基于生物信息学方法鉴定与心力衰竭中线粒体功能障碍及SUMO化相关的候选生物标志物

摘要

通过生物信息学、机器学习和qPCR验证，本研究鉴定了五个与心力衰竭中SUMO化修饰及线粒体功能障碍相关的候选生物标志物。这些发现加深了对心力衰竭机制的理解，并为未来的诊断研究提供了潜在方向。

摘要

心力衰竭（HF）是一个持续存在的临床难题。尽管SUMO化修饰和线粒体功能对心肌细胞健康至关重要，但二者在心力衰竭中的联合作用仍不明确。从GEO数据库下载了两个与心力衰竭相关的数据集。通过训练集中所有基因、SUMO相关基因以及线粒体相关基因的交集，获得重叠基因。采用三种机器学习算法识别诊断关键基因，并基于这些基因构建和评估诊断模型。此外，利用CIBERSORT、MCP-counter和ssGSEA方法评估心力衰竭组与健康对照组之间的免疫微环境差异，分析两组间免疫细胞浸润的不同。通过药物预测和分子对接分析，筛选靶向上述基因的潜在候选药物。最后，采用qPCR在临床样本中验证基因表达水平。共鉴定出113个在线粒体调控中显著富集的共有基因。通过三种机器学习算法识别出五个关键基因，分别为NFKB1、MYEF2、NSUN2、SQSTM1和FKBP4。功能富集分析表明，这些基因与免疫应答、RNA加工及细胞周期调控密切相关。此外，免疫浸润谱分析显示，中性粒细胞浸润在心力衰竭中导致免疫应答失调。分子对接结果表明，小分子药物IMX-942与SQSTM1具有良好的结合亲和力（-5.8 kcal/mol）。qPCR验证结果支持生物信息学分析结论。NFKB1、MYEF2、NSUN2、SQSTM1和FKBP4被确定为连接SUMO化修饰与线粒体功能的关键基因，在心力衰竭中发挥重要作用。这些发现为心力衰竭的病理生理机制提供了新的见解，可能有助于开发新型诊断和治疗策略。

引言

心力衰竭（HF）是多种心血管疾病的终末阶段，其特征是心脏功能受损，无法满足机体的代谢需求¹。这一致残性疾病对患者健康构成严重威胁，导致生活质量下降和死亡率升高²。目前心力衰竭的诊断方法主要包括生物化学标志物检测^3,4、超声心动图和影像学检查⁵。尽管现有治疗手段涵盖药物治疗、基于器械的干预措施和外科手术，但临床疗效仍不理想⁶。药物不良反应、器械适用范围有限、免疫排斥及其他并发症等问题常常限制治疗效果^7,8,9,10,11。因此，迫切需要阐明心力衰竭的潜在发病机制，识别早期且精准的诊断生物标志物，并开发更有效且更安全的治疗策略。

小泛素样修饰蛋白（SUMO）通过一种动态且可逆的过程共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基上，从而调控底物蛋白的结构与功能¹²。SUMO化是一种关键的翻译后修饰，作为多种细胞过程的重要调节机制^13,14。线粒体作为细胞的能量代谢中心，在心力衰竭（HF）的发病机制中起着至关重要的作用。在HF的病理过程中，线粒体功能障碍（如ATP生成不足、活性氧（ROS）爆发以及Ca²⁺稳态失衡）显著促进了疾病进展^15,16,17,18。值得注意的是，越来越多的证据表明SUMO化与线粒体功能之间可能存在相互作用。线粒体应激可激活与SUMO化相关的信号通路，而SUMO蛋白及其特异性蛋白酶对于维持线粒体稳态至关重要^19,20,21。近期研究进一步强调了线粒体质量控制和线粒体动力学在心血管疾病及HF进展中的重要性^22,23。然而，SUMO化与线粒体调控在HF发展中的协同作用仍不明确，尤其是在基因水平上的机制尚不清楚。

本研究系统探讨了SUMO化修饰与线粒体功能障碍在心力衰竭（HF）中共同涉及的基因，这两个关键生物学过程虽已被分别证实与心力衰竭相关，但尚未被全面整合分析。通过整合与心力衰竭相关的差异表达基因、SUMO化相关基因以及线粒体相关基因，筛选出重叠基因。随后利用机器学习算法筛选关键基因，并构建诊断模型。进一步开展功能富集分析和免疫浸润分析，以探究这些基因在心力衰竭中的潜在生物学作用。该整合性研究方法可能为深入理解SUMO化修饰与线粒体功能障碍在心力衰竭中的相互作用提供系统性框架。

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并于2024年11月获得河北医科大学第三医院伦理委员会（W2025-065-1）批准。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。

数据来源与预处理

获取了与心力衰竭（HF）相关的RNA测序数据，包括来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的两个微阵列数据集。选择了两个外周血微阵列数据集：GSE59867（34个HF样本和30个对照样本）作为训练数据集；GSE57338（177个HF样本和136个对照样本）作为验证数据集。GSE57338的临床信息（包括年龄、性别和疾病状态）从GEO数据库中获取，并汇总于补充表1中。此外，从dbPTM数据库（https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php）共获取3,893个与SUMO化修饰相关的基因（SRGs）（补充表2），同时根据先前的研究²⁴收集了2,030个线粒体相关基因（MRGs）（补充表3）。随后，使用R软件包GEOquery（v 2.72.0）²⁵从GEO数据库下载数据集，提取表达矩阵，并获取样本表型信息。通过比对注释文件并匹配基因ID进行注释，去除无效的基因ID，并保留表达水平最高的探针。

通过机器学习选择关键基因

采用多步骤方法筛选与心力衰竭（HF）、SUMO化修饰和线粒体相关的基因。首先，通过交集分析鉴定训练数据集、SRG和MRG之间的共有基因。利用R软件包ClusterProfiler（v 4.12.6）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以确定共有基因的潜在功能²⁶。随后，采用三种机器学习方法——LASSO回归、XGBoost和随机森林（RF）——进一步筛选基因。在LASSO回归中，通过交叉验证选择最优正则化参数λ，以识别具有最高预测价值的遗传特征，保留具有非零系数的基因用于后续分析。接着，使用XGBoost和RF算法计算各基因的特征重要性得分，并筛选出前20个重要基因。

诊断模型的构建与评估

基于GSE59867数据集，采用Logistic回归构建诊断模型。随后应用该模型预测疾病状态并计算概率评分。为验证模型性能，从GSE57338数据集中提取相同的關鍵基因，经标准化处理以匹配训练数据集，并用于外部预测。模型性能通过受试者工作特征（ROC）曲线、混淆矩阵、校准曲线和决策曲线分析（DCA）进行评估。

基因集富集分析（GSEA）与亚细胞定位

采用Spearman相关性分析来鉴定每个关键基因的相关基因。使用R软件包ClusterProfiler（v 4.12.6）对关键基因的相关基因进行GSEA分析。同时，为了确定关键基因在细胞内的精确定位，利用GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）分析其亚细胞定位。

基因-疾病关联与药物预测

为了评估所鉴定的关键基因的临床相关性，我们进行了系统的疾病关联分析和药物相互作用分析。利用比较毒物基因组学数据库（CTD；https://ctdbase.org/）查询基因-疾病关联关系，并根据推断评分和参考文献数量对结果进行排序（报告前10位关联）。关键基因的基因-药物相互作用数据来自药物-基因相互作用数据库（DGIdb），并排除相互作用评分<0.5的药物。随后，我们从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载了对应关键基因的蛋白质三维结构，并从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取了潜在药物的分子结构。接着，使用CB-Dock2²⁷（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php）进行分子对接分析，以计算潜在药物与蛋白质之间的结合评分。较低的结合自由能表明更稳定的相互作用，提示该化合物可能具有更高的靶向潜力。

免疫浸润分析

采用三种互补方法评估免疫细胞浸润：微环境细胞群体计数器（Microenvironment Cell Populations-counter, MCP-counter）²⁸、通过估计RNA转录本相对亚群进行细胞类型鉴定（cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts, CIBERSORT）²⁹ 以及单样本富集分析（single-sample enrichment analysis, ssGSEA）³⁰。MCP-counter 和 CIBERSORT 分析使用 R 软件包 IOBR（v 0.99.0）³¹ 进行。MCP-counter 用于估算免疫细胞和基质细胞的丰度，而 CIBERSORT 用于量化22种免疫细胞类型的相对比例。ssGSEA 使用 GSVA 软件包（v1.52.3）³² 进行，以评估样本水平上免疫细胞亚型的富集情况。

竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络的构建

为了研究与先前鉴定的关键基因相关的潜在miRNA–lncRNA调控作用，构建了一个ceRNA调控网络。使用R软件包multiMiR（v 1.26.0）³³预测关键基因的潜在microRNA（miRNA）–mRNA相互作用，整合了来自PITA（https://omictools.com/pita-tool/）和miRDB数据库（https://mirdb.org/）的数据。筛选出高置信度且一致的miRNA–mRNA配对。随后，从StarBase数据库（https://rnasysu.com/encori/）获取lncRNA–miRNA相互作用，并筛选出由≥10个CLIP-seq实验支持且归类为lincRNA的相互作用。通过整合lncRNA–miRNA–mRNA相互作用构建ceRNA网络。

qPCR 验证

为了验证关键基因的表达，从河北医科大学第三医院（批准编号：W2025-065-1）的临床队列中收集了心力衰竭（HF）患者和健康对照者的血液样本（每组 n = 6），所有操作均在获批的方案下并取得知情同意后进行。使用TRIzol试剂联合氯仿和异丙醇提取总RNA。提取后，将RNA溶解于DEPC处理的水中，并使用NanoDrop分光光度计测定其浓度和纯度。在转录分析中，使用RT反转录用Fast First-Strand cDNA合成预混液（含dsDNase）将RNA反转录为cDNA。随后使用Fast Taq qPCR SYBR Green预混液进行定量PCR。特异性引物序列详见材料表。相对基因表达水平采用2^-ΔΔCT法计算，并进行了适当的归一化处理。

统计学分析

所有统计分析均使用 R 软件和 GraphPad Prism 进行。两个独立组之间的统计比较根据数据分布情况，采用 Student t 检验或 Mann-Whitney U 检验。以 p 值小于 0.05 为差异具有统计学意义。

结果

相交基因的鉴定与功能富集分析

为了鉴定参与心力衰竭（HF）中SUMO化修饰和线粒体功能的基因，首先对训练集GSE59867进行了质量控制（补充图1A）。在训练集中所有基因、SUMO化相关基因（SRGs）和线粒体相关基因（MRGs）之间进行了三者交集分析，共鉴定出113个重叠基因（图1A）。为了探索这些基因潜在的生物学功能，进行了GO功能和KEGG通路富集分析。如图1B所示，GO富集分析显示，这些基因主要参与线粒体自噬调控、有丝分裂自噬、三磷酸核苷酸代谢以及细胞周期相关组分，包括纺锤体和有丝分裂纺锤体结构。关键的分子功能包括泛素蛋白连接酶结合和转录因子活性。KEGG通路分析进一步揭示了这些基因在疾病和代谢相关通路中显著富集，包括神经退行性疾病通路、脂质与动脉粥样硬化、雌激素信号通路、病毒感染以及有丝分裂自噬通路（图1C）。综上所述，这些结果...

讨论

心力衰竭（HF）是多种心血管疾病的进展性和终末期阶段，其特征是具有高度复杂且多因素的病理生理机制^17,34。尽管SUMO化修饰和线粒体功能障碍各自已被证实与心力衰竭相关，但二者在基因水平上的潜在协同作用仍缺乏充分研究。在本研究中，我们鉴定了五个关键基因——NFKB1、MYEF2、NSUN2、SQSTM1和FKBP4，并利用多种机器学习方法建立了心力衰竭的诊断模型。此外，我们通过生物信息学分析进一步阐明了这些基因的潜在生物学功能。

利用机器学习在临床诊断中的预测能力，我们采用LASSO回归、XGBoost和RF算法，对SUMO化相关基因与线粒体相关基因中的共有基因进行了全面筛选，鉴定出五个关键基因，即NFKB1、MYEF2、NSUN2、SQSTM1和FKBP4。生物学功能分析表明，这五个基因与免疫调节、转录调控以及细胞应激反应密切相关。其中，NFKB1是核因子κB（NF-κB）家族的关键成员，在介导免疫和炎症信号通路中发挥重要作用^3...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿替代品	Servicebio	G3014-02	qPCR试剂
DEPC处理水	Biosharp	BL510A	qPCR试剂
快速第一链cDNA合成预混液（含dsDNase）	Albatross Biology	500-101	qPCR试剂
Fast Taq qPCR SYBR Green预混液	Albatross Biology	500-102	qPCR试剂
FKBP4引物	Tsingke	N/A	正向：5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’ 反向：5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’
异丙醇	Hushi	80109218	qPCR试剂
MYEF2引物	Tsingke	N/A	正向：5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’ 反向：5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’
NanoDrop分光光度计	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000C	qPCR试剂
NFKB1引物	Tsingke	N/A	正向：5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’ 反向：5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’
NSUN2引物	Tsingke	N/A	正向：5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’ 反向：5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’
SQSTM1引物	Tsingke	N/A	正向：5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’ 反向：5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’
TRIzol试剂	Vazyme	R401-01	qPCR试剂
β-actin引物	Tsingke	N/A	正向：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ 反向：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’