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方法文章

使用定制笼具系统在小鼠中进行可自愿群养的粪便样本采集

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DOI：

10.3791/72280

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2026年8月7日

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1Department of Neurophysiology and Neuropharmacology, Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna, 2Core Facility Animal Breeding and Husbandry, Medical University of Vienna, 3Department of Biological Sciences and Pathobiology, Unit of Pharmacology and Toxicology, University of Veterinary Medicine, 4Department of Farm Animals and Veterinary Public Health, Institute of Animal Husbandry and Animal Welfare (ITT)

本文内容

摘要

本方案描述了一种定制化笼具系统，可用于群养小鼠在无需束缚、符合动物福利的前提下，同时且独立地自愿采集粪便样本。

摘要

可靠地测定粪便皮质酮代谢物需要能够分配到个体动物且在特定时间窗口内收集的粪便样本。对于群养小鼠而言，这具有挑战性，因为混合的笼内样本无法实现个体分配，而临时隔离可能影响动物福利和研究结果。本方案旨在介绍一种简单、低成本的笼具系统，可实现群养小鼠自愿、同步且个体化的粪便样本采集。该系统由一个带金属网盖的聚碳酸酯笼具与三个独立的收集盒连接组成。经过适应和训练后，小鼠会自愿进入收集盒以获取少量食物奖励。随后可在无需追逐、抓取或强制转移的情况下关闭门体。每个收集盒中的粪便颗粒可单独收集，从而在采样期间外维持群养条件的同时，将样本准确归于个体动物。该方案支持非侵入性的纵向采样，适用于测定粪便皮质酮代谢物或其他粪便生物标志物的研究。该装置可使用标准笼具材料和有机玻璃轻松制作，可拆卸清洗，并支持多个笼具并行采样。该方法通过减少与操作相关的干扰并提高采样时间窗口的标准化程度，为群养小鼠的内分泌监测提供了一种实用的优化方案。

引言

评估血浆皮质酮浓度的一个主要挑战在于，采样过程本身可能诱发皮质酮的急性升高，从而干扰测量结果，并可能影响研究结论的解读1,2,3。检测粪便皮质酮代谢物（FCM）提供了一种非侵入性的替代方法，因为FCM浓度反映的是采样前数小时内的循环糖皮质激素水平，具体时间取决于物种、品系、性别及肠道通过时间4,5。然而，在群养小鼠中进行可靠的FCM分析仍然具有挑战性。从饲养笼中收集的混合粪便样本无法追溯至个体动物，且由于个体间糖皮质激素分泌的差异以及确切采样时间窗的不确定性，可能导致结果变异性较高。长时间将动物隔离可能干扰研究目标，而为采集个体样本进行短期分离则工作量大、通量受限，并且本身也可能引起应激反应2。

为了以最少的操作实现对群养小鼠个体粪便样本的采集，研究人员开发了一种定制的粪便采集笼（图1A-E）。该设计借鉴了先前报道的用于刺鼠的粪便采集笼6，并针对实验小鼠进行了改良。该系统由一个标准的聚碳酸酯III型笼子与三个独立的采集盒连接而成，动物可自主进入采集盒，并通过滑动门将其关闭。该装置可在采样期间无需直接抓取小鼠即可收集其个体粪便样本，同时支持多只动物的同步采样。因此，该笼具为群养小鼠提供了一种实用的、可归因于个体的非侵入性粪便皮质酮代谢物（FCM）采样方法。

以下方案描述了一种粪便采样系统，该系统利用定制的笼具实现无接触粪便采集，可在保持小鼠群养环境的同时，对个体小鼠的粪便样本进行收集和鉴定。

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方案

在开展研究之前，已咨询维也纳医科大学负责任的动物伦理委员会，该委员会建议本研究无需正式的动物实验许可证；因此，无批准文件或方案编号可供提供。本研究仅涉及常规的繁育和饲养管理操作，以及非侵入性的粪便样本采集，未实施任何侵入性操作。根据欧盟指令2010/63/EU，预计对动物造成的负担被评估为低于因按照良好兽医实践进行针头穿刺所引起的疼痛、痛苦、应激或持久性伤害的阈值。所有动物的饲养和护理均符合机构动物福利标准。

1. 笼子的制作（参见材料清单）

  1. 根据图2A-C所示模板，从5 mm厚的有机玻璃（亚克力玻璃）上切割出部件1-4。
    注意：精确尺寸的模板可按A3纸张格式打印（补充图1和补充图2）。
  2. 按照图2D所示，切除聚碳酸酯II型（PTII）笼具的底部。该部分后续将用作粪便收集盒的顶盖。
  3. 在PTII笼具原底部钻出孔洞和槽口，如图2D所示。
    注意：精确尺寸见补充图3。
  4. 在PTIII笼具的前侧和短侧钻孔，如图2E所示。
    注意：精确尺寸见补充图4。
  5. 以部件2作为模板，在PTIII笼具的短侧和PTII笼具的长侧标记相应的钻孔位置。
  6. 钻出已标记的孔，并使用螺纹螺钉将PTIII笼具、PTII笼具和部件2连接固定，如图2F所示。
  7. 将部件1作为PTII笼具的底板插入。将部件4a和4b放置到位，使其固定部件1，并将采样笼分隔为独立的收集盒。使用热熔胶枪将其固定。
  8. 将部件4a和4b的下部凸起滑入部件1的槽口中。这些凸起构成收集盒的支腿。
  9. 将部件4a和4b的上部凸起穿过顶盖（即PTII笼具的原底部），以固定顶盖位置。
  10. 将木制筷子或棒材穿过凸起上的孔洞，顶部使用一根棒材，底部使用两根棒材，以稳定并固定整个结构。
    注意：木制材料仅可在动物实验设施中作为一次性用品使用，因其无法清洁消毒。若不符合此条件，则应使用其他材质的棒材替代。
  11. 使用热熔胶枪封闭剩余缝隙或微小误差。使用部件3a、3b和3c（图2B）作为连接主笼与收集盒之间的滑动门。
    注意：确保动物无法接触到任何锋利边缘、胶水残留或突出材料。本原型中使用的有机玻璃/亚克力玻璃组件不适合高压蒸汽灭菌。因此，若该系统用于需要对笼具相关材料进行灭菌的SPF级设施，则应采用机构批准的非高压灭菌消毒程序，或使用可高压灭菌材料替换亚克力组件，同时保持原有尺寸不变。

2. 动物准备与饲养

  1. 根据研究需要获取相应品系的足量小鼠。
    注：代表性数据来自30只八周龄C57BL/6J小鼠，包括20只雌性和10只雄性。小鼠符合FELASA标准的无特定病原体（SPF）状态，购自德国苏尔茨费尔德的查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）。
  2. 将动物饲养在聚碳酸酯III型标准笼具中，每笼最多饲养三只成年小鼠，采用常规饲养条件。
    注：本研究中，单独饲养的雄性小鼠置于标准聚碳酸酯II型笼具中。
  3. 动物房环境应维持在22 ± 2 °C，相对湿度55 ± 10%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，每日6:00开灯。
  4. 提供标准维持饲料，并自由饮水（ad libitum）。
  5. 每笼提供白杨木屑垫料、纸质卷筒、红色透明塑料小屋以及纸巾作为筑巢材料。
  6. 主要通过小鼠尾巴的天然标记进行个体识别。若在称重过程中发现尾部标记相似的个体，可临时使用记号笔进行标记区分。

3. 动物的适应性训练与训练

注意：组装完成的笼具由一个饲养笼（PTIII）和一个带有三个独立收集盒（PTII）的采样笼连接而成。饲养笼可像普通笼具一样使用，内含垫料、笼内丰富化设施、无外部固定件的金属网盖，并可提供食物和饮水。该系统可拆卸清洗，且仅在采样周使用。在非采样周，动物可饲养于标准的PTIII笼具中。

  1. 在首次计划采样前至少两周，将动物放入笼具系统中。
  2. 通过移除滑动门一整晚，使动物适应采集箱，允许其自由探索箱内环境。
  3. 在首次采样前进行三次训练。训练应在与后续采样相同光照条件和相同时间段进行，理想情况下在黑暗期开始后不久的红光环境下进行。
  4. 在每个采集箱入口对面的箱壁上涂抹少量奖励物，如榛子酱、花生酱、麦芽膏或类似适口性良好的食物。
  5. 在第一次训练日，保持箱门敞开，让动物自主发现并摄取奖励物。
  6. 在第二次训练日，等待动物进入采集箱并开始舔食奖励物后，小心关闭其身后的滑动门，并在10分钟后将其释放。
  7. 在第三次训练日，重复上述操作，并逐步延长动物在采集箱内的停留时间。
    注意：训练过程应保持安静和一致。避免驱赶动物进入箱内，以免增加其应激反应，影响后续采样时的自愿参与程度。

4. 粪便样本的采集

  1. 样本采集时间
    1. 根据研究的生物学问题以及血浆皮质酮与粪便皮质酮代谢物排泄之间预期的时间延迟来规划采样时间。在小鼠中，粪便皮质酮代谢物通常反映采样前约8–10小时的循环糖皮质激素水平。
      注意：如果精确的时间点至关重要，建议进行预实验，以确定在所使用的特定品系、性别和实验条件下粪便皮质酮代谢物（FCM）排泄的时间进程。该预实验可与训练阶段结合进行。
    2. 将采样安排在粪便排出量较高的时间段内。通常在黑暗期和活跃期开始时进行采样效率最高。
    3. 在整个研究过程中，所有采样均应在每天相同的时间进行，以减少因FCM水平昼夜节律变化引起的变异。
      注意：根据我们的经验，若动物房光照周期安排得当，上午约10:00发生的事件，在下午6:00至8:00之间进行采样时能够得到良好反映。
  2. 采样流程与实用建议
    1. 在采样前对动物进行个体标记。可使用耳标或个体尾部标记。
      注意：脚趾标记和颜色编码在红光下箱内可能难以辨认。
    2. 在光照期准备采集箱，将奖励物涂抹于每个箱子的后壁。
      注意：白天准备箱子可提高实验人员的可视性，并使动物在采样前即可嗅到奖励物气味。
    3. 在预定的采样时间打开采集箱，等待动物自愿进入。
    4. 一旦小鼠进入采集箱，小心地关闭其身后的滑动门。
    5. 当所有动物均进入各自的箱子后，记录每只小鼠的身份及其所在位置于预先准备的采样表中。
    6. 若单次采样涉及超过10个笼位，应安排第二位实验人员协助完成动物识别、开关门操作及记录工作。
    7. 将动物保留在采集箱中预定的采样时长内，通常为30分钟至2小时，具体时长取决于预期的粪便产量和实验设计。
      注意：若无法明确确定个体身份、粪粒被尿液、垫料或其他动物粪便污染、采样持续时间显著偏离预定时间窗口，或粪便样本量不足以进行FCM分析，则应排除该样本。
      注意：使用50 mg作为起始样本量是我们的标准操作流程，所有验证实验及其他相关文献5,7,8均采用此量，通常该数量易于获取。
    8. 采样结束后，打开滑动门，允许小鼠返回其居住笼。
    9. 小鼠离开后应立即关闭采集箱，防止其重新进入而导致样本交叉污染。
    10. 使用长镊子从每个采集箱中取出粪粒，并转移至分别标记的收集管中。
    11. 将样本储存于-20 °C，直至进行FCM检测的后续处理。
      注意：如果采集箱已牢固关闭且小鼠无法再次进入，则粪粒的收集可推迟至下一个光照期。但此类操作应在同一项研究中保持一致。
    12. 动物保留在居住笼部分（PTIII）直至下一次换笼。之后可将采集箱拆卸并使用常规笼具清洗机进行清洗。

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结果

在一项比较长期繁殖与间歇繁殖小鼠的纵向研究中，利用自制的粪便采样笼成功采集样本，并对粪便皮质酮代谢物（FCMs）进行了定量分析。代表性FCM分析共包括30只动物：长期繁殖组为15只动物，分布在5个笼子中；间歇繁殖组为10只动物，分布在5个笼子中，其中5只雄性动物单独饲养，仅在3次繁殖事件期间与雌性共同饲养。样本在每两周一次的笼具更换日以及周末共19个时间点进行采集。动物进入采样箱的平均时间为7.5分钟（标准差SD = 3.07），大多数动物在总共30只小鼠中平均占27.6只（SD = 1.44）。所有小鼠进入采样箱的平均时间为11.69分钟（SD = 3.29）。所有小鼠的平均拘束时长为24.56分钟（SD = 15.51），从第一只小鼠进入采样箱至开始释放的平均时间为43.14分钟（SD = 8.51）。平均释放时长为14.86分钟（SD = 22.82），整个操作流程的平均持续时间为68.00分钟（SD = 11.87）。在19次采样（3次试采 + 16次常规采样）中，预期共采集480份样本，其中2份样本因小鼠在拘束期间未排便而缺失，3份样本因小鼠处于高度妊娠期或刚分娩后无法采集，另有5只小鼠需要轻柔辅助才能进入采样箱。前三次采样所...

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讨论

本方案描述了一种用于收集群体饲养小鼠可单独归因粪便样本的简易笼具系统。该方法的主要优势在于，它能够在保持群养关键特征（特别是与笼内同伴的视觉和嗅觉接触）的同时，实现对个体样本的归属。这一点非常重要，因为群养通常符合动物福利要求，也可能构成实验设计的一部分10。与混合采集家庭笼内粪便样本的方法相比，该系统可将粪便皮质酮代谢物（FCM）数值归因于特定个体，同时避免在采样前或采样期间对动物进行长时间单独饲养。

实验室小鼠粪便样本采集的常用方法包括笼内混合采样、临时单独饲养于清洁笼具中、代谢笼采集，以及在抓取或转移后直接采集。笼内混合样本易于获取，具有非侵入性、成本低且可同时对多个笼具进行平行采样的优点，但无法实现群养动物个体来源的归属。临时单独饲养或转移至清洁笼具可实现个体样本的对应，但会使动物脱离其社会群体，并可能因抓取、环境新奇性或社会隔离而引入急性应激反应。这一点对于粪便皮质酮代谢物（FCM）分析尤为重要，因为与皮质酮相关的检测指标对采样过程本身引起的应激非常敏感11。代谢笼可实现受控的...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢Pollak教授对本文发表的支持。

Katharina Tillmann 深深感谢她已故的祖父 Bruno Wochner 的支持。Bruno Wochner 在99岁高龄时仍参与了笼具系统的设计，提供了他的木工车间，并协助完成了打磨和建造工作。他对工艺与建造的热情始终是激励她的源泉，谨在此致以深切的谢意与怀念。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 毫米钻头Craftomat22380487直径 5 mm；数量 1
60 毫米钻头Bosch32064647直径 60 mm；数量 1
7 毫米钻头Craftomat22380520直径 7 mm；数量 1
钻孔机Makita25730054标准手持式或台式钻机；数量 1
热熔胶枪Einhell 29051207用于笼具组装；数量 1
热熔胶棒Einhell29049664与热熔胶枪兼容；数量 5–10
Makrolon 笼具Animalab31200129标准 II 型笼具；数量 1
Makrolon 笼具Animalab31200256标准 III 型笼具；数量 1
有机玻璃 / 丙烯酸玻璃Bauhaus29122352总面积约 0.25 m²；厚度 5 mm；数量  2 张 DIN A3 尺寸板材
锯子或铣削设备Scheppach32079641小型带锯、曲线锯或数控铣床；数量 1
螺纹螺钉Profi Depot1080753320 mm × 3 mm；数量 4
木筷子 / 木棒Ikea903.429.71圆形木棒；数量 3

参考文献

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