧氏距离和 Ward.D2 连接法进行层次聚类；结果以行和列聚类的热图形式展示。该方法用于检测共表达的细胞因子模块，并对多重炎症队列中的患者亚群进行分类9。使用成对 Spearman 秩相关分析，生成所有细胞和可溶性生物标志物的相关性矩阵。相关性矩阵的热图与网络图并列呈现，其中节点代表生物标志物，边表示经过 Benjamini–Hochberg (BH) 方法多重检验校正后仍显著的相关性。边的宽度根据相关系数绝对值 |ρ| 进行缩放，仅当 |ρ| ≥ 0.30 且校正后 p < 0.05 时才保留边。对包含细胞和细胞因子的标准化矩阵，使用 prcomp() 函数并结合单位方差缩放进行主成分分析（PCA）。将受试者投影到前两个主成分上，并叠加感染组与对照组。所有分析均采用一致的下采样和标准化处理，确保在所有可视化结果中细胞和可溶性生物标志物读数之间的可比性。
统计分析
连续变量若经Shapiro–Wilk检验不符合正态分布，则以中位数（四分位间距，IQR）描述，否则以均值（标准差，SD）描述。分类变量以频数和构成比描述。组间比较采用Mann–Whitney检验。 U 当连续变量呈非正态分布时，采用Welch检验 t当连续变量呈正态分布时采用检验，对于分类变量则根据情况采用卡方检验或Fisher精确检验。连续变量间的关联性通过Spearman等级相关系数进行评估。为控制多重细胞因子分析及相关性分析中的假阳性发现率（FDR），采用Benjamini–Hochberg方法对p值进行校正，并设定q值截断值为 < 0.05。双侧 p < 在所有主要分析中，P 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性。在可能的情况下，保留个别变量数据缺失的病例，并对受影响变量采用完整病例分析；同时使用链式方程多重插补法（m = 20）进行敏感性分析。使用 R 中的 pROC 软件包，在完整研究队列中绘制各细胞因子的受试者工作特征曲线，并计算曲线下面积（AUC）；未使用独立的外部验证队列。预先设定的敏感性分析在排除支气管镜检查前 72 小时内接受过抗生素治疗的参与者后，重复进行主要组间比较；此外，还根据感染组的机械通气状态以及肺炎亚型（社区获得性、医院获得性或呼吸机相关性）进行分层分析。分析使用 R v4.4 中的 rstatix、FlowSOM、uwot、ComplexHeatmap、igraph、pROC 和 mice 软件包完成。图表使用商业科学绘图软件生成（见 材料表).
结果
研究人群与样本特征
最终分析队列共纳入112名受试者，其中感染组64名，非感染对照组48名。两组基线人口学特征相似，而与感染相关的实验室参数在感染组中较高，如表1所示。感染主要由革兰阴性菌引起，主要致病菌为Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa和Acinetobacter baumannii。其他病原体包括Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、非典型病原体、病毒以及混合感染。
所有保留样本的支气管肺泡灌洗液（BALF）回收率均达到预设的 ≥40% 阈值，感染组的回收率略低于对照组（中位数分别为 48.3% 与 53.3%，p = 0.03），这与感染气道中更明显的气道炎症和黏膜充血一致。由于两组间回收体积也存在差异（58 mL 与 64 mL，p = 0.04），所有报告的细胞因子浓度可能受到组间稀释因子轻微差异的影响；一项预设的敏感性分析仅纳入回收率 ≥50% 的样本（感染组 n = 42，对照组 n = 34），结果重现了所有组间比较的方向和效应大小（效应量最大变化 < 8%），表明稀释偏差不太可能是观察到的差异的原因。样本采集至处理的时间在感染组为 65 分钟，对照组为 62 分钟，均在 2 小时时间窗内。样本水平的质量控制（QC）标准表明结果质量较高。所有 112/112 份样本（100%）均基于计数 ≥400 个细胞获得细胞学分类计数。流式细胞术检测在全部 112/112 份样本（100%）中均达到预设标准，即 ≥1 × 105 个 CD45⁺ 事件，活细胞中位存活率为 89.4%（IQR 85.6–92.8%）。所有多重细胞因子检测板在单次重测后均满足质量控制标准。针对全部 13 种分析物，板内变异系数（CV）为 4.7%（2.1–9.3%，均 <10%），质控混合样本的板间 CV 为 11.2%（6.8–18.4%，均 <20%），每种分析物每孔的中位微球数为 78 个（53–142，均 ≥50）。
| 变量 | 感染组 (n = 64) | 对照组 (n = 48) | p 值 |
| 年龄（岁），中位数 [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| 男性，n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BMI（kg/m2），中位数 [IQR] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| 吸烟史，n (%) | 0.52 | ||
| 从不吸烟 | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| 既往吸烟 | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| 当前吸烟 | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| 高血压，n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| 糖尿病，n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| 冠心病，n (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| 慢性肾脏病，n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| 支气管镜检查指征，n (%) | — | ||
| 社区获得性肺炎 | 35 (54.7) | — | |
| 医院获得性肺炎 | 19 (29.7) | — | |
| 呼吸机相关性肺炎 | 10 (15.6) | — | |
| 肺部不确定结节 | — | 23 (47.9) | |
| 持续性影像学异常 | — | 15 (31.3) | |
| 慢性咳嗽评估 | — | 10 (20.8) | |
| 致病病原体，n (%) | — | ||
| 革兰阴性菌 | 28 (43.8) | ||
| 革兰阳性菌 | 16 (25.0) | ||
| 非典型病原体 | 7 (10.9) | ||
| 呼吸道病毒 | 8 (12.5) | ||
| 混合感染 | 5 (7.8) | ||
| BAL 时机械通气，n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| BAL 前 72 小时内抗生素暴露，n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| 灌注体积（mL），中位数 [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| 回收体积（mL），中位数 [IQR] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| BALF 回收率（%），中位数 [IQR] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| 标本处理时间（分钟），中位数 [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| 外周血白细胞计数，× 10⁹/L，中位数 [IQR] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| 外周血中性粒细胞比例（%），中位数 [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| C-反应蛋白（mg/L），中位数 [IQR] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| 降钙素原（ng/mL），中位数 [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
表1：研究队列的人口统计学、临床及支气管肺泡灌洗液（BALF）处理特征。 对感染组64名参与者与非感染对照组48名参与者之间的人口统计学基线特征、合并症、支气管镜检查指征、致病病原体、操作参数及外周血实验室指标进行了比较。连续变量以中位数[四分位间距]表示，并采用Mann–Whitney U 检验进行比较；分类变量以n（%）表示，根据适用情况采用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。缩写：BAL = 支气管肺泡灌洗；BALF = 支气管肺泡灌洗液；BMI = 体重指数；IQR = 四分位间距；WBC = 白细胞计数。
支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞募集的可视化
在受感染的受试者中，观察到细胞比例明显从以巨噬细胞为主转变为以中性粒细胞为主，如图2所示。细胞离心涂片采用Wright–Giemsa染色法进行染色，染色结果清晰区分了两组样本：对照组以肺泡巨噬细胞为主，伴有部分淋巴细胞和少量中性粒细胞；而感染组则以中性粒细胞占主导，常见胞内细菌、核固缩及中毒性颗粒。通过至少计数400个细胞进行分类计数以验证差异，结果显示，中性粒细胞比例在对照组中的中位数为3.2%（IQR：1.8–5.6%），在感染组中上升至68.4%（IQR：49.2–82.5%）（p < 0.001）；而肺泡巨噬细胞比例则从对照组的88.2%（IQR：82.4–92.5%）下降至感染组的22.6%（IQR：12.3–38.5%）（p < 0.001）。两组间的淋巴细胞比例相近（7.4% [4.8–11.3%] vs 6.5% [3.4–11.2%]，p = 0.42）。
门控和降维分析验证并拓展了显微镜观察到的细胞表型。在排除碎片、双联体和死细胞后，感染组中CD45⁺CD66b⁺粒细胞占CD45⁺白细胞的比例中位数为65.8%（IQR：46.2–79.4%），显著高于对照组的4.1%（IQR：2.3–6.8%）（p < 0.001）。在粒细胞群体中，感染组中CD15⁺CD16⁺CD11b⁺成熟中性粒细胞占所有粒细胞的92.4%（IQR：87.5–95.8%），对照组为88.6%（IQR：82.3–93.5%），表明募集的中性粒细胞群体主要由成熟、完全分化的细胞构成，而非早期前体细胞。基于反双曲正弦变换后的表面蛋白矩阵所生成的UMAP和t-SNE投影显示出几乎一致的拓扑结构：感染样本在CD15⁺CD16⁺CD11b⁺成熟中性粒细胞区域形成一个显著的细胞岛，而对照样本中该区域细胞稀疏；相反，HLA-DR⁺CD14⁺肺泡巨噬细胞岛在对照样本中密集分布，而在感染样本中则稀疏。通过FlowSOM进行的元聚类分析鉴定出13个亚群，其中成熟中性粒细胞亚群（38.4% [22.6–56.2%] vs 2.8% [1.5–4.6%]，p < 0.001）和活化型CD16低表达CD11b高表达中性粒细胞簇（22.6% [11.4–32.5%] vs 0.4% [0.1–1.2%]，p < 0.001）在组间扩张最为显著。
就绝对中性粒细胞计数而言，感染组支气管肺泡灌洗液（BALF）中的中性粒细胞数量较对照组增加了约50倍。每单位有核细胞的总数 µL BALF 中的细胞数从 156 个/μL 上升至µL （对照组 IQR 88–232）至 384 个细胞/µL （感染组的IQR为180–712）（p < 0.001），中性粒细胞计数从 5 个细胞/µL （对照组 IQR 2–13）至 262 个细胞/µL （感染组的IQR为89–578）（p < 0.001）。在经过Benjamini–Hochberg（BH）校正后，各组间中性粒细胞百分比和绝对计数的成对差异仍具有高度显著性（q < 0.001).
图2：BALF中中性粒细胞募集的可视化。 来自健康对照者和感染者的代表性Wright–Giemsa染色细胞离心涂片图像，展示了肺泡灌洗液（BALF）细胞谱从以巨噬细胞为主转变为以中性粒细胞为主的特征。并列展示了四步流式细胞术设门策略（FSC单细胞 → 活CD45⁺白细胞 → 排除CD14⁺HLA-DR⁺后CD66b⁺粒细胞 → CD15⁺CD16⁺CD11b⁺成熟中性粒细胞）、经arcsinh转换的流式细胞术数据的UMAP降维图（叠加FlowSOM 13-元簇，按生物学注释着色），以及BALF中中性粒细胞百分比和绝对中性粒细胞浓度（细胞/µL，对数尺度）的箱线图，以便直接比较感染组与对照组中鉴定出的细胞表型。缩写：BALF = 支气管肺泡灌洗液；FSC = 前向散射；UMAP = 均匀流形近似与投影。请点击此处查看此图的放大版本。
支气管肺泡灌洗液炎症性细胞因子谱的可视化
多个细胞因子轴上协调反应的模式将感染组与对照组区分开来，这些细胞因子被划分为三个稳定的功能模块，如图3所示。对经log₁₀转换并归一化的细胞因子浓度使用Ward.D2方法进行聚类，得到清晰的双分支树状图，其中感染样本与对照样本分别位于树状图的两端，仅观察到七例错分个体（六例对照样本被归入感染组，主要为伴有轻度中性粒细胞性气道炎症的慢性咳嗽病例；一例感染样本被归入对照组，代表早期非典型性肺炎）。分析物的树状图定义了三个细胞因子簇。趋化因子簇包含CXCL8、CXCL1、CXCL10、CCL2和CCL3，在感染组与对照组之间表现出最大的倍数变化及最高的模块内相关性。促炎因子簇包含IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α，呈现相似方向的升高趋势，但幅度略低。调节性因子簇包括IL-10、IL-1RA、IFN-γ和G-CSF，在感染样本中也出现升高，表明该反应并非单纯的促炎反应，而是同时激活了反向调节和抗病毒通路。
所有检测分析物的中位数（四分位间距）在感染组中均高于对照组，经过基于Benjamini-Hochberg的假发现率（BH-FDR）校正后，13种分析物的校正后p值均小于0.001。在这些分析物中，CXCL8/IL-8的浓度最高，且变化倍数最大（从对照组的68 [32–142] pg/mL升高至感染组的2,485 [842–6,520] pg/mL，约升高36倍）。CXCL1/GRO-α也呈现类似趋势，浓度约升高21倍（78 [36–148] vs 1,672 [524–3,890] pg/mL）。IL-1β约升高13倍（5.8 [2.6–11.4] vs 78 [29–184] pg/mL）。IL-6、IL-1RA和G-CSF的升高倍数为13至16倍（分别为16.4 [7.8–30.5] vs 248 [82–612] pg/mL；112 [48–258] vs 1,748 [658–3,964] pg/mL；24 [10–52] vs 384 [125–912] pg/mL）。其他升高幅度较小的包括TNF-α（约8倍）、CXCL10/IP-10（约9倍）、CCL2/MCP-1（约8倍）、CCL3/MIP-1α（约10倍）、IL-10（约10倍）、IFN-γ（约6倍）和IL-17A（约4倍）。
队列内受试者工作特征分析确定IL-8（AUC 0.94）、IL-1β （AUC 0.92）、IL-6（AUC 0.91）、CXCL1（AUC 0.91）和 G-CSF（AUC 0.89）为在感染组与对照组之间具有最强单标志物区分能力的分析物；这些 AUC 值总结了分析队列内的区分能力，未进行独立的外部验证集验证。采用链式方程多重插补法（m = 20）进行的敏感性分析显示，各分析物的估计值与完全病例中位数的差异均在 5% 以内，且未改变效应量的排序。
预先设定的敏感性分析用于评估既往抗生素暴露和肺炎亚型对所观察到的细胞因子差异的影响。在排除支气管肺泡灌洗（BAL）前72小时内接受过抗生素治疗的41名感染组参与者（占感染组64.1%）后，重新进行主要组间比较，经BH-FDR校正后，剩余23例感染病例中的13种分析物浓度仍显著高于对照组（校正后） p < 0.001，其点估计值略高于而非低于整个队列的中位数（例如，CXCL8/IL-8 为 2,860 [980–7,110] pg/mL，IL-1）β 92 [34–210] pg/mL），与抗生素暴露对气道细胞因子的部分抑制作用一致。按肺炎亚型对感染组进行分层分析显示，在社区获得性肺炎（n = 35）、医院获得性肺炎（n = 19）和呼吸机相关性肺炎（n = 10）中，趋化因子和促炎细胞因子的水平排序相同；其中呼吸机相关性肺炎亚组的CXCL8、CXCL1、IL-6和G-CSF中位水平最高，且是否接受机械通气并未改变任何组间比较的方向。
图3：支气管肺泡灌洗液（BALF）炎症性细胞因子谱的可视化分析。 对全部112名受试者中13种检测分析物经log₁₀转换并进行z-score标准化后的浓度进行层次聚类热图展示，热图上方的彩色注释条表示分组情况（对照组、感染组）、肺炎亚型（社区获得性肺炎CAP、医院获得性肺炎HAP或呼吸机相关性肺炎VAP）以及病原体类别（革兰阴性菌、革兰阳性菌、非典型病原体、病毒或混合感染）。差异显著细胞因子（CXCL8/IL-8、IL-1β、IL-6、CXCL1/GRO-α、G-CSF和TNF-α；log₁₀尺度，单位为pg/mL）的箱形图用于比较感染组与对照组。*** 经Benjamini–Hochberg（BH）错误发现率校正后，p < 0.001。缩略语：BALF = 支气管肺泡灌洗液；BH = Benjamini–Hochberg；CAP = 社区获得性肺炎；HAP = 医院获得性肺炎；VAP = 呼吸机相关性肺炎。 请点击此处查看该图的高清版本。
中性粒细胞募集与细胞因子谱的联合可视化
将细胞组分与可溶性组分关联分析，揭示了中性粒细胞募集与趋化因子系统之间存在强烈的生物学联系，如图4所示。该二维图谱基于标准化后的细胞与细胞因子矩阵进行主成分分析（PCA）生成，其中主成分1（PC1）解释了总方差的51.1%，主成分2（PC2）进一步解释了12.7%，累计解释方差达63.8%。PC1将感染组与对照组区分开，其特征为支气管肺泡灌洗液（BALF）中性粒细胞、CXCL8、CXCL1、IL-6、IL-1β 和 G-CSF 具有较高的正向载荷，而巨噬细胞具有较高的负向载荷。PC2则区分出趋化因子富集轨迹（CXCL8 和 CXCL1 正向载荷较高）与调节因子富集轨迹（IL-10、IL-1RA 和 IFN-γ 正向载荷较高），因此在感染组内，受试者倾向于根据疾病严重程度分离，其中接受机械通气的呼吸机相关性肺炎病例主要分布于高趋化因子象限。
17 种细胞和可溶性性状之间的成对 Spearman 秩相关分析显示，支气管肺泡灌洗液（BALF）中性粒细胞计数与整体趋化因子轴呈强正相关（CXCL8 ρ = 0.78；CXCL1 ρ = 0.74；CCL3 ρ = 0.69；CCL2 ρ = 0.61；CXCL10 ρ = 0.54；所有经调整的 p < 0.001）。第二层级的显著相关性出现在中性粒细胞计数与促炎因子轴之间（G-CSF ρ = 0.65；IL-1β ρ = 0.62；IL-6 ρ = 0.58；TNF-α ρ = 0.51），随后是与调节性轴的中等程度正相关（IL-10 ρ = 0.45；IL-1RA ρ = 0.48）。巨噬细胞百分比则与趋化因子轴和促炎因子轴呈强度相似的镜像负相关。轴内相关性的强度明显高于轴间相关性（轴内中位 |ρ| = 0.68，轴间中位 |ρ| = 0.33），支持存在共同的上游调控通路调控趋化因子轴、促炎因子轴和调节性轴这一概念。
相关性网络将这种关联映射为一个图，其中支气管肺泡灌洗液（BALF）中性粒细胞是最核心的枢纽节点，其与所有13种细胞因子之间的连接均通过了多重检验的BH校正。在17个特征之间可能存在的136种两两连接中，共有99种满足联合标准：|ρ| ≥ 0.30 且经BH校正后的p < 0.05，因此被保留。相关性网络图呈现出清晰的三模块结构，与层次聚类所得的聚类结果一致：趋化因子模块与BALF中性粒细胞计数及百分比之间具有最密集且最强的连接；中等权重的连接将促炎模块与中性粒细胞及趋化因子模块同时连接；而调节模块则通过较细的连接桥接趋化因子模块与促炎模块。巨噬细胞百分比节点位于中性粒细胞–趋化因子模块的对侧，并通过一组负权重边与该模块相连。总体而言，主成分分析（PCA）、相关性矩阵以及网络图揭示了一种一致的模式：在个体参与者水平上，BALF中性粒细胞浸润与趋化因子反应密切相关，而促炎通路和调节通路则围绕这一中性粒细胞–趋化因子轴，形成明确但相互关联的模块。
图4：中性粒细胞募集与炎症性细胞因子谱的耦联可视化。 对标准化的细胞与细胞因子矩阵进行主成分分析双标图，参与者按组着色；Spearman 相关性热图；以及全部17项细胞与可溶性特征的网络图（节点大小按度数表示，边线粗细按 |ρ| 缩放，并以 BH 校正后 p < 0.05 且 |ρ| ≥ 0.30 为筛选条件），突出显示中性粒细胞–趋化因子核心网络。缩写：BH = Benjamini–Hochberg；PC = 主成分。请点击此处查看该图的放大版本。
数据可用性：
本研究中使用的去标识化参与者水平数据集和R分析代码作为补充表S1和补充文件1提供。其他支持本研究结果的数据可向通讯作者在合理请求下获取。
补充表 S1：BALF 数据集。请点击此处下载该文件。
补充文件 1：包含分析代码的 ZIP 文件。请点击此处下载该文件。
讨论
本方案的稳健性取决于分析前及分析过程中的一些关键决策。将回收率的下限设定为40%，并将第二份及后续等分试样合并，是出于有意考虑：第一份等分试样富含支气管气道物质，而回收率会系统性地随年龄、性别、吸烟史以及目标支气管的不同而变化18。阻断Fc受体，并对针对各个克隆的抗体进行滴定，以确保成熟的CD15⁺CD16⁺CD11b⁺中性粒细胞与CD14⁺HLA-DR⁺肺泡巨噬细胞（BALF样本中占主导地位的细胞，具有最高的非特异性染色和自发荧光背景）之间的设门边界准确，这对于维持两组之间的一致性至关重要19,20。多重分析中冻融次数的限制以及2小时的时间窗口也并非随意设定。人类BALF的研究数据显示，即使在4 °C保存，中性粒细胞比例在6至24小时内也会显著下降，而巨噬细胞和淋巴细胞比例则保持稳定13。t-SNE和UMAP算法的参数，以及FlowSOM 100节点网格和12–15个元簇（metaclusters）的参数，均在分析各组之前预先确定，以避免事后调整，这是已知导致流式细胞分析流程不可重复的原因之一16。操作人员信息和孔板/运行编号仍可按每个细胞事件保留，以便在未来的大规模分析中应用批次校正方法21。
存在几种常见的失败模式，通常无需修改实验方案即可解决。回收率低（<40%）通常是由于楔入位置不当或负压过大所致；可通过调整支气管镜位置，并在吸取下一份样本前将负压降低至<100 mmHg 来解决此问题。肺泡巨噬细胞产生的过强自发荧光是肺细胞流式细胞分析中的主要干扰因素，可通过在每批样本中设置未染色的肺细胞对照，并明确定义高侧向散射光巨噬细胞门，而不完全依赖活力染料来减轻该问题19。多重检测面板常因微球计数过低或出现异常高值而受到影响。在确定采用1:2稀释比例前，对部分感染组和对照组样本预先进行梯度稀释实验，可避免因BALF样本中已知的基质效应导致肺炎样本标准曲线高端的CXCL8、CXCL1和G-CSF信号饱和22。根据研究队列的具体情况，该方案还可进一步调整。当样本主要含单一病原体类型时，将核心检测面板缩减为仅包含趋化因子和促炎介质，仍可保持足够的统计学效能。若样本来自包含细菌、病毒和非典型病原体的混合人群，则同时检测调节性介质仍具价值，因为肺泡中性粒细胞和巨噬细胞中存在病原体特异性表达谱的结论已被证实23，且研究表明BALF中促炎与调节性细胞因子的组合可反映社区获得性肺炎的疾病严重程度24。
本工作流程的贡献并不在于单独观察呼吸道感染中嗜中性粒细胞的浸润或趋化因子与促炎性细胞因子的升高，这两者已有大量文献记载；而在于将七色标记的嗜中性粒细胞–单核细胞流式细胞术检测 panel 与十三项分析物的多重免疫分析相结合，并应用于同一份支气管肺泡灌洗液（BALF）样本的统一可视化分析流程。通过实施针对嗜中性粒细胞和单核细胞的七色标记 panel 及十三项分析物的多重免疫分析，能够捕捉细胞表型与细胞因子的复杂性；若无此整合，分析将需要多个独立实验，且所需 BALF 体积远超常规支气管镜检查样本所能提供的量。前者与先前研究结果一致，表明多色流式细胞术在 BALF 样本中进行细胞类型鉴定的可靠性与人工显微镜检查相当15；后者的接受标准则反映了公认的多中心多重微球免疫分析能力验证项目的最佳实践16。特别是，使用相同标准化输入数据构建的组合热图、网络图和主成分分析（PCA）能够揭示细胞类型与其相关因子之间的关系，而这些关系此前仅能通过累加多个独立柱状图进行推断。这一点至关重要，因为 BALF 中的趋化因子 CXCL8、CCL2 和 CCL3 协同作用，从共同的循环系统中募集嗜中性粒细胞和单核细胞，其联合模式所包含的信息无法从独立的单分析物检测结果中获得9,10。由于 BALF 已常规用于临床目的，且无需额外采集体积，因此该工作流程可作为现有支气管镜服务的转化型附加检测，而非独立的诊断程序。
在研究实验室条件下，整个工作流程的实际周转时间（包括样本运输、染色、流式细胞术检测、多重检测孵育与读数，以及下游计算分析流程）约为24小时。因此，该工作流程被定位为一种用于机制性特征分析和治疗反应监测的深度表型分析工具，而非用于时间紧迫的临床决策（如快速区分呼吸机相关性肺炎与非感染性急性呼吸窘迫综合征）的急性床旁分诊检测，后者仍以更快的微生物学检测和单标志物生物标志物检测作为标准诊疗手段。
需要指出的是，本研究存在若干局限性。支气管肺泡灌洗液（BALF）采集自气道腔隙，仅反映气道表面的直接相互作用，但不包含位于肺泡壁和肺泡隔内的细胞，而许多活化的巨噬细胞和组织驻留性淋巴细胞正定位于这些区域。因此，气道腔隙与肺实质的免疫状态之间并不存在一一对应关系，这与既往已发表的数据一致25。基于微球的多重检测方法易受抗体交叉反应性和基质效应的影响，尤其在富含黏蛋白和表面活性物质的BALF环境中，相较于血清更为显著；此外，上皮衬液被生理盐水稀释的过程无法通过任何内源性标记物（如尿素）进行校正，这一点与近期发表的批评意见一致26。感染组的平均回收灌洗液体积比对照组低6 mL，因此本文报告的绝对浓度受到组间稀释因子轻微差异的影响，且未使用任何内源性稀释标记物进行校正。在64名感染组参与者中，有41人（64.1%）曾接受过抗生素治疗，这可能减弱气道内细胞因子浓度及病原体的检出率。重要的是，该方案仅代表临床上指征性支气管镜检查期间某一时间点的瞬时状态，因而无法分析中性粒细胞募集、趋化因子分泌峰值及其在个体患者中消退的动力学过程。单个分析物的AUC值来源于用于生物标志物识别的同一队列，缺乏独立的验证队列，因此应将其解释为队列内部区分能力的指标，而非经过外部验证的诊断效能；在临床实践中采用任何单一标志物的截断值均需在独立的多中心队列中进行前瞻性验证。预先设定的敏感性分析，包括仅限高回收标本、未使用抗生素的参与者，并按机械通气状态及肺炎亚型（社区获得性、医院获得性或呼吸机相关性）进行分层，均未改变组间比较的方向。
未来，可通过在用于蛋白质和细胞定量的同一份支气管肺泡灌洗液（BALF）沉淀物中增加单细胞RNA测序或CITE-seq技术，以解决这些局限性。该方法已在大规模细菌性肺炎及儿童肺炎支原体肺炎队列研究中成功应用，能够揭示传统流式细胞术无法区分的肺泡中性粒细胞和巨噬细胞亚群27,28。将气道空间分析所得信息与匹配活检组织甚至尸检样本的成像质谱流式细胞术或空间转录组学所提供的数据相结合，可为这些发现提供空间和病理背景29。此外，将纵向BALF采样与CXCR1/CXCR2拮抗剂及IL-6受体阻断疗法的疗效评估相结合——这两种干预措施在重症肺炎和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中已显示出改善生存率或器官支持的益处——将有助于检验本工作流程所突出的中性粒细胞–趋化因子轴是否可作为指导治疗决策的生物标志物30,31。
综上所述，本研究描述了一种整合的可视化工作流程，包括标准化的支气管肺泡灌洗液（BALF）采集与制备步骤、用于定量中性粒细胞–单核细胞组成的七色流式细胞术检测 panel、可测量13种细胞因子的多重细胞因子检测方法，以及包含UMAP、层次聚类、相关性网络和主成分分析（PCA）的通用可视化平台。通过将该工作流程应用于112名因临床指征接受支气管镜检查的成年患者前瞻性队列，分析发现感染患者肺泡免疫细胞组成呈现出从巨噬细胞向中性粒细胞显著转变的现象，检测到一种三模块细胞因子应答模式，并揭示了一条通过单标记检测无法观察到的、中性粒细胞与趋化因子之间强耦合的轴线。该方法完全依赖于临床诊断过程中采集的样本，无需额外的样本体积，在具备多参数流式细胞术和多重微球阵列分析能力的三级医疗机构实验室中具有可行性。更广泛的应用以及将任一单独分析物作为诊断生物标志物使用，尚需在独立的多中心队列中进行前瞻性验证。因此，本研究提出了一种可重复且数据丰富的方法，可用于表征呼吸道感染中的气道炎症，并为进一步开展纵向研究、单细胞与空间分析，以及针对中性粒细胞–趋化因子轴的免疫调节治疗评估奠定了基础。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢所有参与本研究的患者和志愿者，感谢他们宝贵的合作。我们诚挚感谢伦理委员会在整个研究过程中给予的伦理批准（批准号：2026HL-038）以及规范性指导。
感谢呼吸科、支气管镜中心和临床检验科医务人员在临床标本采集、支气管肺泡灌洗液处理及微生物检测方面提供的支持。同时感谢医院中心实验室在高维流式细胞术和多重细胞因子谱分析实验中提供的技术平台支持。
本研究未从公共、商业或非营利机构的资助方获得任何专项资助。
感谢所有参与本项目的科研人员、技术人员和护理人员在患者筛选、样本管理、实验操作和数据整理方面所付出的努力。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗人 CD11b 抗体，Brilliant Violet 421，克隆号 ICRF44 | BioLegend | Cat. No. 301323 | 中性粒细胞活化标志物；紫色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 CD14 抗体，APC/Cyanine7，克隆号 M5E2 | BioLegend | Cat. No. 301820 | 单核-巨噬细胞排除标志物；红色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 CD15 抗体，PE，克隆号 HI98 | BioLegend | Cat. No. 301906 | 中性粒细胞谱系标志物；蓝色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 CD16 抗体，Brilliant Violet 510，克隆号 3G8 | BioLegend | Cat. No. 302048 | 中性粒细胞成熟及 NK 细胞标志物；紫色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 CD45 抗体，PerCP，克隆号 HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_893338 | 泛白细胞标志物；蓝色激光通道 URL: https://antibodyregistry.org/AB_893338 |
| 抗人 CD66b 抗体，FITC，克隆号 G10F5 | BioLegend | Cat. No. 305103 | 粒细胞标志物；蓝色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 抗人 HLA-DR 抗体，PerCP/Cyanine5.5，克隆号 L243 | BioLegend | Cat. No. 307629 | 抗原呈递细胞标志物；蓝色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 全自动血液分析仪（Sysmex XN-1000） | Sysmex Corporation | 仪器（型号 XN-1000） | 用于测定有核细胞总数以计算绝对中性粒细胞计数 URL: https://www.sysmex.com |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. A7906 | 用于流式细胞术染色缓冲液（PBS 中含 0.5% w/v 和 2 mM EDTA） URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap 软件包（R/Bioconductor） | Bioconductor Project | v2.20（开源） | 用于多重细胞因子数据的层次聚类热图分析 URL: https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| 细胞离心涂片机（Cytospin 4） | Thermo Fisher Scientific | Cat. No. A78300003 | 用于制备支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞悬液的细胞学涂片 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 |
| 红细胞裂解液（BD FACS 裂解液，10 倍浓缩液） | BD Biosciences | Cat. No. 349202 | 用于表面染色后红细胞的裂解 URL: https://www.bdbiosciences.com |
| 乙二胺四乙酸（EDTA），0.5 M，pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. AM9260G | 流式细胞术染色缓冲液中使用浓度为 2 mM URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| 可固定活力染料（Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒） | BioLegend | Cat. No. 423105 | 门控前排除死细胞；红色激光通道 URL: https://www.biolegend.com |
| 可弯曲视频支气管镜 | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | 仪器（型号 BF-1TQ290） | 用于中度镇静下进行支气管肺泡灌洗（BAL） URL: https://www.olympus-global.com |
| 多色流式细胞仪（CytoFLEX LX） | Beckman Coulter Life Sciences | 仪器（型号 CytoFLEX LX，六激光配置） | 用于七色标记中性粒细胞/单核细胞流式检测面板的数据采集 URL: https://www.beckman.com |
| 流式细胞术分析软件（FlowJo） | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | 用于 FCS 文件的补偿调节和手动设门 URL: https://www.flowjo.com |
| FlowSOM 软件包（R/Bioconductor） | Bioconductor Project | v2.12（开源） | 用于流式细胞术数据的自组织图聚类和元聚类分析 URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism（统计绘图软件） | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | 用于生成最终图表 URL: https://www.graphpad.com |
| 人 Fc 受体阻断试剂（Human TruStain FcX） | BioLegend | Cat. No. 422301 / RRID: AB_2818986 | 抗体染色前进行 Fc 受体封闭 URL: https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph 软件包（R） | CRAN | v2.0（开源） | 用于构建和可视化相关性网络图 URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| 低蛋白吸附冷冻管，2.0 mL | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. No. 375418 | 用于支气管肺泡灌洗液（BALF）上清液分装以进行细胞因子分析 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Luminex 多重磁珠免疫分析平台（MAGPIX） | Luminex Corporation (DiaSorin) | 仪器（型号 MAGPIX） | 用于多重细胞因子检测的数据采集 URL: https://www.luminexcorp.com |
| May-Grünwald-Giemsa 染色液 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS500 | 用于细胞离心涂片的差异细胞计数 URL: https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/gs500 |
| mice 软件包（R） | CRAN | v3.16（开源） | 用于敏感性分析中的链式方程多重插补法 URL: https://cran.r-project.org/package=mice |
| 多重磁珠细胞因子/趋化因子检测试剂盒（13 重，定制；MILLIPLEX MAP 人细胞因子/趋化因子） | Merck / MilliporeSigma | Cat. No. HCYTOMAG-60K | 定制面板，检测第 2.4 节所述的 13 种分析物 URL: https://www.merckmillipore.com |
| 尼龙网细胞筛，70 µm | Corning (Falcon) | Cat. No. 352350 | 用于支气管肺泡灌洗液（BALF）的机械过滤，以去除黏液团块 URL: https://www.corning.com |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. No. 10010023 | 细胞重悬和染色的基础缓冲液 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| pROC 软件包（R） | CRAN | v1.18（开源） | 用于生成 ROC 曲线和 AUC 值 URL: https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R（统计计算环境） | R Core Team | v4.4（开源） | 统计分析和可视化的平台 URL: https://www.r-project.org |
| rstatix 软件包（R） | CRAN | v0.7（开源） | 用于组间比较和相关性统计分析 URL: https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne 软件包（R） | CRAN | v0.17（开源） | 用于 t-SNE 降维嵌入分析 URL: https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| 单染补偿微珠（UltraComp eBeads 补偿微珠） | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. No. 01-2222-42 | 用于单色补偿对照 URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2222-42 |
| 注射用氯化钠溶液，0.9%（无菌生理盐水） | Baxter International | Cat. No. 2B1324 | 用于支气管肺泡灌洗（BAL）灌注（100–150 mL，分次 20–40 mL，37 °C） URL: https://www.baxter.com |
| uwot 软件包（R） | CRAN | v0.2（开源） | 用于 UMAP 降维分析 URL: https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT（多重检测数据采集与曲线拟合软件） | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | 仪器专用软件，用于五参数逻辑（5PL）标准曲线拟合 URL: https://www.luminexcorp.com |
参考文献
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