用于评估Langendorff灌注小鼠心脏心房与心室力学的光学系统

摘要

本方案描述了小鼠心脏的摘取与插管操作，以及朗格多夫逆向灌流系统的准备与配置。该实验装置结合了一套高分辨率光学系统，旨在保持心房和心室自然动态的同时，评估其机械反应。

摘要

小鼠心脏是心血管研究中广泛使用的模型，这得益于工程技术的进步。然而，由于小鼠心脏体积较小，对其心房和心室收缩力的评估仍然具有挑战性。本研究介绍了一种评估完整离体心脏收缩力和心率的新方法。通过结合兰格多夫灌流的小鼠心脏与高分辨率光学系统，能够实现对心房和心室收缩力的评估。该实验装置在获取高分辨率信号的同时，克服了心脏体积小和收缩频率快所带来的技术难题。在每分钟420至660次（bpm）的刺激频率与心脏收缩频率之间实现的同步，结果与等长-动力学方法一致。此外，通过测量心室缩短程度和心房动态信号，可确定房室收缩特性。该方法适用于在无药物或系统性干扰条件下评估完整离体心脏的收缩力和心率。实验结果表明，该光学系统能够准确测量心室和心房的缩短反应。

引言

心脏生理学领域仍有诸多未知有待探索；诸如心脏起搏和兴奋-收缩耦联等关键过程是持续研究的核心内容¹。尽管生物噪声对心肌收缩力²和起搏活动的影响仍不甚清楚¹，但新兴的光学成像方法已推动了新研究范式的建立^3,4。

利用朗根多夫（Langendorff）系统进行研究的两种实验方法在评估心脏功能方面做出了重要贡献。第一种是等容收缩法，通过将一个小气囊插入左心室以获取信号^5,6,7。第二种是辅助张力记录法，通过将一根线的一端缝合至心脏心尖，另一端连接至机械记录装置，沿心脏长轴测量辅助张力收缩^2,8。然而，由于小鼠心脏体积微小，评估其心房与心室收缩力仍具挑战性。此外，制备过程需格外轻柔操作，因为心脏易受损伤^{9,10,11,12,13}。

用于评估小鼠心脏机械动力学的光学系统具有多项新颖特性与优势。首先，该方法适用于在无药物或系统性影响的条件下，评估完整离体心脏的收缩功能和心率。此外，该方案还可有效应用于研究缺血-再灌注损伤的实验中，特别是在评估基于药物、细胞再生或氧疗的治疗方法时。

本文介绍了一种利用高分辨率光学系统记录小鼠心脏收缩功能生物物理参数的实验方案。该方法可用于评估完整离体心脏的收缩力和心率，同时能够分别评价心房和心室的收缩功能。兰格多夫（Langendorff）小鼠心脏制备技术经过优化，进行了轻微改进，可在不影响心肌收缩的前提下，减少灌注液温度流失和运动伪影。

方案

所有动物实验均按照联邦动物实验与护理法规进行，并已获得墨西哥高级科学研究和技术中心（CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico）动物护理委员会的批准。本研究使用8–14周龄、体重为28–34 g的C57BL/6J雄性小鼠。本方案中使用的所有材料和设备均列于材料表中。补充文件1–11提供了本方案的辅助示意图、软件操作指南、分析程序、起搏数据以及应用文件。

1. 储备液的配制

1. 提前配制两种储存液，并在 4 °C 冰箱中保存：(1) 储存液 I，1 L（溶于去离子水；g/L：76.13 NaCl，4.02 KCl，1 MgCl₂(6H₂O)，0.4 NaH₂PO₄)；(2) 储存液 II，0.1 L（溶于去离子水；g/L：73.5 CaCl₂(2H₂O)）。
   注意：溶液配制后最多可使用 30 天，需在 4 °C 下保存。

2. 兰根多夫系统连接与清洗

1. 按照图1A所示，连接储液罐（1）、储液罐恒温水浴（2）、灌注泵（3）、蛇形管（4）、蛇形管循环器（5）、监测系统（6）和引流系统（8）。
   注：监测系统与引流系统之间的连接在补充文件1中有更详细的展示。
2. 向Langendorff系统中加入1 L 50 °C的去离子水，然后启动灌注泵和引流泵（补充文件1，引流系统）。大约20–30分钟后，将系统中的液体排空，再进行下一步操作。
   注：请确认系统无泄漏或压力下降现象。若出现此类情况，则不得继续实验。
3. 向系统中加入1 L 1%乙酸溶液（溶于去离子水中），然后关闭灌注泵和引流泵，静置60分钟，之后重新开启泵以排出液体。
4. 重复步骤2.2两次。
5. 用70%乙醇（溶于去离子水中）填充系统，以防止溶液成分黏附。
   注：Langendorff灌注系统应每进行十次实验或每月清洗一次。实验前的清洗流程详见第4节，而实验后的清洗流程则在第8节中详细说明。

3. 实验过程中 Tyrode 溶液的配制

1. 配制 1 L 溶液（单位：mM）：130.25 NaCl，5.4 KCl，0.53 MgCl₂(6H₂O), 0.33 NaH₂PO₄，1.8 CaCl₂(2H₂O)，10 D-葡萄糖，10 HEPES，调节pH至7.35 ± 0.05，用 NaOH 调节。
   1. 将100 mL 储液I与700 mL去离子水在持续搅拌下混合，然后将溶液温度升至 37 °C；通过连接 O₂ 储液罐连接至气石，如图所示 图1A (1).
   2. 加入3.6 mL 储液II和96.4 mL去离子水，配制成1.8 mM CaCl₂(2H₂O)，然后加入 NaOH 将 pH 调至 7.35 ± 0.05.
   3. 用去离子水定容至 1 L，得到 Tyrode 溶液。
      注意：建议将 100 mL 溶液置于冰箱中保存 4 °C；此体积将在后续第6步中使用。

4. 兰根多夫系统准备

注意：如果在实验当天未用乙醇填充兰格多夫系统，则不建议继续进行操作；应重新执行 第2节

1. 启动灌注泵和引流泵。将灌注泵的流速设为 3 mL/min，引流泵设为 10 mL/min。排空系统。
2. 用 1 L 37 °C 的去离子水填充系统，然后排出水分。
3. 用 步骤 3 中配制的台氏液填充系统，并将溶液维持在生理温度和持续供氧状态。
4. 开启储液槽水浴和蛇形再循环装置。将储液槽温度（图 1A (2)）设定为 38 °C，以维持溶液处于生理条件。将蛇形管（图 1A (5)）温度设定为 40 °C，以补偿兰格多夫系统中溶液的温度损失。
   注意：若系统出口处台氏液的温度未达到生理范围（37 ± 0.5 °C），需调节蛇形再循环装置的温度。在温度稳定至合适值之前，不建议进行步骤 6。
5. 开启压力监测仪（补充文件 1，监测系统），并在 0–200 mmHg 范围内进行校准。可使用监测与起搏应用程序辅助系统校准（补充文件 3 和 补充文件 11）。
   注意：必须确认系统内无压力损失且无气泡。若系统中存在气泡，可暂时封闭蛇形管下端出口并打开上端阀门，使液柱充满，从而将气泡排出至外部。在确认该条件满足之前，不建议继续实验。

5. 光学系统¹⁴

1. 组装 CMOS 相机（图 1A，10）、可调相机镜头（LC）和照明系统。
   注意：照明系统由两个 LED（图 1A，9）、两个平凸照明透镜（LI）、一个照明控制器（图 1A，11）、一个采集卡（补充文件 1，监测系统）以及 3D 设计的支撑部件（补充文件 1）组成。
2. 将一个体积约为 1,000 mm³ 的参考物体放置在距离相机镜头 100–200 mm 的位置（位于 图 1A 中心）。
   注意：该物体必须置于 Langendorff 系统的心脏位置。此位置可在 图 1B 中观察到，具体位于光束照射区域的图像中心。
3. 启动相机采集软件，将相机设置为 4× 子采样模式（4 个像素 = 1 个子像素），并设置一个 200 × 200 子像素的感兴趣区域（ROI）（补充文件 2）。
   注意：在此配置下，可实现每秒 750 帧（fps）的时间分辨率。
4. 打开照明系统（补充文件 1），调节光束使其聚焦于参考物体，并实现均匀照明（图 1B）。
5. 调节参考物体上的光照强度，避免图像过曝。
   注意：图像应类似于 图 2A （或 图 1C ，控制器 PC）。物体（心脏）表面的反射应尽可能减少，同时不损失其轮廓的清晰度。可通过调节照明控制器的功率或降低相机设置中的曝光时间来实现。
6. 调节相机镜头焦距，以获得参考物体的清晰图像（图 1C，控制器 PC）。确保参考物体占据视场的 80%（图 2A），以获得约 61 µm/子像素的转换比例。
   注意：当相机设置为采集模式时，光学系统会自动激活照明系统（图 1A 和 补充文件 2）。建议将相机保持在待机模式，使照明系统保持关闭状态，仅在实验数据采集期间开启，以避免过热。

6. 手术与插管操作

1. 肝素化与麻醉
   1. 配制含有替来他明-唑拉西泮（40 mg/kg 小鼠体重）和赛拉嗪（10 mg/kg 小鼠体重）的麻醉混合液，用生理盐水稀释至 200 µL。
   2. 使用 27 G 针头将麻醉混合液腹腔注射，使小鼠进入深度麻醉状态。
      注意：通过刺激四肢或尾部确认反射消失（通常 10 分钟足够）。
   3. 使用 27 G 针头腹腔注射 200 UI 未分馏肝素，等待约 5 分钟后继续实验。
2. 器官取出与插管
   1. 将小鼠仰卧位固定，使用手术剪去除胸部区域的毛发和皮肤。
   2. 在膈肌下方做腹部切口，注意保持膈肌完整。
   3. 继续在膈肌处做横向切口，并迅速通过肋骨进行双侧向上胸廓切开术，随后移除肋骨壁。
      注意：操作时注意不要损伤心脏。若心脏在操作过程中受损或破裂，建议终止实验。
   4. 使用精细镊子平稳夹住心脏上部结构，包括主动脉弓及邻近血管，轻轻上提并在其下方向上剪开，将心脏和肺组织一同取出。
   5. 迅速将心脏转移至含有 50 mL 4 °C Tyrode 溶液的培养皿中进行初步清洗。
      注意：从切开膈肌开始，动物将出现呼吸困难；此后需在 60 秒内完成步骤 6.2.3–6.2.6。超过此时间限制可能导致缺血性损伤。
   6. 在体视显微镜下使用精细剪刀去除肺组织和多余脂肪组织，暴露主动脉弓。
      注意： 清理组织时应避免损伤主动脉弓。若在头臂干动脉下方切断主动脉，将导致插管困难，并可能引起压力泄漏。
   7. 将心脏转移至自制插管底座中，底座内含 50 mL 4 °C Tyrode 缓冲液，并将主动脉末端插入由 20 G 针头自制的插管中（补充文件 1）。
      注意：操作时注意不要损伤主动脉瓣。若瓣膜受损，心脏将发生肿胀，冠状循环无法有效灌流。
   8. 使用 4/0 丝线打两个插管结：第一个结位于插管尖端远端的凹陷处，第二个结位于头臂干动脉之前（补充文件 1）。
   9. 使用装有室温缓冲液的 1 mL 注射器缓慢注入 Tyrode 溶液，观察冠状组织是否变得透明，以确认插管成功。
   10. 去除脂肪组织，以便暴露心室和心房。
       注意：插管操作总时间应控制在 5 分钟以内，以维持心脏活性。
   11. 将心脏转移至 Langendorff 系统，并稳定 30 分钟。
       注意： 将心脏置于系统中央（图 1A,B），垂直悬挂。悬挂时需格外小心，防止产生气泡。若出现气泡，压力将超过 140 mmHg，心脏开始肿胀，失去活性。
       注意：当心脏表现出机械稳定性、自然振荡频率约为 360 次/分钟（BPM），且灌注压力维持在 60 至 110 mmHg 之间时，Langendorff 装置即视为建立成功。

7. 起搏方案与视频记录

1. 心脏活力
   1. 验证冠状动脉压力是否在60–110 mmHg范围内，使用3 mL/min的灌注泵。若冠状动脉灌注压低于60 mmHg，可略微提高灌注泵流速（压力过低会导致心脏变苍白且松弛无力）；反之，若压力超过110 mmHg，则应略微降低泵流速（压力过高将诱发组织水肿，并导致压力持续升高，最终引起心脏停搏）。
      注意：长时间将灌注压力维持在上述最佳范围之外，将不可逆地损害心脏活性。
   2. 将心脏置于正前方位置，使相机获得完全正面的视野。调整位置，确保相机中可见双侧心房。图 2A).
   3. 将铂电极轻轻放置在右心房起搏结节的表面。利用摄像头画面作为引导，将电极移入视野范围内。调整电极位置，确保其不遮挡右心房。在实时监控摄像头画面的同时，缓慢推进电极，直至其接触心房组织，注意避免施加过度压力（以免在图像中压扁右心房）。
      注意：若操作正确，摄像头视野将类似于 图 2A.
   4. 启动监测和起搏应用程序（补充文件 11）并打开采集卡（图1A (6））。设置刺激参数值：振幅为 2 V，频率为 420、540 和 720 脉冲/分钟（PPM），脉冲波形为占空比 7 ms 的方波（插图 图 2A).
   5. 从最低频率开始施加活力刺激，每次刺激持续20秒，刺激事件之间间隔20秒恢复期（静息时间）。
      注意：通过摄像头监测评估心脏活力。若器官具有生理功能，可观察到施加的刺激与心脏反应之间的同步性，并伴有心腔之间的正常协调收缩。相反，若心脏失去活力，则表现为心腔协调性的丧失，或仅出现孤立的心房收缩。
   6. 关闭培养箱门，因为该实验对室内光照和温度波动敏感（图1C).
      注意：实验过程中必须保持腔室门关闭。通过摄像头和灌注压力监测心脏活性。
2. 数据记录
   1. 应用起搏程序，该程序由持续30秒的方波脉冲序列组成，随后间隔30秒无信号期。设置每次起搏序列的刺激参数：幅度为2 V，脉冲宽度为7 ms，频率范围为360至720 PPM。
      注意：起搏程序从 360 PPM 开始，每个时间点增加 60 PPM（插图 图2A).
   2. 使用相机采集软件以 .avi 格式持续记录心脏正面观的动态视频补充文件 2）。对每次起搏序列进行20秒的视频录制。从起搏开始后5秒处起，记录持续20秒的片段。代表性原始记录见于 补充视频 1.
      注意：计算机同时记录所施加的起搏序列（.xls， 补充文件 9) 分别由监控与起搏应用程序以及相机采集软件生成的每个录制视频（.avi）补充文件 2 和 补充文件 3).
   3. 通过比较刺激方案开始前录制的第一段视频与应用方案后录制的第二段视频，验证心脏的存活性图2B).

8. 实验后朗根多夫灌流系统的清洁

1. 移除刺激电极和心电图铂电极。将心脏从系统中取出，并排干所有残留的台罗德溶液。
2. 关闭光学系统并关闭 O₂ 瓣膜
3. 用1 L去离子水冲洗系统 37 °C，并排空系统。
4. 重复步骤 2.4 和 2.5。
5. 关闭所有系统和设备。

9. 视频处理

1. 首先将每个视频导入计算机软件，并应用视频归一化功能¹⁵.
2. 选择包含心脏区域的兴趣区域（ROI）。进行图像分割以去除背景噪声、电极和插管补充文件 4).
   注意：为正确选择要移除的图像区域，请参考 补充文件 10。
3. 进行全局机械动力学分析（补充文件 5）。支持性的变异性和信号示例如下所示 补充图 S1, 补充图 S2，以及 补充图 S3.
   1. 对每一视频帧应用形态学算子以检测心脏周长，然后应用填充帧算法生成掩膜¹⁵.
   2. 统计每帧中分割区域内像素的数量，然后将该数值除以图像的总像素数进行归一化，以生成动态信号（插图位于 图2B 和 补充图 S3).
   3. 对获得的信号应用3至100 Hz的五阶双向巴特沃斯滤波器，以抑制高频噪声和灌注滴注伪影¹⁵.
   4. 使用记录的最大值和最小值对所有视频中的信号进行归一化处理。
   5. 通过计算每个动态信号和刺激信号中两个最大振幅值之间的时间间隔（IAA（s））来确定心率。
   6. 使用以下公式计算 BPM 频率：
      
   7. 从IAA数据生成庞加莱图，以展示短期和长期的变异性^16,17,18 (补充图 S1 和 补充图 S2).
      注意：如需更详细的信息，请参阅 补充文件 10。
4. 对心室机械动力学进行节段性分析补充文件 6).
   1. 应用图像二值化。使用形态学算子界定心室区域，并将其调整为椭圆几何形状，同时不损害感兴趣区域¹⁵.
   2. 将最小椭圆拟合到每帧中的心室区域。提取某一帧中一组远端点的坐标。沿Y轴在每一端使用10–20个点图 3A）。提供了代表性椭圆估计输出示例 补充视频 2.
   3. 根据每段视频中沿 Y 轴方向最远点之间的平均距离，计算心室缩短程度¹⁹.
   4. 对获得的信号应用3至100 Hz范围内的五阶双向巴特沃斯滤波器，以抑制高频噪声和灌注滴注伪影¹⁵.
   5. 将心室缩短信号相对于每个起搏条件下获取的所有视频进行归一化处理，并按照步骤9.3.5–9.3.6计算心率和延迟。
      注意：可获得以下参数，如心室周期持续时间（DVE）、舒张期持续时间（DVW）、室间间隔（IVV）以及心室振幅（VA）图3A).
      注意：如需更详细的信息，请参阅 补充文件 10。
5. 对心房的机械动力学进行节段性分析补充文件 7).
   1. 使用两个感兴趣区域（ROI）来界定心房（图3C).
   2. 分别分析每个心房。
      1. 使用形态学算子勾画心房轮廓，并在不损害感兴趣区域（ROI）的前提下对其进行调整¹⁵. 使用增强对比度算法以勾画每个心房^20,21.
      2. 应用图像二值化，并量化每帧中非零像素的数量，以获得心房动态信号。
      3. 对获得的信号应用3至100 Hz的五阶双向巴特沃斯滤波器，以抑制高频噪声和灌注滴注伪影¹⁵.
      4. 计算两个心房信号的平均值（图3D).
   3. 将心房缩短信号相对于每个起搏条件下获得的所有视频进行归一化处理，并按照步骤 9.3.5–9.3.6 计算心率和延迟。
      注意：可获得诸如心房周期时长（DAE）、心房-心房间期（IAT）以及心房振幅（AA）等参数（图3D）。有关更详细的信息，请参见补充文件10。
6. 进行机电分析^13,22 (补充文件 8).
   1. 将起搏数据与心房和心室信号进行比较（图3D).
   2. 计算心脏传导系统中的传导时间，获得心房与心室事件之间的延迟（AVD），以施加的刺激作为参考。

结果

心脏机械功能实验采用Langendorff装置进行，如图1A（顶部）所示。监测与光学系统可在光照控制触发时实现视频记录，如图1A（底部）所示。图1C展示了恒温控制柜的外部视图，该柜设计用于使心脏免受环境温度波动和光照干扰。如图1B所示，离体心脏被置于实验装置中作为参考物体，该装置包括Langendorff系统、光学系统和刺激系统。

如 图2A所示，将离体心脏放置于适当位置，以便在逆向灌流条件下获得心房和心室的清晰前位视野。使用引流底座（补充文件1，引流系统）对于减轻灌流液滴落引起的心脏运动伪影以及稳定采集信号至关重要。刺激方案包括脉冲序列（2 V，7 ms），频率范围为360至720次/分钟，每次持续30秒。

光学系统记录心脏区域（HA）的变化。该动态信号还可用于获取峰间时间间隔（IAA）（见图2B插图）。通过比较一组 n = 6 个心脏在刺激方案前（起始）和刺激后（结束）的平均心率，评估模型的可行性。平均心率无显著差异（起始：385 ± 38 BPM 对比 结束：372 ± 18 BPM，Student’s t-test P > 0.05），表明实验操作未影响心脏功能（图2B）。

图2C展示了心脏对七种不同刺激频率的频率响应，显示出明显的线性关系²（R2 = 0.98 ± 0.01，1:1模式）。最低起搏值受限于小鼠的生理特性（360次/分钟）^22,23。Langendorff灌注心脏表现出心动过速的特征。代表性起搏刺激及其相应反应如图2C插图所示。

随后，为了评估心腔的动力学特性，采用了特定的分割技术。心室缩短参数来自光学记录（图3A）。图3A的插图显示了归一化的心室缩短曲线。从该动力学信号中获得四个参数：心室缩短幅度（VA）、心室收缩间期（IVV）、心室收缩持续时间（DVE）和心室舒张持续时间（DVW）。

图3B 显示了七种起搏频率下的心室缩短幅度。蓝色柱代表本研究结果，橙色柱对应采用辅助张力记录方法获得的数据²。统计分析采用双因素方差分析，随后进行Sidak检验。在较高起搏频率（600 PPM和660 PPM）下，心室缩短幅度（VA）显著增加（P < 0.05*，P < 0.005**）。VA（参考值15与360 P比较，P > 0.05；参考值15与420 P比较，P > 0.05；参考值15与480 P比较，P > 0.05；参考值15与540 P比较，P > 0.05；参考值15与600 P比较，P < 0.005；参考值15与660 P比较，P < 0.05；参考值15与720 P比较，P > 0.05）。

为了获得心房面积，需采用特定的分割技术（图3C）。在每个心房中定义一个感兴趣区域（ROI）。图3D显示了心房平均信号和心室缩短情况。从该动态信号中可获得两个参数：心房振幅（AA）和心房收缩之间的时间间隔（IAT）。通过比较心室和心房信号，可得到心房与心室事件之间的延迟（AVD）。

图1．离体心脏Langendorff装置与安装在屏蔽柜中的光学系统的实验设置。（A）与光学系统耦合的恒流逆向Langendorff灌注系统的示意图。Langendorff系统（上部）包括：（1）盛有持续充氧Tyrode溶液的储液瓶；通过（2）恒温水浴槽和（5）蛇形再循环器将灌注液温度维持在37 °C；（3）蠕动灌注泵确保3 mL/min的恒定流速；（8）排水系统用于移除废液；（4）冷却线圈同时作为热交换器和气泡捕获装置；压力监测和电刺激起搏由（6）监测系统控制。光学系统（下部）包括（11）照明控制、（10）配备远心镜头的高速相机以及两个光源（LED）之间的同步。相机镜头支持100–200 mm范围的手动调焦。（9）两个LED通过平凸透镜（LI）实现对心脏的均匀照明。起搏数据通过监测与刺激应用程序记录（补充文件11）。（7）控制器PC连接至相机及监测与刺激应用程序，以同步记录数据（视频和电起搏信号）。（B）屏蔽柜内部视图。通过参照物显示心脏的垂直位置，并展示Langendorff装置的其他组件。（C）屏蔽柜外部视图。屏蔽柜具有热绝缘性，其内部和外部黑色壁面可最大限度减少反射和环境光干扰。图中还显示了运行监测与视频采集应用程序的计算机。缩写：LC = 远心镜头；LEDs = 发光二极管；LI = 照明透镜；PC = 个人计算机。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2．小鼠心脏安装及光学系统验证。（A）心脏前视图，显示心房、心室、起搏电极和心电图（ECG）电极。图像对应于以420 bpm起搏时的一个帧（补充视频1）。插图显示所施加的起搏。视频在刺激方案的第5至25秒期间采集。（B）心脏活性检测。记录两个视频以获取振荡频率，分别在施加起搏方案之前和之后。计算响应频率，并应用Student t检验（P > 0.05），组间差异无统计学意义。数据以均值±标准差表示（n = 6）。插图显示从方案步骤9.3获得的心脏面积（HA）及所施加的起搏。（C）心脏对所施加起搏的反应。蓝色柱表示心脏对七种起搏频率的反应（R² = 0.98 ± 0.01）。橙色柱对应Peña-Romo²报道的数据。插图显示典型的响应轨迹。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）并随后进行Sidak检验进行统计分析。组间差异无统计学意义（P > 0.05）。数据以均值±标准差表示（n = 6）。缩写：ANOVA = 方差分析；BPM = 每分钟搏动次数；ECG = 心电图；HA = 心脏面积；PPM = 每分钟脉冲数。请点击此处查看该图的放大版本。

图3．心房与心室机械反应分析。（A）心室缩短。图像对应于以420 bpm起搏时的一个帧（补充视频1）。红色椭圆用于估算心室缩短（VS）（补充视频2）。通过沿主轴方向的10–20条线（NV；橙色线）的最大值和最小值取平均来计算VS。插图显示归一化的心室缩短。可获得一组参数：缩短持续时间（DVE）、舒张持续时间（DVW）、心室收缩间期（IVV）以及心室缩短幅度（VA）。（B）显示心室反应幅度VA随起搏频率的变化。蓝色柱代表本研究结果，橙色柱对应采用辅助张力记录方法获得的数据²。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）后接Sidak检验进行统计分析。在较高起搏频率下，600 PPM和660 PPM时心室缩短幅度（VA）显著增加（P < 0.05*，P < 0.005**）。VA（参考值15 vs. 360 P > 0.05，参考值15 vs. 420 P > 0.05，参考值15 vs. 480 P > 0.05，参考值15 vs. 540 P > 0.05，参考值15 vs. 600 P < 0.005，参考值15 vs. 660 P < 0.05，参考值15 vs. 720 P > 0.05）。数据以均值±标准差表示（n = 6）。（C）心房分割。图像对应于以420 bpm起搏时的一个帧（补充视频1）。图像展示了应用于右心房（黄色圆圈）和左心房（蓝色圆圈）的兴趣区域。心房机械信号通过对两个ROI取平均获得。（D）心房与心室动力学。显示了在420 bpm时平均心房面积（黑线）、心室缩短（蓝线）的归一化反应以及起搏信号（红线）。可获得一组参数：心房收缩间期（IAT）、平均心房幅度（AA）以及房室延迟（AVD）。缩写：AA = 心房幅度；ANOVA = 方差分析；AVD = 房室延迟；DVE = 心室缩短持续时间；DVW = 心室舒张持续时间；IAT = 心房-心房间期；IVV = 心室间期；NV = 心室测量线数；PPM = 每分钟脉冲数；ROI = 兴趣区域；VA = 心室缩短幅度；VS = 心室缩短。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1. 420 次/分钟刺激下的视频记录。 拍摄自一只离体小鼠心脏，空间分辨率为 200 × 200 子像素，时间分辨率为 750 fps。缩写：fps = 帧/秒；PPM = 次/分钟。请点击此处下载该文件。

补充视频2：心室缩短椭圆估计的代表性视频。 使用补充视频1中的录像（重采样至75 fps）演示分割算法。缩写：fps = 帧/秒。请点击此处下载该文件。

补充图 S1. 心区面积间期的变异性分析。 （A）无刺激的基础状态，（B）360 PPM，（C）420 PPM，以及（D）480 PPM。短期和长期变异性通过数据均值的离散程度计算，如红色椭圆所示。缩写：IAA = 心区面积间期；PPM = 每分钟脉冲数；SD1 = 短期变异性；SD2 = 长期变异性。请点击此处下载该文件。

补充图 S2. 心区面积间隔的变异性分析。（A）540 次/分钟，（B）600 次/分钟，（C）660 次/分钟，以及（D）720 次/分钟。短期和长期变异性以数据均值的离散程度计算，如红色椭圆所示。缩写：IAA = 心区面积间隔；PPM = 每分钟脉冲次数；SD1 = 短期变异性；SD2 = 长期变异性。请点击此处下载该文件。

补充图 S3. 由收缩动力学获得的归一化信号的时间图。 施加的刺激为 420 PPM（红色），响应信号包括整体心脏面积（黑色）、心室缩短（蓝色）和心房面积动态变化（黄色）。缩写：PPM = 每分钟脉冲数。请点击此处下载该文件。

补充文件 1–11：算法与技术文档。 压缩文件夹内容包括：1）3D 打印部件的图像与规格。2）相机采集软件的详细使用指南。3）监测与起搏应用程序的详细指南。4）用于视频归一化与分割的计算程序（步骤 9.1–9.2）。5）用于计算心脏整体力学的计算程序（步骤 9.3）。6）用于心室力学分段计算的计算程序（步骤 9.4）。7）用于心房力学分割的计算程序（步骤 9.5）。8）用于计算房室延迟的计算程序（步骤 9.6）。9）应用于补充视频 1 的电起搏信号数据。10）计算程序（文件 4–7）操作的详细指南。11）监测与起搏应用程序。此外，还包含五个计算程序运行所必需的外部函数（AumCont、filterPeaks、FucCordenada、FucMaskIm、FucPoincare）。请点击此处下载该文件。

讨论

小鼠心脏对温度变化非常敏感^2,9,10,11,22。在本实验中，灌注的心脏呈垂直放置。我们对Langendorff灌注法进行了轻微改进，以尽量减少灌注液温度的损失和运动伪影。在蛇形管路中增加了循环泵，以将灌注液温度维持在37 ± 0.5 °C，同时添加了排水基座以减少运动伪影。此外，使用了一个带有光学系统和两个可调节强度LED光源的隔热保温柜，LED光源位于心脏组织两侧，以实现均匀照射，如图1所示。

为了验证实验安装的可行性，开展了一系列实验，以追踪不同起搏条件下心区面积的变化。获得了起搏频率与心脏频率响应之间的同步范围，该范围与Peña-Romo²所报道的同步区域一致，其研究采用了辅助张力记录方法⁸。我们可以得出结论：该光学实验装置足以支持对心室缩短的进一步实验研究（图2）。

我们进一步研究了心室缩短和心房面积动态信号是否能够用于分析心脏的电机械耦合。心室和心房信号可用于确定房室收缩延迟时间（AVD）的持续时间。在420 PPM的起搏频率下，测得AVD为53 ± 14 ms（均值±标准差）。该结果与VanderBrink²⁴的报道一致，后者通过心电图（ECG）测得PR间期为44 ± 6 ms。

该方法也存在一些局限性；如图3B所示，与心电图技术相比，房室延迟的不准确，以及与辅助张力记录方法所得结果相比，心室波幅的差异，可能源于外部运动伪影。

该方法有助于在完整离体心脏中评估心肌收缩力和心率，且不受药物或系统性因素的影响。这些结果表明，光学系统能够测量心脏心室和心房的缩短反应，突显了其在研究损害房室协调的心律失常或评估药理学效应方面的应用价值。

该方法也存在一些局限性。首先，由于这是一种二维近似方法，无法像在等长收缩法中那样测量收缩力。该方法还有助于减少液滴中的运动伪影，并便于控制溶液温度。其次，小鼠模型中的性别差异显著影响生物医学研究的有效性、可重复性和安全性。历史上，研究人员倾向于使用雄性小鼠，以避免雌性动情周期引起的数据变异，但这一前提已被证明在很大程度上是不正确的^25,26。根据研究类型的不同，本方案可应用于涉及雄性或雌性小鼠的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD Plastipak	302485	手术操作
20 G 针头	NIPRO	AH-2032	主动脉插管
25 mm 可调镜头，放大倍数 8x–100x	Generic	N/A	光学系统相机镜头；通称为可调相机镜头
27 G 针头	BD PrecisionGlide	302358	手术操作
3D 设计支撑部件	CINVESTAV	N/A	定制 3D 设计支撑部件
4-0 丝线缝合线	AMERICAN SUTURE	TGSN0901	主动脉插管
40-A 电源	STEREN	PRL-25	LED 电源
气石	N/A	N/A	台氏液氧合
CaCl2 (2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	台氏液
D-葡萄糖	J.T. Baker	1916-01	台氏液
引流泵	CINVESTAV	N/A	定制引流泵；通称为引流泵
F = 25.4 mm，平凸透镜	THORLABS	LA1951-A	光学系统照明透镜；通称为平凸照明透镜
冰醋酸	Sigma-Aldrich	695092	朗根多夫系统清洗
肝素	PiSA	060M91	抗凝剂
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	台氏液
高功率 LED	Luminius	CBT-90-G-L11-C12	LED 光源
照明系统	CINVESTAV	N/A	定制照明系统；通称为照明系统
KCl	CTR SCIENTIFIC	CTR02196	台氏液
LabVIEW 软件 2018 版本	NATIONAL INSTRUMENTS	N/A	用于运行监测与起搏应用程序的软件；通称为监测与起搏应用程序
MATLAB 软件	The MathWorks	N/A	用于视频归一化、分割及分析程序的计算软件；通称为计算软件
医用级氧气	GRUPO INFRA	N/A	台氏液氧合
MgCl2 (6H2O)	CTR SCIENTIFIC	CTR02104	台氏液
Mini-Pump 可变流速泵	CONTROL COMPANY	3385	灌注泵
小鼠手术套件	Kent Scientific	INSMOUSEKIT	手术操作
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	台氏液
NaH2PO4	DEQ	DEQF290400250	台氏液
NaOH	CTR SCIENTIFIC	CTR03108	pH 调节
NI USB-6009	NATIONAL INSTRUMENTS	779026-01	采集卡
铂电极，直径 0.25 mm	Sigma-Aldrich	349402	电刺激电极
电源（12 V，30 A）	Karnick	PTA-12V30A	循环器电源
压力监测仪	CINVESTAV	N/A	定制压力监测仪；通称为压力监测仪
压力传感器	LA BOUVET	B17295	朗根多夫系统压力监测
纯乙醇	Sigma-Aldrich	493511	系统清洗用乙醇
循环恒温水浴（LXC）	PolyScience	L113A0412	储液罐循环器
生理盐水	PiSA	111848	0.9% 氯化钠（NaCl）溶液
蛇形恒温水浴	CINVESTAV	N/A	定制蛇形循环器/恒温水浴
体视显微镜	N/A	N/A	手术操作
体视显微镜照明	N/A	N/A	手术操作
uEye Cockpit 软件	IDS Imaging Development System GmBH	N/A	相机采集软件；通称为相机采集软件
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2	IDS	AB00624	高速 CMOS 相机；通称为 CMOS 相机
赛拉嗪	PiSA	4001211	麻醉剂
Zoletil 100	Virbac	83048907	替来他明-唑拉西泮麻醉剂；通称为麻醉混合物