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方法文章

利用解剖标志在小鼠心肌梗死模型中精确结扎左前降支冠状动脉

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DOI：

10.3791/72336

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2026年8月18日

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1Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 2National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education & Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province (Collaborative Innovation Center for Prevention of Cardiovascular Diseases), 4School of Integrated Traditional and Western Medicine, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案通过永久性结扎左前降支冠状动脉以在小鼠中诱导心肌梗死，采用前室间沟作为可重复的体表解剖标志，以实现缝合定位的精确性。心肌梗死的验证通过心电图、超声心动图、组织学染色以及血清生物标志物分析完成。

摘要

永久性结扎左前降支（LAD）冠状动脉是临床前心血管研究中建立小鼠心肌梗死（MI）模型最常用的方法。然而，在传统方案中，结扎部位通常位于左心耳突起下方1–2 mm处，而该解剖标志在手术过程中往往难以可靠识别。加之小鼠冠状动脉解剖结构存在较大的个体间变异，这常常导致LAD定位不准确、结扎位置不一致，以及不同操作者之间的可重复性降低。为克服这些局限性，本方案提出以前室间沟（AIS）作为LAD结扎的引导标志。AIS是一条浅表的沟槽，可在显微镜下直接观察到，LAD紧邻其下方走行。与传统方法不同，AIS提供了一个稳定的解剖参照，有助于更一致地选择结扎位置，且更易于经验不足的操作者识别。本方案结合了标准化的异氟烷吸入麻醉与无创气管插管技术，并通过心电图、超声心动图、酶联免疫吸附测定（ELISA）、组织病理学染色以及三维冠状动脉成像来验证心肌梗死的建立。该方案为在小鼠中诱导心肌梗死提供了一种可靠且可重复的实验方法，可用于研究心肌梗死后发生的病理生理学及免疫学变化。

引言

心肌梗死（MI）是全球心血管疾病发病率和死亡率的主要原因之一，对人类健康构成重大威胁1。MI具有突发性、临床病程危急和高死亡率的特点，主要由冠状动脉血栓性闭塞引起，可导致严重的心肌缺血、继发性心肌细胞坏死，并引发一系列并发症，包括心律失常、心力衰竭和猝死2。尽管临床心脏病学已取得显著进展，但人类心肌组织获取受限，仍严重阻碍了对MI潜在病理生理机制的研究以及有效治疗策略的开发3。因此，建立可靠、可重复且具有临床相关性的in vivo动物模型，以真实再现MI的临床特征和疾病进展，对于机制研究和临床前治疗评估仍至关重要。

自Johns和Olson于1954年首次建立小鼠心肌梗死（MI）模型以来，诱导小鼠心肌梗死的方法已不断得到优化4。在显微镜直视下永久结扎左前降支（LAD）冠状动脉已成为应用最广泛的技术，因其可重现人类心肌梗死的关键病理特征，包括局部心肌缺血、心肌坏死以及梗死后心室重构5。然而，传统的LAD结扎术需要较高的显微外科操作技能，通常需经过长期训练才能掌握，这限制了不同操作者和实验室之间手术的一致性和可重复性6。此外，术中和术后并发症——如出血、肺损伤或肺萎陷、结扎位置错误以及因通气不足导致的机械性组织损伤——导致围手术期死亡率相对较高，进一步限制了该模型的广泛应用7。针对这些局限性，Gao等人提出了一种改良技术，通过心脏翻转法进行LAD结扎，简化了手术操作，降低了建模的技术门槛8。此外，针对特定研究需求，还发展了冠状动脉冷冻损伤和药物诱导心肌损伤等其他实验方法9,10。尽管如此，在直视下进行永久性LAD结扎仍是首选方法，因其最接近人类心肌梗死的主要病理生理特征，同时可精确控制梗死范围和位置。

尽管被广泛使用，传统的左前降支结扎术仍存在诸多局限性，包括结扎位点识别的变异性、操作过程不一致、围手术期死亡率相对较高，以及不同实验室之间结果重复性的差异，这些因素均可能影响实验结果的可靠性与可比性11。本方案的总体目标是建立一种更为标准化且可重复的小鼠永久性左前降支结扎方法，利用前室间沟（AIS）作为外部解剖标志来定位血管。该方法不再依赖于在左心耳下方固定距离处估算结扎位置，而是将AIS——一条在显微镜下清晰可见、位于左前降支（LAD）上方的浅表沟槽——作为稳定的解剖参照，指导结扎操作。与传统的基于解剖标志的经验性定位相比，该方法旨在实现更一致的结扎位点选择，减少操作者依赖的变异性，并提高对经验较少的外科操作者的可操作性，同时保持与标准小鼠心肌梗死（MI）实验流程的兼容性。因此，本方案适用于希望采用可重复的手术方法建立永久性心肌梗死模型，以开展心肌损伤、心室重构、炎症及相关心血管疾病机制研究的研究人员。

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方案

所有涉及动物的实验均经西南医科大学动物实验中心伦理委员会批准（批准号：SWMU20240146）。本研究使用8至10周龄、体重为20.0 ± 3.0 g的雄性C57BL/6J小鼠（特定病原体阴性[SPF]级）。实验开始前，将小鼠在标准实验室条件下（22°C ± 2°C；12小时光照/12小时黑暗循环）适应环境1周。

1. 术前准备

  1. 手术当天准备并灭菌所有手术器械，包括镊子、眼科剪、持针器、微型蚊式止血钳、V形眼睑拉钩、带针的3/8圆弧7-0尼龙缝线、6-0尼龙缝线和5-0尼龙缝线。所有金属器械在手术前于121°C高压灭菌20分钟，并在每只动物之间使用玻璃珠灭菌器（250°C，15秒）重新灭菌，随后在无菌垫上冷却。缝线应使用密封无菌包装内的产品。
  2. 设置两个独立的工作区域以维持无菌操作。在一个区域准备镊子、小鼠气管插管套件和麻醉机，在另一个无菌手术区域准备灭菌器械、棉签、聚维酮碘和无菌纱布。
  3. 在胸部区域涂抹脱毛膏1分钟。使用无菌水或生理盐水浸湿的无菌纱布轻轻擦除脱毛膏及毛发。
    1. 仅脱毛并不构成外科皮肤准备。应在麻醉、插管并将小鼠固定于手术平台后，于皮肤切口前立即进行最终的无菌皮肤消毒和无菌铺巾（步骤2.6）。
  4. 术前1小时通过腹腔注射给予头孢唑林（300 mg/kg）。将注射用头孢唑林钠用无菌0.9%生理盐水重悬至工作浓度30 mg/mL，并按每20 g体重约0.2 mL的剂量给药以达到目标剂量。术后继续每日给药一次，连续使用5天。
    注意：本方案中不得使用全身性或局部药理性止血剂。术中止血可通过无菌棉签施加轻柔、持续的压力10–30秒，或直至出血停止来实现。

2. 麻醉诱导与气管插管

  1. 将小鼠放入与麻醉机相连的诱导室（16 × 10 × 11 cm）中。设置载气流速为 0.5 L/min，使用 3.5%–4.0% 异氟烷诱导麻醉。
    注意：通过检查足底回缩反射消失来确认麻醉深度足够。在此条件下，小鼠通常在 2–4 分钟内达到外科麻醉水平。
  2. 将麻醉后的小鼠仰卧位置于小鼠气管插管平台上。将小鼠上切牙钩挂在平台的橡胶带上，使其头部和颈部伸展约 45° 角。调整口腔、咽部和喉部的轴线，使声门直接可见。
  3. 进行经口气管插管
    1. 在直接喉镜观察下进行经口气管插管，无需气管切开，以建立控制性机械通气。使用 20 G 静脉留置针（外径约 0.9 mm，长度约 15 mm）作为气管导管。
    2. 用镊子打开小鼠口腔，并轻轻将舌头推向一侧。将小型动物喉镜的镜片沿舌背插入，并下压舌根。
    3. 推进喉镜直至可见会厌。沿镜柄轴线向上和向前抬起喉镜，以抬高会厌，暴露 V 形声门开口及浅色声带。
    4. 在吸气过程中，于直接观察声带的情况下将导管经开放的声门插入。导管通过声门后，移除喉镜。
    5. 将导管推进至约 5–7 mm 深度。拔出导丝，并将导管连接至呼吸机。
      注意：通过观察胸壁双侧对称、与呼吸机同步的运动来确认气管导管位置正确。若胸壁运动微弱而出现节律性腹部运动，且伴随麻醉深度逐渐变浅，应将导管从食管中撤出并重新插管。
    6. 若无法观察到声门，应撤出喉镜，并重新调整小鼠在插管平台上的位置，使其头部和颈部伸展约 45°。重新对齐口腔、咽部和喉部的轴线，用无菌棉签清除口咽部分泌物，再次进行喉镜检查。若小鼠出现苏醒迹象，将其放回诱导室加深麻醉，然后再次尝试插管。
    7. 若小鼠出现发绀、喉部出血或持续性呼吸暂停，应立即终止操作。停止异氟烷给药，并将小鼠置于温度可控的加热垫（37°C）上，直至其完全恢复。
    8. 若气管插管失败，则不得进行开胸手术。应将该操作推迟至后续时段，或排除该动物并记录为操作失败。
      注意：反复插管尝试可能导致喉部水肿，增加术后呼吸窘迫的风险。大多数情况下，在直接观察到声门后前两次尝试即可成功插管。经口气管插管技术的熟练掌握需要反复练习和对该技术的熟悉。
  4. 以 0.5 L/min 的流速输送空气作为载气，并以 1.5%–2.0% 异氟烷维持麻醉。将呼吸机设置为呼吸频率 130 次/分钟，潮气量 2 mL，吸气与呼气时间比为 5:4。
    注意：呼吸机设定的潮气量高于根据体重估算的理论值，以补偿呼吸机管路的可压缩容积及气管导管的死腔。在整个操作过程中，通过监测动物是否出现发绀以及是否存在气压伤（包括气胸和皮下气肿）迹象来评估通气效果。
    1. 在整个操作过程中持续监测麻醉深度。每 2 分钟评估一次呼吸模式和足底回缩反射。使用心电图（ECG）持续监测心率，并调整异氟烷浓度以维持心率在 400–500 次/分钟；通常 1.5%–2.0% 的异氟烷浓度已足够。操作期间应观察是否存在对抗呼吸机的自主呼吸、胡须运动以及黏膜颜色变化。
    2. 若足底回缩反射重现、观察到胡须运动或出现对抗呼吸机的自主呼吸，应以 0.5% 为增量逐步增加异氟烷浓度，最高不超过 3.0%。若心率低于 350 次/分钟，则以 0.5% 为减量逐步降低异氟烷浓度，最低至 1.0%。当观察到上述任何体征时，应暂停手术操作，继续监测心率、呼吸模式、黏膜颜色和胡须运动，待生理参数稳定后方可继续操作。
  5. 将小鼠向右侧倾斜，使左侧朝上，以暴露左侧胸壁。使用胶带将四肢和尾巴固定在平台上。
  6. 用聚维酮-碘对术区进行三次连续消毒。每次消毒均使用新的无菌棉签，从计划切口部位开始，向外呈同心圆螺旋状擦拭，范围超出预期切口各方向约 1 cm。每次使用后丢弃棉签，切勿将已使用的棉签重新返回术区中心。最后一次消毒后让皮肤自然完全干燥，然后覆盖无菌手术巾，仅暴露手术区域，再进行皮肤切口。

3. 开胸术与心脏暴露

注意：整体手术流程，包括动物体位固定、开胸、心脏暴露、左前降支冠状动脉结扎、胸腔闭合及术后恢复，如图1和图2所示。

心脏解剖图，显示结扎位点及冠状动脉；手术部位图像。
图1：利用前室间沟定位左前降支冠状动脉结扎位点的解剖学位置。 （A）结扎前暴露的小鼠心脏腹面观，显示前室间沟（AIS）。（B）左前降支（LAD）冠状动脉结扎后同一区域的视图；圆圈区域指示结扎位点。（C）示意图显示AIS与冠状动脉之间的空间关系。LAD沿AIS走行，结扎点位于沟槽的上三分之一处。RCA，右冠状动脉；LCA，左冠状动脉；LCX，左回旋支冠状动脉。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠手术步骤示意图，心脏暴露，实验研究，逐步图解。
图2：小鼠前室间沟引导下左前降支冠状动脉结扎的手术操作示意图。 （A）将麻醉后的小鼠固定，左侧胸壁区域去毛。（B）在左侧胸壁做皮肤切口。（C）分离胸肌并确定合适的肋间间隙以进行开胸。（D,E）插入并放置胸廓牵开器，扩大肋间间隙，暴露手术视野。（F）观察暴露的心脏，并识别前室间沟（AIS）。（G）将7-0尼龙缝线穿过前室间沟，并置于左前降支（LAD）冠状动脉下方。（H）打结固定缝线，实现永久性LAD结扎。（I）移除胸廓牵开器，并关闭胸壁。（J,K）依次缝合肌肉层和皮肤层。（L）术后将小鼠置于保温条件下恢复。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用眼科剪刀，在左侧胸壁做一条长约1 cm的纵向皮肤切口，切口平行于胸骨长轴，位于左侧胸骨边缘外侧约2 mm处。暴露其下方的胸肌。
  2. 使用精细镊子，沿胸大肌和胸小肌的肌纤维方向进行钝性分离。将肌肉向侧方牵拉，以暴露肋骨及肋间隙，避免切断肌肉以减少出血。
  3. 在打开胸腔前，确认合适的肋间隙。寻找位于肋间隙内、沿肋骨平行走行的胸廓内动脉分支——前肋间动脉，并在第四肋间隙中最清晰可见的前肋间动脉头侧，确定其上方的第三肋间隙。
  4. 若前肋间动脉不清晰可见，可通过触诊第一肋骨并由头侧向尾侧计数，以确定第三与第四肋之间的间隙。在继续操作前，确认所选肋间隙可直接、无遮挡地观察到左心耳及左心室前侧游离壁。
    注意：准确识别第三肋间隙至关重要，因胸廓切开位置错误可能影响心脏视野，进而影响手术操作。
  5. 经左侧第三肋间隙行胸廓切开术。使用V形眼睑拉钩轻柔撑开肋间隙，直至左心耳及左心室上三分之一区域在手术视野中清晰暴露。
    注意：此时心脏仍被心包覆盖，因此尚不能可靠识别缺血区域（AIS）。仅可在打开心包后（步骤3.6）依据步骤4.2–4.3所述方法识别AIS。
  6. 用一对精细镊子轻轻夹住心包，将其从心肌表面提起。用另一对精细镊子缓慢撕开心包，完全暴露心脏。

4. 基于解剖标志引导的左前降支冠状动脉结扎术

  1. 将6-0尼龙缝线穿过胸壁，并施加轻柔牵引以扩大手术视野。在确定结扎部位前，需完全暴露前室间沟（AIS）(图1A)。
  2. 将AIS识别为从心脏基底部斜向心尖走行的浅沟，其在表面标记出左、右心室之间的分界（图1C）。在显微镜下，AIS表现为位于左心耳下缘约1–2 mm处的一个近似圆形的凹陷。
  3. 若难以识别AIS，可用棉签蘸取温热生理盐水轻轻擦拭心外膜表面。随后在显微镜下重新检查手术区域，以更清晰地辨认该沟槽。
    注意：在解剖显微镜下，AIS是一条易于识别的浅沟，其在解剖上界定心室间分界，左前降支冠状动脉（LAD）紧贴其下方走行。若擦拭后仍无法清晰辨认AIS，应首先确认开胸术是否提供了足够的暴露视野。然后根据既往报道的方法直接识别LAD：与伴行的心静脉相比，该动脉颜色更偏粉红、管径更小，且具有明显搏动性12。
    1. 若仍无法识别AIS或LAD冠状动脉，应首先确认开胸是否通过左侧第3肋间进行。如有必要，按照步骤3.3–3.5所述重新调整开胸位置，然后重复步骤4.1–4.3所述的AIS和LAD识别过程。
    2. 若经过10分钟仔细检查后仍无法识别AIS或LAD，或出现无法控制的出血、总开胸操作时间超过20分钟，或尽管调整麻醉深度但心率仍持续低于300次/分钟，则终止手术。使用5%异氟烷深度麻醉小鼠，通过颈椎脱位法实施安乐死，并将该动物记录为手术失败，纳入手术结果分析。
  4. 在AIS上三分之一处的沟槽横穿一根7-0尼龙缝线（图1B）。将针垂直插入心外膜表面，深度约为0.5–1 mm，进针点和出针点应位于沟槽两侧，跨度约为沟槽的最大宽度。
  5. 使用外科结固定结扎线。调整结扎线直至打第一个结后，结扎远端心肌立即出现苍白，且局部组织无明显压痕。
    注意：缝线收紧程度应仅足以阻断冠状动脉血流。过度张力可能损伤邻近心肌，或导致缝线切割血管及周围组织。
  6. 结扎后1分钟内，通过观察结扎远端心肌出现斑片状缺血性苍白来确认冠状动脉成功闭塞12。进一步通过心电图上ST段抬高来确认闭塞效果。
  7. 若缺血区域过小或未出现苍白现象，应松开结扎线并重复结扎操作。

5. 关闭切口与术后恢复

  1. 小心移除V形眼睑拉钩。使用单个间断的5-0尼龙缝线关闭胸廓切口，将缝针绕过相邻的第三和第四肋骨，以重新闭合第三肋间隙。缝合时应使针紧贴肋骨表面，以避免损伤肋间神经血管束。在打结前，于呼气末轻轻压迫胸廓以排出残留的胸腔内气体，然后在维持压迫的同时用外科结固定缝线。
  2. 使用5-0尼龙缝线分层缝合皮肤切口。在继续操作前，确保伤口边缘完全对合。
  3. 将小鼠置于温度可控的加热垫（37°C）上，停止异氟烷给药，并继续机械通气直至自主呼吸恢复。观察动物从麻醉中恢复的情况，包括尾巴或胡须的活动以及呼吸频率恢复至约150次/分钟的规律呼吸模式。
  4. 通过确认规律的自主呼吸、胸壁运动与呼吸机周期同步，以及肢体或胡须出现有目的的活动，判断拔管准备就绪。在呼气相期间缓慢撤出气管插管，随后继续在加热垫上监测小鼠3–5分钟，以确认无呼吸困难表现。
    注意：拔管后呼吸困难最常见原因是肋间隙闭合不全导致的气胸。若发生呼吸困难，应暂时重新麻醉并通气小鼠，打开皮肤缝线，检查肋间隙闭合情况，并在任何漏气部位加缝缝线，然后重复拔管操作。
  5. 小鼠从麻醉中恢复后，将其放回原饲养笼。术后立即皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg），并在术后前48小时内每4–6小时给药一次。
  6. 术后前3天每天至少监测小鼠两次，之后每天一次。评估体重、体态、活动性、呼吸模式及手术伤口情况，对达到预设人道终点的动物实施安乐死，包括持续费力呼吸、无法接触食物或水，或对刺激无反应的弓背不动体态。

6. 心电图（ECG）评估

  1. 使用配备心电图放大器的多通道生理记录系统记录心电图信号。将三个皮下肢导电极插入小鼠体内，正极输入（VIN+）连接至左后肢，负极输入（VIN−）连接至右前肢，接地端（GND）连接至右后肢。
  2. 将心电图放大器模块连接至数据采集单元。根据当地市电频率将陷波滤波器设置为 50 Hz（或 60 Hz），然后打开采集软件，并在模拟通道设置中添加一个新的心电图放大器模块。
    1. 按以下参数配置放大器：增益 = 2000，模式 = 正常，低通滤波器 = 150 Hz，高通滤波器 = 0.05 Hz。打开采集设置，将采样率设为 1 kHz，然后关闭设置窗口。
    2. 放置电极后，点击“开始”以启动记录。将显示时间基准设为每大格 0.5 s，垂直刻度设为每大格 0.25 mV，连续记录至少 30 s 的心电图。选择一段稳定且无伪迹的信号用于分析和代表性展示。
  3. 在结扎后立即记录心电图，同时将小鼠维持在 1.5% 异氟烷麻醉状态下，并置于加热垫上保持正常体温。在相同时间点及可比的麻醉条件下，分别记录心肌梗死（MI）组和正常对照（NC）组的心电图。

7. 超声心动图

  1. 成像前1天使用脱毛膏去除小鼠前胸部的毛发。整个检查过程中使用1.5%异氟烷对小鼠进行麻醉。
  2. 将小鼠仰卧于加热平台上，四肢固定于心电图电极上，并在心前区涂抹超声耦合剂。根据需要调整异氟烷浓度，以维持心率高于400次/分钟。
  3. 将超声探头置于左侧胸骨旁第3至第4肋间，探头标记朝向右前肢，角度约为30°，并使探头与心脏长轴对齐。
  4. 所有成像均使用线性阵列换能器，发射中心频率为30 MHz，带宽为20–46 MHz，轴向分辨率为50 μm。设置发射功率为100%，成像深度为13 mm，成像宽度为11 mm，动态范围为60 dB，二维增益为40 dB。以每秒210帧的帧率采集B模式电影循环图像。
  5. 将这些采集参数保存为系统预设。所有动物和所有成像过程均使用相同的换能器、预设参数、发射功率、动态范围、成像深度和成像宽度，并且在正常对照组（NC）与心肌梗死组（MI）之间不得更改成像深度。
  6. 在同一长轴切面内，将M模式取样线置于心室中段水平，垂直于室间隔和左心室后壁，取样门覆盖左心室完整的前后直径。记录M模式图像以供后续分析。
  7. 采集能够清晰显示左心室、左心房和主动脉根部的B模式图像，并记录电影循环图像以供后续分析。在同一成像平面采集相应的M模式图像。
  8. 从所获取的图像中测量左心室舒张末期内径（Dd）、左心室收缩末期内径（Ds）以及室间隔厚度。连续采集五个心动周期的数据，并报告其平均值。
    注：使用成像软件自动计算左心室舒张末期容积（LVEDV）和左心室收缩末期容积（LVESV）。按公式计算缩短分数（FS）：FS = (Dd − Ds) / Dd × 100%；射血分数（EF）计算公式为：EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 100%。

8. 组织采集、组织学染色和 ELISA

  1. 组织采集
    1. 在心肌梗死（MI）诱导后的第7天，对每只小鼠进行超声心动图检查。使用4%异氟烷麻醉小鼠，通过眶后静脉采血约1.5 mL，采用颈椎脱位法处死小鼠，并取出心脏。
    2. 将血液样本在4°C下静置过夜以促进凝固。在4°C下以2000 × g离心10分钟，收集血清，并于−80°C保存直至分析。
  2. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
    1. 使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒定量检测血清中B型利钠肽（BNP）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和核因子-κB p65（NF-κB p65）的含量。
      1. 将所有试剂和血清样本恢复至室温，并根据试剂盒说明书配制工作液。用磷酸盐缓冲液（PBS）将血清样本稀释1:5，即1体积血清加4体积PBS。
      2. 分别向标准品孔、零孔和样本孔中加入50 μL的标准品、PBS和稀释后的血清样本，空白孔不加。除空白孔外，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，密封后在37°C避光孵育60分钟。
      3. 弃去各孔内容物，用洗涤缓冲液洗涤5次，每次洗涤时缓冲液在每孔中停留20秒。用无绒纸将板拍干。
      4. 每孔加入100 μL新鲜配制的底物溶液（溶液A与溶液B按1:1体积比混合）。密封后在37°C避光孵育15分钟，加入50 μL终止液，立即在450 nm波长下测定吸光度。
    2. 从每个测定值中减去空白孔的吸光度，使用四参数逻辑（4PL）回归模型绘制标准曲线。根据拟合曲线计算各样本浓度，乘以5倍稀释因子，取双复孔的平均值作为最终结果。
  3. 组织处理、包埋与切片
    1. 将取出的心脏用冰冻磷酸盐缓冲液短暂冲洗，以去除残留血液。在室温下用4%多聚甲醛固定组织至少24小时。
    2. 修剪心脏以暴露平坦的短轴切面，并将其放入标记好的组织包埋盒中。依次通过梯度乙醇脱水（75%乙醇4小时，85%乙醇2小时，90%乙醇2小时，95%乙醇1小时，无水乙醇两次，每次30分钟）。将组织转移至乙醇-二甲苯混合液中5–10分钟，再用两次二甲苯各透明10分钟，最后用三次熔化石蜡各浸润1小时。
    3. 将心脏以短轴面向包埋块表面进行包埋。在乳头肌中部水平连续切取3 μm厚切片，将切片漂浮于40°C水浴中展平，捞至载玻片上，并在60°C烘干。
    4. 用两次二甲苯（每次15分钟）脱蜡，随后依次用三次无水乙醇（每次5分钟）、75%乙醇（5分钟）和反渗透水（RO水，5分钟）水化。
      警告：多聚甲醛可能为致癌物，且对呼吸道和皮肤具有刺激性；二甲苯易燃且具有神经毒性。操作时应在化学通风橱中佩戴无菌医用手套、实验服和护目镜，并按照机构危险废物处理程序处置废弃物。乙醇和正丁醇（n-butanol）易燃，应远离点火源。
  4. 组织学染色
    1. 苏木精-伊红染色
      1. 将脱蜡并水化的切片浸入苏木精染液中3–5分钟，随后用水冲洗。
      2. 用1%酸性乙醇分化，再用水冲洗。用0.5%氨水溶液返蓝，再次冲洗。
      3. 依次将切片转移至85%乙醇、95%乙醇和无水乙醇中，各5分钟。用伊红复染3–5分钟。
      4. 用三次无水乙醇（每次5分钟）脱水，再用正丁醇（n-butanol）脱水5分钟。用三次二甲苯（每次5分钟）透明，中性树胶封片。
        注：细胞核呈蓝色，细胞质和细胞外基质呈红色。
    2. 马松三色染色（Masson’s trichrome staining）
      1. 将脱蜡并水化的切片在2.5%重铬酸钾溶液中媒染过夜，约15小时，室温下进行。用流水冲洗约30秒，直至黄色消失。
      2. 用Ponceau–酸性品红溶液染色6分钟，至组织呈亮红色。若着色较浅，可适当延长染色时间，随后用流水冲洗至流出液无色。
      3. 沥去多余水分，避免切片干燥。用磷钼酸水溶液分化1–2分钟，至胶原呈淡色而肌纤维保持红色。
      4. 不冲洗，直接将切片转入苯胺蓝溶液中，孵育6–30秒。
      5. 用1%乙酸溶液更换3–5次进行分化，每次约8秒。快速通过三次无水乙醇脱水，时间分别约为3、5和5秒。
      6. 用正丁醇（n-butanol）透明5分钟，再用二甲苯透明5分钟，中性树胶封片。
        注：胶原纤维呈蓝色，肌纤维、纤维蛋白和红细胞呈红色。
    3. 天狼星红染色（Sirius Red staining）
      1. 将脱蜡并水化的切片置于65°C烘箱中，用天狼星红溶液A孵育30分钟。用流水冲洗至黄色消失。
      2. 吸去多余液体，将切片浸入天狼星红溶液B中2分钟。短暂冲洗后吸去多余液体。
      3. 将切片浸入天狼星红溶液C中30分钟，随后短暂冲洗1–2秒。
      4. 用三次无水乙醇（每次约3秒）脱水，再用三次二甲苯（每次5分钟）透明，中性树胶封片。
        注：在明场照明下，胶原纤维呈红色，背景为黄色。
  5. 图像采集与定量分析
    1. 使用数字切片扫描仪获取所有组织学图像。所有组别的切片均采用相同的照明、白平衡、曝光和放大倍数设置，并在每张图像中包含校准比例尺。
    2. 在图像分析前校准空间尺度。加载一张与研究图像具有相同分辨率和像素尺寸的含比例尺参考图像。在“测量 > 校准 > 设置系统”中创建新的空间校准，单位设为μm，通过将校准点与比例尺对齐来定义像素与微米的转换关系，保存校准参数并应用于所有图像。
    3. 加载一张马松三色染色切片，使用不规则感兴趣区域（AOI）工具勾勒左心室轮廓。排除心室腔、右心室及组织处理伪影，记录左心室总面积。
    4. 打开“测量 > 计数/尺寸”，选择“选择颜色”以打开分割对话框。选择基于颜色立方体（Color Cube Based）的分割方法，参数设置如下：灵敏度 = 4，扩展选择1个颜色索引，最小颜色尺寸 = 1像素，核大小 = 3 × 3。所有切片均应用相同的分割参数。
    5. 使用吸管工具选择蓝色胶原阳性像素作为种子点。仅在明确胶原阳性的区域取样，生成预览图像，确认掩膜覆盖胶原阳性区域，同时排除红色染色的心肌、心室腔和背景。如有必要，在应用掩膜前调整种子点。
      注：由于不同切片间染色强度可能存在微小差异，需为每张切片重新选择种子像素。所有图像的分割参数（灵敏度、扩展程度、最小颜色尺寸和核大小）必须保持一致，仅当预览显示胶原阳性区域被完全覆盖且非胶原结构被有效排除时，方可接受该分割结果。
    6. 应用分割掩膜并关闭对话框。在“测量 > 选择测量项”中选择“面积”，点击“计数”，打开“视图 > 统计”，记录胶原阳性区域的总和。
    7. 通过将胶原阳性面积除以左心室总面积计算胶原容积分数（CVF），结果以百分比表示。

9. 组织透明化与三维冠状动脉成像

  1. 冠状血管的荧光标记
    1. 向小鼠尾静脉侧支注射 200 µL 的 2% 伊文思蓝溶液，以标记冠状血管系统。将小鼠放回笼中，使其在体内循环 60 分钟。
    2. 将小鼠放入连接麻醉机的诱导室（16 × 10 × 11 cm）中，使用 4% 异氟烷诱导麻醉。通过颈椎脱位法处死小鼠，打开胸腔，完整取出心脏，用 PBS 冲洗，并在 4°C 条件下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 24 小时。
      注意：PFA 可能为致癌物，且对呼吸道和皮肤具有刺激性。操作 PFA 时应在化学通风橱中进行，并佩戴无菌医用手套、实验服和眼部防护装备，废弃物应按照机构规定的危险废物处理程序处置。
    3. 在反渗透水中配制 3% 琼脂糖溶液，将固定后的心脏以结扎部位朝向合适成像方向包埋。使用微升注射器在结扎区域周围的八个位点各注射 1 µL DAPI 溶液，并在室温下孵育样品 2 天。
  2. 组织透明化
    1. 根据制造商说明书，使用 FDISCO（具有优异荧光保持能力的溶剂清除器官三维成像）组织透明化试剂盒进行组织透明化处理。该试剂盒包含六种试剂（A–F）：试剂 A、B、C、D 和 E 分别为含 50%、70%、80%、100% 和 100% 四氢呋喃（THF）的水溶液，试剂 F 为二苄基醚。
      注意：THF 高度易燃，储存过程中可形成爆炸性过氧化物，且对呼吸道和皮肤具有刺激性。二苄基醚对皮肤和眼睛具有刺激性。所有试剂均应在化学通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备，包括无菌医用手套、实验服和眼部防护装备。废弃物应按照机构规定的危险废物处理程序处置。
    2. 将每颗心脏依次在试剂 A、B、C、D 和 E 中孵育，每种试剂孵育 6 小时。每颗心脏使用 10 mL 试剂，确保样品与试剂的体积比不低于 1:5。
    3. 将样品转移至试剂 F 中继续孵育，直至组织呈现光学透明状态，通常约需 1 小时。
    4. 所有透明化步骤均在 6°C–8°C 条件下轻柔振荡进行。将样品置于用铝箔包裹的玻璃容器中，并在整个过程中避光，以保护荧光信号。
  3. 光片荧光成像
    1. 将透明化后的样品安装至样品支架上。使用配备 4× 物镜（数值孔径 = 0.28；工作距离 = 20.0 mm）的光片荧光显微镜进行成像。
    2. 将安装好的样品浸入成像室内的二苄基醚中。从两侧照射样品，并依次在 405 nm 激发 DAPI，在 647 nm 激发伊文思蓝。
    3. 设置如下采集参数：对于 405 nm 通道，激光强度设为 3,000 任意单位，曝光时间为 30 ms；对于 647 nm 通道，激光强度设为 4,000 任意单位，曝光时间为 30 ms。所有图像均以 6 μm 的 z 轴步长和 1,024 × 1,024 像素的图像分辨率采集。
    4. 将相机采集模式设为 XYCZT，即首先采集横向（XY）图像，随后依次进行通道采集（C）、轴向步进（Z）和时间点采集（T），具体顺序由成像软件配置决定。
  4. 图像数据处理与三维重建
    1. 使用显微镜配套的图像处理软件对原始 TIFF 图像文件进行拼接。通过选择 文件 > 转换为 Imaris，将拼接后的图像文件转换为 IMS 格式。
    2. 将转换后的 IMS 文件导入三维分析软件。使用默认渲染设置生成体渲染重建图像，并利用 Snapshot 模块导出代表性图像。
      注：三维重建使用软件默认的渲染流程生成，未作任何修改。未进行图像分割、阈值设定、去噪、背景扣除或其他预处理操作。重建图像仅用于冠状血管系统的定性可视化，不适用于定量分析。

10. 统计分析

  1. 所有数据均以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。使用 GraphPad Prism 软件（版本 5.0）进行统计分析。
  2. 将实验单位定义为单个动物。每组分析 n = 8 只小鼠，用于所有功能、生物标志物及组织形态计量学终点指标。
  3. 采用编码样本标识符进行数据收集与分析，同时保持研究者对分组信息的盲法。仅在完成所有定量分析后揭盲分组信息。
  4. 在 GraphPad Prism（版本 5.0）中，使用 Shapiro–Wilk 检验评估数据正态性，使用 Levene 检验评估方差齐性，再据此选择适当的统计检验方法。
  5. 当满足正态性和方差齐性假设时，采用双尾非配对 Student t 检验比较两组数据；否则，采用 Mann–Whitney U 检验。
  6. 将 P < 0.05 视为具有统计学显著性。统计学显著性以 P < 0.05、P < 0.01 和 P < 0.001 表示。

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结果

房室沟（AIS）作为解剖标志，用于定位左前降支冠状动脉（LAD）并确定结扎部位（图1A–C）。在确定AIS后，按照图2A–L所示，依次进行心肌梗死（MI）诱导的外科手术流程，包括开胸、心脏暴露、LAD结扎、胸腔闭合及术后恢复。该简化方案可实现小鼠心肌梗死的快速且可重复的诱导。该操作需要经过较长时间的动手训练才能稳定实施；其中气管插管和基于AIS引导的结扎是学习曲线最陡峭的两个步骤。在初期训练阶段，术后7天内的围手术期死亡率可能高达50%或以上，模型构建成功率可能降至30%或更低。一旦掌握这些技术，手术成功率可稳定超过90%。在本研究中，术后前7天内未发生围手术期死亡。所有培训操作均在相同的经批准的机构动物使用方案下进行。

结扎左前降支（LAD）后，观察到典型的心电图异常，包括明显的Q波加深、ST段抬高（呈上凸形态）、超急性期T波高耸（通常在亚急性期演变为T波倒置）、QRS波群电压增高且波幅增宽，以...

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讨论

近年来，心肌梗死（MI）的临床和实验模型在心血管研究中变得日益重要，但关于MI的发病机制及其治疗策略仍有许多问题尚未解决。本文介绍了一种建立小鼠MI模型的优化方法，其中多个关键操作步骤需要特别注意。第一个关键步骤是气管插管。一些先前的方案通过气管切开术建立气道，该方法需切开颈部皮肤并分离组织以暴露气管后再进行插管13；另一些方案保留经口插管方式，但建议采用颈部正中切口以改善操作过程中的视野14。与上述两种方法不同，本方案使用喉镜照亮口咽部，并在直视声门的情况下进行经口气管插管，无需颈部切口。尽管该方法对操作者的技术熟练度要求更高，但可避免颈部组织创伤，降低感染和术后疼痛的风险，并缩短手术时间。插管过程中最常见的错误是误将导管插入食管。若通气时胸廓无起伏，且呼气时气管导管内无冷凝现象，应立即撤出导管并重新插管。只有在确认双侧胸壁对称起伏后，方可连接呼吸机。

第二步，也是最关键的一步，是识别左前降支冠状动脉（LAD）并准确放置结扎线。传统方法在此阶段面临若干挑战。小鼠的静息心率约为500–6...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了四川省科技计划项目（编号：2026NSFSC1823 和 2022YFS0618）、四川省中医药管理局项目（四川省中医药管理局办公室〔2024〕7 号）、四川省中西医结合学会项目（编号：ZXY2025019）以及西南医科大学项目（资助编号：2023ZYYQ04 和 2023ZYYQ17）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 无菌生理盐水Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.-头孢唑林钠重悬
3% 琼脂糖Sigma-AldrichA0169样品包埋
4% 多聚甲醛Sigma-Aldrich158127组织固定
无水乙醇成都科龙化工试剂有限公司05.001.0170A组织脱水；易燃
酸性品红阿拉丁A104916-100gMasson 三色染色中 Ponceau–酸性品红溶液的配制
AcqKnowledge 软件BIOPAC SystemsAcqKnowledge 4.0心电图采集与分析
0.5% 氨水溶液成都科龙化工试剂有限公司05.001.2528A苏木精-伊红染色中的返蓝步骤
苯胺蓝，酸溶性阿拉丁A111200-100gMasson 三色染色中苯胺蓝溶液的配制
无菌医用手套南昌飞祥乳胶制品有限公司-化学与生物防护
布托啡诺青海制药厂有限公司H10940181术后镇痛
注射用头孢唑林钠石药集团中诺药业（石家庄）有限公司-围手术期抗生素预防
棉签石家庄康尔泰医疗器械有限公司-心外膜擦拭及无菌准备
DAPI 染色液Thermo FisherD1306细胞核标记
脱毛膏Veet-胸部去毛
数字切片扫描仪3DHISTECHPannoramic MIDI II全切片成像
心电图放大器BIOPAC SystemsECG100C心电图信号放大
心电图记录系统BIOPAC SystemsMP160心电图记录
小鼠B型利钠肽ELISA试剂盒泉州瑞新生物科技有限公司RXW202726M血清BNP定量
小鼠白细胞介素-1β ELISA试剂盒泉州瑞新生物科技有限公司RX203063M血清IL-1β定量
小鼠核因子-κB p65 ELISA试剂盒泉州瑞新生物科技有限公司RX201879M血清NF-κB p65定量
小鼠肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒泉州瑞新生物科技有限公司RX202412M血清TNF-α定量
包埋盒江苏世泰22022组织包埋
气管插管导管，20 G深圳百力德生物科技有限公司B11103经口插管；外径约0.9–1.0 mm；使用前剪至约15 mm
伊红Y，醇溶性合肥巴斯夫生物科技有限公司Y0310-100G苏木精-伊红染色中的细胞质复染
伊文思蓝JarvisbioA312001冠状血管标记
精细镊子RWD生命科学F12011-10组织操作及心包切开
显微外科精细镊子RWD生命科学FC12002T-08显微外科组织操作
精细剪刀RWD生命科学S12000-09眼科剪用于皮肤切口与解剖
冰醋酸成都科龙化工试剂有限公司-Masson三色染色中1%醋酸溶液的配制
载玻片江苏世泰80312/80302切片贴附
玻璃珠灭菌器RWD生命科学RS3002动物间器械灭菌
GraphPad Prism 软件GraphPad Software版本 5.0统计分析
加热垫RWD生命科学69020术后体温调节
苏木精染色液武汉赛维尔生物科技有限公司G1004苏木精-伊红染色中的细胞核染色
辣根过氧化物酶标记检测抗体泉州瑞新生物科技有限公司随ELISA试剂盒提供ELISA检测
盐酸成都科龙化工试剂有限公司05.001.1337A苏木精分化用酸性酒精的配制
Image-Pro Plus 软件Media Cybernetics版本 6.0胶原体积分数定量
Imaris 软件Bitplane版本 7.2.3三维重建与分析
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异氟烷麻醉系统RWD生命科学TAIJI-IE异氟烷输送
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LitScan 软件光启科技版本 3.31图像拼接与转换
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正置光学显微镜LeicaDM500组织学成像
切片机刀片EprediaMX35 ULTRA石蜡切片
改良天狼星红染色试剂盒武汉赛维尔生物科技有限公司G1078胶原染色；包含A、B、C液
正丁醇成都科龙化工试剂有限公司05.001.0886A组织脱水与透明；易燃
中性封片树脂上海一洋YSQN41-91玻片封片
尼龙缝线，3/8圆弧7-0带针宁波医用针厂有限公司-左前降支冠状动脉结扎
尼龙缝线，5-0宁波医用针厂有限公司-胸腔与皮肤缝合
尼龙缝线，6-0宁波医用针厂有限公司-胸壁暴露与牵拉
石蜡包埋工作站武汉俊杰电子有限公司JB-L5组织包埋
石蜡NANA组织浸润与包埋
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP3813组织洗涤与试剂稀释
磷钼酸天津奥普生物化学有限公司-Masson三色染色分化
Ponceau 2R阿拉丁P104989-25gMasson三色染色中Ponceau–酸性品红溶液的配制
重铬酸钾郑州派尼化学试剂厂7778-50-9Masson三色染色媒染剂
聚维酮–碘SingleLadyGB26368-2010皮肤消毒
反渗透水实验室纯化不适用溶液配制
轮转式切片机徕卡仪器（上海）RM2016石蜡切片
样品架适配器光启科技随LiToneXL提供透明化样品在光片成像中的固定
皮肤粘贴胶带青岛舒尔茨生物科技有限公司-固定四肢与尾巴
盖玻片江苏世泰80340-1630封片
玻片烘干机绍兴鲁越101-3B玻片干燥
终止液泉州瑞新生物科技有限公司随ELISA试剂盒提供ELISA反应终止
底物溶液A和B泉州瑞新生物科技有限公司随ELISA试剂盒提供ELISA显色
组织漂浮浴武汉俊杰电子有限公司JK-5/6切片漂展
组织处理机武汉俊杰电子有限公司JT-12S自动化组织处理
组织透明试剂盒，试剂A–FJarvisbioJA11012基于溶剂的组织透明化
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超声分析软件Fujifilm VisualSonicsVevoLAB 3.2.6超声心动图数据分析
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超声成像系统Fujifilm VisualSonicsVevo 3100超声心动图
V型眼睑牵开器宿迁盛世医疗器械有限公司SS5009G肋间与肋骨牵拉
洗涤缓冲液泉州瑞新生物科技有限公司随ELISA试剂盒提供ELISA板洗涤
水纯化系统四川优莱纯超纯科技有限公司UPT-II-20T反渗透水制备
二甲苯成都科龙化工试剂有限公司05.001.0586A组织透明与脱蜡；易燃且具神经毒性

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冠状动脉结扎前室间沟异氟烷麻醉气管插管心电图验证超声心动图组织病理学染色

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