一种用于研究治疗临界尺寸皮肤创面药物的大鼠切除性创面模型

摘要

本方案描述了一种在大鼠中建立的皮肤全层缺损伤口模型，并结合了保湿室装置。该系统可用于评估外用液体制剂、细胞悬液、生物材料以及其他伤口治疗药物。

摘要

皮肤伤口是全球医疗领域面临的一项重大挑战，导致显著的发病率和经济负担。可靠且具有临床相关性的动物模型对于研究组织修复机制以及评估新兴治疗策略至关重要。然而，传统的啮齿类动物切除伤口模型由于富含肌纤维的皮下肌（panniculus carnosus）的存在而受到快速伤口收缩的限制，这与人类的伤口愈合过程存在显著差异。人类的伤口愈合 主要通过肉芽组织形成和再上皮化完成。本研究描述了一种大鼠切除伤口模型，旨在限制伤口收缩，同时为测试敏感的治疗干预措施提供受保护的环境。在Sprague Dawley大鼠背部制造全层10 mm的切除伤口，并使用腈丁二烯橡胶（NBR）O型环通过间断缝合固定以稳定伤口。为维持湿润的伤口环境，应用Eakin粘附密封圈和透明粘性薄膜形成一个适合局部施用细胞、生物材料或药物化合物的密闭腔室。额外的保护层包括泡沫敷料、粘性胶带、管状绷带和双肩固定系统，用于防止动物自行移除敷料。通过数字图像面积测量法和苏木精-伊红染色的组织学评估，对伤口愈合过程进行为期14天的监测。该操作每只动物约需30分钟，且获得一致的伤口愈合结果。NBR O型环作为夹板用于限制伤口收缩。愈合过程主要通过肉芽组织形成和再上皮化实现。敷料在长达七天内保持完整，未见感染迹象。组织学分析显示活跃的组织修复过程，表现为表皮再生和炎性细胞浸润。该模型为伤口治疗药物和先进再生疗法的临床前评估提供了平台。

引言

皮肤伤口，包括难愈性伤口，影响全球超过4000万患者，给医疗系统带来巨大负担，预计到2024年每年花费将达到220亿美元。仅在欧洲，每年就有400万患者遭受难愈性伤口的困扰，占据高达一半的可利用急性病床收治名额¹。尽管外科技术、术中操作以及先进伤口敷料的可及性已取得进展，部分伤口仍具有难治性，且最终可能出现并发症。因此，开发新的治疗方法至关重要，而这些方法的验证需要建立皮肤伤口的实验性 动物模型，以测试多种外用材料。

在实验性皮肤创伤动物模型中，皮肤切除是最适用于构建创伤愈合模型的技术²。该模型可用于研究出血、炎症反应、肉芽组织形成、再上皮化、血管生成以及组织重塑等过程³。切除性创口通常通过手术切除动物背部特定区域的皮肤而建立。创口应达到临界尺寸，以避免自发愈合。这种临界尺寸的切除性创口可直接用于研究不同化学物质、细胞或生物材料的局部应用及其在愈合过程中的作用^4,5。

啮齿类动物与人类皮肤在结构和功能上具有相似性 细胞与分子阶段 包括止血、炎症、增殖和重塑等阶段。大鼠和小鼠是伤口模型中最常用的物种，因其易于获得、体型小、遗传操作相对简便且便于操作。与小鼠相比，大鼠具有若干实际优势，包括更大的体型和更厚的皮肤，其皮肤由比小鼠更多的角质形成细胞层构成。小鼠的伤口通常在7天内愈合，而大鼠的愈合过程则可在约12–14天内进行评估⁶.

使用皮肤松弛的啮齿类动物时，一个主要挑战是伤口收缩³。啮齿类动物的皮肤含有panniculus carnosus层，该层在受伤后会收缩以减少暴露面积。相比之下，人类伤口的收缩能力有限，主要依赖肉芽组织形成和再上皮化完成修复⁷。为克服动物模型的局限性，一种方法是对手术伤口周围皮肤进行物理固定或加装夹板⁸。钛制伤口腔室是成功开发用于防止伤口收缩的装置之一⁹，但存在诸多缺点，包括因腔室重量导致动物应激反应增强、手术植入复杂、装置易脱落、易引发感染以及成本较高等问题。Galiano 等人于 2004 年提出了夹板式伤口模型的概念¹⁰，通过在伤口边缘缝合一个刚性硅胶环来实现固定。该方法显著减少了伤口收缩¹¹，但仍存在若干缺陷和局限性，主要集中在 软组织损伤风险、夹板移位率高以及伤口愈合不一致等方面。夹板（如刚性硅胶环）可能对周围皮肤施加过度压力，导致缺血、刺激甚至坏死，尤其是在操作不当的情况下。由于动物活动或理毛行为，硅胶夹板常出现破损、断裂或脱落^8,11。缝线不均匀也常导致伤口周围张力分布不均，从而造成愈合效果不稳定。在本研究所介绍的模型中，将一个丁腈橡胶（NBR）O型环通过 8–12 针均匀分布的间断聚酰胺缝线缝合于皮肤伤口边缘。该方法预期可最大限度降低上述风险，并有效限制伤口收缩，促使伤口通过肉芽组织形成和再上皮化的方式愈合，类似于人类的伤口愈合过程。这种愈合机制将有助于将动物模型的研究成果转化为临床应用。

1962年，George D. Winter 提出了湿润伤口愈合理论，作为伤口护理产品设计的概念基础¹²。基于该理论，过去几十年中已开发出多种伤口敷料，如纱布、透明薄膜、泡沫敷料和水凝胶敷料¹³。另一方面，可塑形的水胶体造口屏障环密封圈于1974年被设计和开发，用于预防和防止渗漏。这类密封圈可被轻松塑形，以贴合伤口边缘，尤其适用于造口护理。在此模型中，将一种具有粘聚性的密封材料施用于伤口外部，并与无菌透明薄膜共同作用，形成一个湿润的密闭环境，模拟接受治疗的皮肤伤口患者的临床状况，促进伤口上皮化，并防止局部用药（如细胞、生物材料、化合物）泄漏。

伤口敷料对于保护创面免受物理损伤和微生物感染至关重要。由于大鼠对敷料的耐受性较低，对其使用伤口敷料一直具有挑战性。大鼠在从麻醉中恢复后几乎立即会通过啃咬和撕扯的方式移除或破坏敷料。这使得局部用药（如细胞和药物）难以维持，也无法有效保护创面免受外界病原体和污染物的侵袭。这在啮齿类动物模型中是另一项需要解决的难题，尤其是在需要无菌环境的研究中，例如生物制剂测试、细胞治疗和先进治疗性医药产品研究。在本研究所展示的模型中，采用泡沫敷料和粘性胶带覆盖湿性环境腔室，随后使用弹性管状绷带、固定绷带以及微孔手术胶带，实施双肩交叉固定敷料，以防止大鼠移除或损坏敷料。

本文报道的模型结合了多种不同实验方案的要素，并经过数年发展完善。其目的是建立一种使用湿润环境的动物耐受性良好的大鼠全层皮肤缺损伤口模型，以方便对敏感的局部用药材料（尤其是液态制剂）进行测试。

方案

以下所述的所有动物实验程序均经瑞典隆德伦理委员会批准（批准号 5163-2023）。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 实验​精神动物

1. 使用8–14周龄的成年雄性Sprague Dawley大鼠。
2. 实验前，在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，用标准饲料喂养大鼠，至少适应环境1周。

2. 术前准备

1. 使用1.5%–2.5%异氟烷（诱导时使用4.5%）与1.0–1.5 L/min氧气混合进行动物麻醉。将动物俯卧于加热垫上以维持体温。涂抹眼用润滑剂以保护眼睛，并在动物背部皮下注射经生理盐水稀释的布托啡诺（Buprenorphine），剂量为0.05 mg/kg体重，用于术后镇痛。
   注意：动物与加热垫之间应保留一层一次性隔离垫。
   警告：异氟烷为中枢神经系统抑制剂，且对呼吸道具有刺激性。应使用经校准的挥发器，并配备主动废气清除系统，以防止蒸气暴露。
2. 使用电动剪刀从颈部基部向下剃除背部毛发，范围约10 cm。用氯己定和70%乙醇对剃毛区域彻底清洁两次，然后用带开孔的手术巾覆盖动物，仅暴露已清洁的区域。

3. 制备切除性伤口

1. 使用合适的灭菌外科器械，例如剪刀和镊子。
2. 使用模板和外科永久性标记笔，在颈部基底下方约 4 cm 处绘制一个直径为 10 mm 的圆圈。
3. 用镊子夹住标记皮肤的中心位置，并用剪刀切除标记的皮肤组织。伤口深度应达到浅筋膜层，可通过完全释放皮肤全层厚度并观察覆盖肌肉的半透明筋膜来确认。
4. 将 NBR O 型环应用于皮肤伤口边缘，并通过缝合 8–12 针将其固定在位。固定环的目的是防止皮肤收缩。确保主缝合点位于 12 点钟位置，随后为 6 点钟、3 点钟和 9 点钟位置。若使用 8 针缝合，则在每两个主缝合点之间的中间位置各加一针（图 1A）。
5. 利用 NBR O 型环外侧的粘合特性，应用内聚性密封材料，并与无菌透明粘性敷膜共同构建一个湿润环境（图 1B）。在此阶段，伤口由 NBR O 型环固定，应用腔室的侧壁由皮肤边缘和内聚性密封材料共同构成；腔室底部为创面裸露表面，顶部则由透明敷膜构成。
6. 先用一层敷膜覆盖伤口，随后通过敷膜将治疗溶液（细胞溶液或化合物溶液）施加至伤口表面。所述尺寸的腔室可轻松容纳 100 µL 溶液。
7. 在注射部位再覆盖一层敷膜，以防止治疗液泄漏（图 1C）。
8. 在敷膜外覆盖一层柔软的硅胶绷带，以保护敷膜（图 1D）。
9. 应用粘性胶带（图 1E），然后以双肩式结构在大鼠体表缠绕弹性管状绷带，并使用固定绷带和微孔外科胶带进行固定（图 1F–H）。
10. 修剪大鼠的爪子，以防止其抓破敷料。
11. 在动物脱离麻醉前，皮下注射卡洛芬（carprofen，5 mg/kg 体重），用生理盐水稀释后给药。

4. 术后操作

1. 将动物置于加热垫上，并用毯子覆盖，直至从麻醉中苏醒。将动物单独饲养在不同的笼子中，或放置在带有隔板的同一笼子内，以防止动物相互咬伤及抓掉敷料。
2. 术后次日上午皮下注射卡洛芬（carprofen），剂量为5 mg/kg体重，用生理盐水稀释后给药，以控制术后疼痛。必须每天监测大鼠的术后疼痛情况或体重减轻情况，必要时可追加给予镇痛药物。

5. 伤口测量与敷料更换

1. 术后第一周内每天检查每只动物 。应检查敷料情况，若动物活动困难或表现出不适，应及时调整敷料。
2. 在第7天动物处于麻醉状态下更换敷料，操作方法如步骤2.1所述。
3. 轻柔地将敷料从皮肤上移除。拍摄带有标尺的伤口照片以提供比例参照。使用Fiji/ImageJ软件分析图像，以评估伤口表面积。
4. 根据研究者的需要进行测量或其他操作。
5. 按照步骤3.8–3.11的方法应用新的清洁敷料，并按照步骤4.1所述让动物恢复。

6. 伤口样本采集与安乐死

1. 在第14天按照2.1节所述实施麻醉，或根据具体实验方案进行麻醉。移除敷料并拍摄伤口部位的照片。
2. 移除敷料并拍摄伤口部位的照片。
3. 采集伤口皮肤组织。使用手术刀切除伤口周围的皮肤，包括部分健康组织。
4. 将切除的组织放入2 mL离心管中，置于液氮中速冻以备后续分子分析；或在室温下保存于4%缓冲甲醛溶液中用于组织学分析。也可将组织切成两份，分别用于两种检测。
5. 取下伤口组织后，根据伦理批准的方法通过吸入CO₂或其他方式处死动物。
   警告：CO₂在导致意识丧失前会引起疼痛、痛苦以及黏膜的快速酸化。应使用调节流量的流量计逐步置换密闭容器中的空气。

7. 组织化学染色：伤口固定、包埋与切片

1. 将伤口组织活检样本置于4%甲醛溶液中，室温固定3小时，随后于4 °C过夜保存。
   注意：甲醛具有毒性，是一种强效致敏剂，且为已知的人类致癌物。操作时须在化学通风橱中进行，并佩戴个人防护装备。
2. 用PBS清洗活检样本两次，每次30分钟。
3. 将PBS更换为70%乙醇，并于4 °C保存。
4. 若需避免抗原丢失，活检样本在处理前最多保存24–48小时；若仅用于常规组织学表征，可保存1–2周。
5. 用流动的自来水彻底清洗活检样本，以去除残留的甲醛。
6. 按以下顺序使用乙醇溶液对组织进行脱水：70%乙醇20分钟；95%乙醇更换两次，每次20分钟；100%乙醇更换两次，每次20分钟。
7. 将活检样本置于65 °C的石蜡浴中保温。
8. 将熔化的石蜡倒入指定模具中，将活检样本置于中央，静置冷却并凝固。活检样本应垂直于模具表面放置，以便切片时可观察到所有皮肤层次。
9. 使用切片机对石蜡包埋的组织块进行切片，厚度为5 μm，并将切片漂浮于39 °C的去离子水水浴中。
10. 将切片转移至载玻片上并进行干燥，使组织牢固附着于载玻片表面。载玻片可于4 °C保存以备后续使用，或立即进行组织化学染色处理。

8. 苏木精-伊红（HE）染色

1. 将切片置于60 °C的加热板上脱蜡30分钟，随后在三次二甲苯（或任何替代品）中各浸泡5分钟，再用PBS漂洗2分钟。
   注意：二甲苯具有毒性且高度易燃。操作时应在通风橱中进行，并采取标准的个人防护措施。
2. 依次在100%乙醇、96%乙醇和dH₂O中各水化5分钟。
3. 加入苏木精染液染色5分钟，然后用流水冲洗5分钟。
4. 用0.3%酸性乙醇（含0.3%盐酸的70%乙醇）分化数次浸洗，随后用流水冲洗5分钟。
5. 用伊红Y（0.2%）染色30秒，然后用流水冲洗5分钟。
6. 依次在96%乙醇中脱水1分钟，100%乙醇中脱水1分钟。
7. 滴加数滴封片剂，然后盖上盖玻片。
8. 在光学显微镜下观察切片，并采集数字图像。

结果

高效操作时，每只动物的鼠类切除性伤口模型手术约需30分钟。模型构建、O形环固定及敷料处理的各个步骤见图1。

图2展示了第7天和第14天的伤口愈合进展。伤口半径以毫米（mm）为单位测量，并使用公式（面积 = πr²）计算表面积，其中第0天的半径r为5 mm。伤口闭合的进展情况以第14天未覆盖区域占初始诱导伤口面积的百分比表示。使用Fiji/ImageJ软件分析伤口区域的数字图像，并通过图像中包含的标尺将比例校准至10 mm（图2D）。在勾画并测量伤口区域后，结果以mm²表示。图3展示了第14天的剩余伤口面积（29.4% ± 10.1%；n = 7）。

图4展示了第14天皮肤伤口的HE染色结果。图4中的切片显示，皮肤伤口活检呈现出从周边向中心自然愈合的过程。伤口愈合尚未完成，中心区域缺乏正常的典型多层板状结构，仅见一层较薄的表皮。真皮层显示大量炎性细胞浸润，这在生理愈合过程中具有重要意义。总体而言，该模型在动物体内耐受性良好，能够抑制皮肤收缩，并实现不完全但符合生理过程的愈合。

图1：切除性伤口的制备与敷料操作流程。（A）在大鼠背部表面制造切除性伤口，并在伤口边缘缝合O形环。（B）在O形环周围敷设可塑形的水胶体屏障环。（C）在水胶体屏障环上方覆盖两层透明粘性薄膜敷料。（D）在透明粘性薄膜敷料上放置泡沫敷料。（E）使用弹性粘性胶带固定敷料。（F–H）在大鼠体表缠绕管状固定绷带，随后以双肩式结构加用固定绷带和手术胶带，以确保敷料稳固。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：伤口愈合的代表性图像。（A）第7天获得的代表性伤口图像。（B–D）第14天获得的代表性伤口图像，显示O形环放置时的伤口情况（B）以及移除O形环后的伤口情况（C,D）。请点击此处查看此图的放大版本

图3：第14天伤口面积的定量分析。第14天剩余伤口面积的百分比，显示伤口尺寸的缩小。数据以均值 ± 标准差（SD）表示（n = 7）。请点击此处查看该图的放大版本

图4：伤后第14天伤口愈合的组织学评估。伤口组织代表性苏木精-伊红（HE）染色切片，放大倍数分别为10×、20×和40×。伤口中心显示再上皮化不完全，而伤口边缘呈现生理性表皮愈合。真皮层含有大量炎性细胞，符合正常的伤口愈合反应。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

难以愈合的皮肤伤口是指在预期时间内未能正常经历愈合各阶段的伤口，可能由手术、创伤和过敏反应引起，也可能是血管功能不全、糖尿病和肥胖等多种健康问题的继发性结果¹⁴。尽管已有多种治疗方法，仍有许多患者无法实现正常愈合。探索新的治疗途径，如细胞疗法、化学物质、植物提取物以及新发现的化合物，对于识别新型管理策略至关重要。该模型可广泛应用于各类伤口愈合研究。建立标准化的药物、细胞及生物治疗测试方案，有助于推动临床前伤口愈合研究。此处描述的切除性伤口模型及其操作方案，解决了大鼠皮肤伤口模型在研究中的主要局限性，即皮肤收缩和伤口敷料问题。

在小鼠皮肤切除伤口模型中，常使用钛制夹板来减少伤口收缩；然而，这种夹板的应用存在一定的局限性。夹板的刚性会改变伤口及其周围组织的力学环境，可能影响细胞反应、炎症过程以及基质重塑。因此，伤口愈合过程所处的条件与未经处理的啮齿类动物皮肤存在差异。尽管限制收缩有助于提高与人类伤口闭合的可比性，但夹板所施加的力学约束也可能引入影响愈合过程的人为效应，在解读实验结果时应予以考虑¹⁵。

为此，模型中使用了NBR O形圈以限制皮肤收缩，并将其固定于原始伤口边缘。这些O形圈对动物具有良好的耐受性，并在整个实验期间的14天内保持固定位置。尽管在任何动物中均未观察到明显的伤口收缩现象，但在未来的研究中，通过纹身标记伤口边缘或其他定量方法可进一步加强对于伤口收缩的评估。因此，纹身标记可被视为本方案中的一个可选步骤。

敷料的应用可保护伤口免受污染和感染，同时维持伤口部位的治疗，这对皮肤伤口愈合模型至关重要。然而，某些动物自行移除不同类型敷料的情况并不少见。大鼠经常梳理并触碰伤口区域，即使使用了粘性薄膜或二次固定方法，仍可能导致敷料移位或完全脱落。敷料覆盖的丢失会改变伤口环境，影响治疗的递送，并增加动物之间的实验变异性¹⁶。在本研究所呈现的模型中，敷料在动物身上保持完整长达7天，未发生脱落或损坏。所有实验动物均未出现皮肤伤口感染的迹象。建议每周更换一次敷料，因为随着动物的生长和体重增加，敷料会变得越来越紧。在固定时应注意平衡固定牢固性与动物活动能力，同时确保敷料不会过松而被动物自行取下。

该方案具有灵活性和可定制性。尽管我们推荐使用异氟烷吸入麻醉，因其恢复迅速且安全性高，但如果缺乏异氟烷挥发器，研究者也可选择注射麻醉，例如氯胺酮/赛拉嗪。本研究虽仅使用了雄性大鼠，但该方案同样适用于雌性大鼠。

我们建议联合使用布托啡诺和卡洛芬进行镇痛，以增强镇痛效果。由于布托啡诺作用持续时间相对较长，单独使用也可能提供充分的术后镇痛。与其他阿片类药物相比，该药物对免疫功能影响较小，有利于伤口在炎症过程中的愈合¹⁷。在研究炎症时，应避免使用可抑制炎症并减轻疼痛的非甾体抗炎药。尽管本研究中每只动物仅制造一个伤口，但研究人员可根据其伦理审批和实验设计，采用相同方案创建额外伤口。应仔细考虑动物福利问题以及3R原则。研究人员在使用动物模型时，必须遵守3R原则（替代、减少和优化），并尊重动物福利。手术操作必须符合相关指南，并严格遵循已批准的动物实验方案。本研究通过测量伤口面积和组织学评估来评价伤口愈合情况，其中再上皮化是愈合反应的一个组成部分。缝线与环状固定装置之间的相对位置可能干扰局部愈合过程。各动物之间的缝线数量必须保持一致。伤口面积的评估应包括所有创面区域，包括缝合部位¹⁸。该模型可进一步发展，以涵盖与皮肤伤口相关的多种基础病理状态，如缺血、糖尿病和衰老。本研究的主要局限性在于缺乏非加压固定的对照组、未对伤口收缩进行定量评估，以及除伤口面积测量和描述性组织学之外，缺乏足够的定量生物学结局指标。在建立该模型过程中，出现了多种技术挑战和需要排查的问题。保护性背心/敷料的合适贴合对于动物福利和伤口成功愈合至关重要。敷料过松可能导致动物在麻醉恢复后将其移除，而过紧则可能限制活动、影响血液循环或呼吸功能。敷料应确保在敷料与皮肤之间留有约一根手指（对于体型较小的大鼠可用小指）的空间。应每天监测动物状况，若观察到不适、活动受限或异常姿势等迹象，应及时调整敷料。由于个体间镇痛敏感性差异，术后疼痛管理方案可能需因动物而异。应定期评估动物是否存在与疼痛相关的表现，包括弓背、活动减少、食欲下降和体重减轻。根据机构指南，在必要时应提供额外镇痛治疗。环状装置的稳定固定对于防止伤口收缩至关重要。8–12个间断缝合应均匀分布在环周，以均匀分散张力，防止抬升或变形。每个缝线应使用外科结固定，以尽量减少恢复期间松脱的风险。最后，我们建议在同一项研究中使用相同品系、年龄、体重和性别的大鼠，以最大限度减少变异。此外，所有手术操作可由同一位经验丰富的研究人员完成。为避免偏倚，我们建议在组织学和分子分析中采用双盲法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
布托啡诺	Salfarm Scandinavia	451790	浓度 0.3 mg/mL
卡洛芬	Zoetis Animal Health	191380	Rimadyl 50 mg/mL
Eakin 密封垫	Swemed	2076152	厚度 3 mm
包埋工作站	Leica Biosystems	EG1150 H&C
伊红	Histolab	1650	0.2% 染色液
无水乙醇	Solveco	1015	分析纯
固定绷带	Swemed	2048934	4 cm × 4 m PA/粘胶纤维
甲醛	Histolab	2176	PBS 中 4%，pH 7.2–7.4
毛发剪	Swevet	F95000	剪切长度：0.5 mm
苏木精	Histolab	1800	Harris HTX
Histolab-Clear	Histolab	14250	二甲苯替代品
异氟烷	VM Pharma	448210	Attane vet 1000 mg/g
Lekotape	Swemed	2056774
Mepilex	Swemed	2059125	7.5 × 8.5 cm
Mepore 薄膜	Swemed	2057753	6 × 7 cm 带框架
Micropore 外科胶带	Swemed	2063856	1.2 cm × 9.1 m
切片机	Thermo Fisher Scientific	387861	Microm HM355S
封片介质	Histolab	00840-05	Pertex
O 型圈	Ruilogod	B0B1TRQBRT	内径 11 mm，线径 1 mm
缝合线（Ethilon 4-0）	Scandivet	21274-A	非吸收性聚酰胺
组织脱水仪	Leica Biosystems	Leica TP1020
Tubifast 双向弹性绷带	Swemed	2069292	7.5 cm × 10 m PES/PA