miR-488-3p 可能作为类风湿关节炎（RA）的一种新型非侵入性诊断标志物。miR-488-3p 通过 ROCK1 调控滑膜细胞的生物学功能，在类风湿关节炎患者中，其表达水平与疾病严重程度呈显著负相关。
本文内容
摘要
摘要
由于现有生物标志物的局限性，类风湿关节炎（RA）的诊断仍然具有挑战性。本研究旨在探讨血清中miR-488-3p作为RA生物标志物的潜力，并揭示其潜在的作用机制。研究共纳入135例RA患者、130例骨关节炎（OA）患者和125名健康对照者。采用RT-qPCR检测miR-488-3p的表达水平。通过功能实验（CCK-8、流式细胞术、ELISA）和靶点验证实验（荧光素酶报告基因、RIP）分析其作用机制。结果显示，RA患者血清中miR-488-3p的表达水平显著低于骨关节炎（OA）患者和健康对照组（p ＜ 0.001）。ROC曲线分析表明，miR-488-3p在区分RA患者与健康对照及OA患者方面具有较高的诊断准确性。miR-488-3p的表达水平与红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）以及DAS28评分呈负相关。功能验证显示，miR-488-3p过表达可抑制滑膜细胞的增殖和炎症反应，并诱导细胞凋亡。机制研究表明，miR-488-3p可直接靶向Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCK1），从而介导其保护作用。血清miR-488-3p有望成为一种新型无创性RA诊断标志物，并对滑膜细胞损伤具有保护作用。
引言
类风湿关节炎（RA）是一种常见的自身免疫性疾病，其特征为滑膜炎症、关节侵蚀和破坏1,2。全球RA的患病率约为0.5%–1%3，严重影响患者的生活质量和工作能力。该病起病隐匿，早期症状常不典型，容易误诊或漏诊4。随着病情进展，可导致关节畸形、功能丧失，甚至增加心血管疾病等并发症的风险5，给患者、家庭及医疗系统带来沉重负担。
目前，类风湿关节炎（RA）的诊断需要结合临床症状、体征、实验室检查和影像学评估6。常用的实验室指标包括红细胞沉降率（ESR）和C反应蛋白（CRP），二者为系统性炎症的非特异性标志物；此外还包括类风湿因子（RF）和抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP），它们是RA重要的血清学生物标志物7,8。然而，这些传统生物标志物存在局限性：RF在部分健康人群及其他自身免疫性疾病患者中也可呈阳性（假阳性率约为5%）；anti-CCP虽然特异性高（>95%），但在疾病早期敏感性有限（约60–70%）4,9，且部分RA患者始终表现为血清阴性10。因此，寻找更敏感且特异的生物标志物，对于RA的早期诊断、疾病监测及预后评估具有重要意义11。
微小RNA（miRNA）是一类内源性非编码调控RNA分子，长度约为22–25个碱基12,13。研究发现，miRNA在多种疾病的发生发展中发挥关键调控作用，其异常表达与疾病发病机制密切相关13,14,15，因此miRNA有望成为疾病诊断和治疗监测的潜在生物标志物。近年来，miRNA在类风湿关节炎（RA）中的作用受到越来越多关注16。研究表明，多种miRNA在RA患者的血清、滑膜组织及外周血单个核细胞（PBMCs）中呈现表达失调（如miR-146a、miR-155等）17,18,19。这些miRNA通过调控炎症因子的产生、促进滑膜细胞增殖与侵袭以及影响破骨细胞分化等方式参与RA的发病过程20。其中，miR-488定位于人类1号染色体q25.2区域21，既往研究已证实其具有神经保护作用：它在胶质瘤22和神经母细胞瘤23的进展中发挥调控作用，值得注意的是，miR-488-3p可促进骨关节炎（OA）中骨关节炎软骨细胞的凋亡24。尽管OA与RA是不同的关节疾病，但二者在滑膜炎症和软骨破坏等病理过程中存在共同机制25。我们推测miR-488-3p可能通过调控相似的靶向通路在RA中发挥作用。然而，miR-488-3p在RA中的具体作用及其潜在机制尚未明确。
该研究探讨了类风湿关节炎（RA）患者血清中miR-488-3p表达水平的变化及其与疾病活动度和临床指标的关系，旨在评估其作为RA无创诊断标志物的潜在价值。本研究为RA的早期筛查和疾病进展预测提供了新的见解，从而有助于改善RA患者的预后。
方案
本研究经合肥京东方医院伦理委员会批准（批准号：2021–1），所有参与者在入组前均签署了书面知情同意书。
患者与标本
本研究从合肥京东方医院风湿免疫科招募了135名类风湿关节炎患者（根据2010年ACR/EULAR分类标准诊断），从骨科招募了130名骨关节炎患者（根据2018年中国医学会骨关节炎诊断标准诊断），并从同一家医院体检中心招募了125名年龄和性别匹配的健康对照者。所有参与者年龄为30至80岁。通过详细的病史回顾、体格检查和实验室检测，确认健康对照者无自身免疫性疾病、关节疾病及急性感染。若参与者合并其他自身免疫性疾病、在过去3个月内有感染或外伤史、患有恶性肿瘤，或处于妊娠或哺乳期，则被排除在外。
取样与制备
采集所有研究对象的空腹静脉血。室温静置凝固30分钟后，以1500 × g 离心15分钟分离血清。血清储存于-80°C，待后续分析使用。
临床和血清学标志物的检测
为了全面评估疾病状态和炎症活动性，采用标准化的临床实验室方法检测了临床和血清学生物标志物。使用魏氏法测定红细胞沉降率（ESR），以评估非特异性全身性炎症。采用免疫比浊法测定C反应蛋白（CRP），正常参考值为<10 mg/L，用于评价急性期炎症反应。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测类风湿因子（RF），正常参考值为≤20 IU/mL。采用第二代ELISA法检测抗环瓜氨酸肽（anti-CCP）抗体，为类风湿关节炎（RA）的诊断提供血清学依据。
细胞系与培养
采用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良培养基（DMEM）培养类风湿关节炎患者来源的人成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）。细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养，所有实验均使用第3至第6代之间的细胞。
RNA 提取与定量实时逆转录 PCR
采用RNA提取试剂从血清样本中提取总RNA。根据制造商说明书，使用miRNA第一链合成试剂盒对miRNA进行逆转录，使用逆转录试剂盒对信使RNA（mRNA）目的基因进行逆转录。采用基于SYBR Green的PCR预混液，在实时PCR系统上进行定量实时聚合酶链式反应（RT-qPCR）。热循环程序设置为：95 °C 预变性30 s；随后进行40个扩增循环（95 °C 变性5 s，60 °C 退火/延伸30 s）。每个样本均设三个重复。U6小核RNA（U6 snRNA）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）分别作为miRNA和mRNA归一化的内参基因。引物序列已汇总于补充表1中。采用2−ΔΔCt法计算miR-488-3p及其目的基因的相对表达水平。同时分析miR-488-3p过表达或抑制后目的基因mRNA水平的变化，以验证其调控关系。
细胞转染
将HFLS-RA细胞以每孔5 × 105个细胞的密度接种至6孔板中。根据制造商说明书，使用基于脂质体的转染试剂对细胞进行转染。转染分组包括单转染组和共转染组。单转染组包括：1）对照组——未转染的细胞；2）mimic阴性对照（NC）——转染miR-488-3p mimic阴性对照的细胞；3）miR-488-3p mimic组——转染miR-488-3p mimic的细胞；4）inhibitor阴性对照（NC）——转染miR-488-3p inhibitor阴性对照的细胞；5）miR-488-3p inhibitor组——转染miR-488-3p inhibitor的细胞。共转染组包括：1）miR-488-3p mimic + 过表达阴性对照（oe-NC）——同时转染miR-488-3p mimic和ROCK1过表达载体阴性对照的细胞；2）miR-488-3p mimic + oe-ROCK1——同时转染miR-488-3p mimic和ROCK1过表达载体的细胞。所有转染序列均已汇总于补充表1中。ROCK1的过表达载体通过将编码序列（CDS）区克隆至pcDNA 3.1质粒中构建而成。转染后48小时，细胞可用于后续实验。
细胞功能检测
细胞增殖实验（细胞计数试剂盒-8 [CCK-8]）：将转染后的HFLS-RA细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种至96孔板中，每组设三个复孔。转染后0、24、48和72小时，每孔加入10 µL CCK-8溶液，随后在37 °C孵育2小时。使用酶标仪在450 nm（检测波长）和630 nm（参考波长）处测定吸光度。以0小时为基准计算相对增殖率。
细胞凋亡检测（流式细胞术）： 采用Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒分析细胞凋亡情况。将细胞转染相应的质粒后，经胰蛋白酶消化收集细胞，通过流式细胞术测定细胞凋亡率。
炎症因子检测（酶联免疫吸附测定 [ELISA]）：将 HFLS-RA 细胞接种至 24 孔板中，并转染指定的 miR-488-3p 模拟物、miR-488-3p 抑制剂或相应的阴性对照，转染时间为 48 小时。使用 ELISA 试剂盒对细胞培养上清液中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的浓度进行定量检测。
靶点验证
靶基因预测：使用 TargetScan 数据库预测 ROCK1 为 miR-488-3p 的下游靶基因26。同时鉴定了 miR-488-3p 与 ROCK1 3′-非翻译区（3′UTR） 之间的预测结合位点。
双荧光素酶报告基因检测：将ROCK1的野生型或突变型3′非翻译区（3′UTR）克隆至pGL3质粒中。预测的结合位点及突变位点如图4所示。将miR-488-3p模拟物或抑制剂与构建好的载体共同转染至HEK-293T细胞中27。转染miR-488-3p模拟物或抑制剂48小时后检测荧光素酶活性。
RNA 免疫沉淀（RIP）：将 HFLS-RA 细胞与抗 Argonaute 2（Ago2）抗体（RRID: AB_2882071，1:200 稀释）或免疫球蛋白 G（IgG）对照抗体（RRID: AB_2819160，1:5000 稀释）孵育，随后提取 RNA，并按照上述方法对 ROCK1 mRNA 富集情况进行定量 PCR（qPCR）分析。
统计学分析
采用 SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) 和 GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798) 进行统计学分析。计量资料以均值 ± 标准差 (SD) 表示。所有实验均设置三个生物学重复，每个生物学重复进行三次技术重复。原始数据已附在补充材料中。在进行参数统计检验前，使用正态概率 (P-P) 图对数据进行评估。连续型基线变量（如年龄、体重指数 [BMI] 等）的比较采用独立样本 t 检验，分类变量（如性别等）的比较采用卡方检验。基因表达水平的比较采用独立样本 t 检验。不同时间点细胞增殖变化采用重复测量方差分析 (ANOVA) 进行分析，而流式细胞术测定的细胞凋亡率比较则采用单因素方差分析 (one-way ANOVA)。相关性分析根据变量是否符合正态分布分别采用 Spearman 相关（非正态分布变量）和 Pearson 相关（正态分布变量）。诊断效能通过受试者工作特征 (ROC) 曲线分析进行评估。最佳截断值、敏感性和特异性通过最大 Youden 指数确定。所有统计检验均为双侧检验，以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。
结果
研究参与者的基本特征
本研究纳入了125名健康对照者、130名骨关节炎（OA）患者和135名类风湿关节炎（RA）患者进行系统分析（表1）。三组在年龄（p = 0.191）、性别比例（p = 0.203）和体重指数（BMI）（p = 0.562）等基线特征上无显著差异，确保了研究人群的可比性。在疾病特征方面，RA组的红细胞沉降率（ESR）（82.63 ± 40.32 vs. 18.39 ± 6.38 mm/h，p < 0.001）和C反应蛋白（CRP）水平（56.33 ± 38.07 vs. 10.54 ± 4.98 mg/L，p < 0.001）显著高于OA组，反映了系统性炎症的程度。同时，与RA相关的血清学标志物类风湿因子（RF）在70.37%（95/135）的患者中呈阳性，血清浓度显著更高（144.13 ± 81.05 vs. 5.10 ± 1.37 IU/mL，p < 0.001）；RA患者的抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP）阳性率为56.30%（76/135），DAS28评分为4.12 ± 1.36。
RA 患者中 miR-488-3p 的表达特征及其诊断价值
与骨关节炎（OA）患者和健康对照组相比，类风湿关节炎（RA）患者血清中miR-488-3p的表达水平显著下调（p < 0.0001，图1A）。ROC曲线分析显示，miR-488-3p在区分RA与OA及健康对照组方面具有较高的诊断准确性：在区分RA与健康对照组时，其AUC值为0.931（95% CI：0.896–0.967），敏感性为96.15%（95% CI：91.31%–98.35%），特异性为80.95%（95% CI：73.22%–86.85%，p < 0.001，图1B）；在区分RA与OA患者时，AUC值为0.800（95% CI：0.747–0.854），敏感性为85.93%（95% CI：79.06%–90.80%），特异性为66.15%（95% CI：57.66%–73.72%，p < 0.001，图1C）。多变量逻辑回归分析确定miR-488-3p是与RA发病风险相关的独立因素（OR = 0.166，95% CI：0.097–0.284；表2）。
miR-488-3p 与类风湿关节炎临床指标的相关性分析
血清miR-488-3p表达水平与类风湿关节炎（RA）的关键临床指标呈显著负相关，包括ESR、CRP、RF和DAS28（均 p < 0.001；表3）。具体而言，miR-488-3p与ESR（r = −0.718）、CRP（r = −0.726）、RF（r = −0.805）以及DAS28评分（r = −0.836）均呈负相关（表3）。
miR-488-3p 的过表达抑制 HFLS-RA 细胞的增殖和炎症反应，并诱导细胞凋亡
为了研究miR-488-3p对HFLS-RA功能的影响，我们通过转染mimics和inhibitors来调控其表达水平。RT-qPCR分析证实，与对照组相比，miR-488-3p mimic组中miR-488-3p的表达水平显著升高（p = 0.0001），而miR-488-3p inhibitor组的表达水平则显著降低（p = 0.0003，图2A）。CCK-8实验结果显示，miR-488-3p过表达抑制了细胞增殖，在24 h、48 h和72 h时均显著低于对照组（p = 0.0208，p < 0.0001，p = 0.0036），而抑制miR-488-3p的表达则显著促进细胞增殖（图2B）。流式细胞术结果显示，miR-488-3p过表达显著促进细胞凋亡（p = 0.0033，图2C）。
随后，我们进行了ELISA实验，以研究miR-488-3p表达上调对炎症细胞因子水平的影响。结果显示，当miR-488-3p过表达时，炎症细胞因子（IL-6、TNF-α和IL-1β）的水平显著降低（p < 0.0001，图3A-C），而抑制miR-488-3p表达则产生相反的效果。这些显著的调控效应在三次独立的生物学重复实验中均得到验证，且阴性对照组未显示显著变化（p > 0.05）。
MiR-488-3p 调控 ROCK1 分子的 ROCK1 表达
为了阐明 miR-488-3p 在类风湿关节炎（RA）疾病进展中作用的分子机制，我们探索了 miR-488-3p 的下游靶基因。生物信息学分析显示，miR-488-3p 可能与 ROCK1 的 3'非翻译区（3'UTR）结合（图 4A）。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，当 miR-488-3p 模拟物与野生型 ROCK1 3'UTR 共转染时，荧光素酶活性显著降低（p < 0.0001）；而抑制 miR-488-3p 表达后，荧光素酶活性显著升高（p < 0.0001）；但在结合位点发生突变后，该调控作用无明显变化（图 4B）。RNA 免疫沉淀（RIP）实验进一步验证了这一调控关系，结果显示，与 IgG 对照组相比，Ago2 抗体富集复合物中 ROCK1 mRNA 的表达水平显著升高（p < 0.0001，图 4C）。
此外，在临床样本中，ROCK1 的表达模式与 miR-488-3p 相反，在类风湿关节炎患者中，ROCK1 的表达水平相较于骨关节炎患者和健康对照组均显著上调（图 4D）。在 HFLS-RA 细胞中，RT-qPCR 结果显示，miR-488-3p 过表达可导致 ROCK1 表达显著降低（p = 0.0093），而抑制 miR-488-3p 则显著增加 ROCK1 的表达（p = 0.0003，图 4E）。
ROCK1 介导 miR-488-3p 对 HFLS-RA 细胞的调控作用
在HFLS-RA细胞中，miR-488-3p过表达对ROCK1表达的抑制作用可被转染ROCK1过表达载体所逆转（图5A）。类似地，ROCK1过表达减弱了miR-488-3p过表达对细胞增殖的抑制作用（图5B）。此外，ROCK1过表达还逆转了miR-488-3p过表达所增强的细胞凋亡（图5C），并恢复了因miR-488-3p过表达而被抑制的炎症细胞因子水平（图5D）。
图1. 类风湿关节炎（RA）、骨关节炎（OA）患者及健康对照者中miR-488-3p的表达水平与诊断效能。 （A）RA患者、OA患者及健康对照者中miR-488-3p相对表达水平的比较。（B）miR-488-3p用于区分RA患者与健康对照者的受试者工作特征（ROC）曲线分析。（C）miR-488-3p用于区分RA患者与OA患者的ROC曲线分析。 AUC，曲线下面积；CI，置信区间。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. miR-488-3p 在 HFLS-RA 细胞中的功能作用。(A) 通过定量反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测转染后 HFLS-RA 细胞中 miR-488-3p 的相对表达水平。(B) miR-488-3p 过表达与抑制对细胞增殖的影响。(C) miR-488-3p 过表达与抑制对细胞凋亡的影响。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。所有测量均进行三次生物学重复，每次包含三次技术重复。p < 0.05 表示组间差异具有统计学意义。请点击此处查看该图的高清版本。
图3. miR-488-3p对炎症细胞因子分泌的影响。（A）白细胞介素-6（IL-6）。（B）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。（C）白细胞介素-1β（IL-1β）。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞因子浓度。数据以均值±标准差（SD）表示。所有实验均进行三次生物学重复，每次生物学重复包含三次技术重复。 请点击此处查看本图的放大版本。
图 4．验证 miR-488-3p 靶向调控 ROCK1 的分子机制。（A）miR-488-3p 在 ROCK1 基因 3′-非翻译区（3′UTR）内的预测结合位点。（B）双荧光素酶报告基因检测结果，显示 miR-488-3p 与野生型或突变型 ROCK1 3′UTR 的相互作用。（C）RNA 免疫共沉淀（RIP）实验结果，显示在 Argonaute 2（Ago2）抗体富集的复合物中 ROCK1 信使 RNA（mRNA）的富集情况。（D）类风湿关节炎（RA）患者、骨关节炎（OA）患者及健康对照者中 ROCK1 的相对表达水平。（E）通过定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测转染 HFLS-RA 细胞后 ROCK1 的相对表达水平。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。所有实验均进行三次生物学重复，每次包含三次技术重复。请点击此处查看该图的高清版本。
图5．ROCK1在miR-488-3p调控HFLS-RA细胞中的作用。（A）转染细胞后HFLS-RA细胞中ROCK1表达的调控。（B）在miR-488-3p过表达条件下ROCK1过表达对细胞增殖的影响。（C）在miR-488-3p过表达条件下ROCK1过表达对细胞凋亡的影响。（D）在miR-488-3p过表达条件下ROCK1过表达对炎症细胞因子产生的影响。数据以均值±标准差表示。所有测量均进行三次生物学重复，每次包含三次技术重复。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 变量 | 对照组 (n = 125) | 骨关节炎组 (n = 130) | 类风湿关节炎组 (n = 135) | p 值 |
| 年龄（年） | 55.10 ± 9.30 | 57.21 ± 10.27 | 55.22 ± 11.61 | 0.191 |
| 性别（男/女） | 74/51 | 63/67 | 69/66 | 0.203 |
| BMI (kg/m2) | 22.79 ± 1.73 | 22.98 ± 1.98 | 23.04 ± 2.05 | 0.562 |
| 病程（年） | - | 7.96 ± 4.00 | 8.03 ± 3.83 | 0.882 |
| 抗CCP抗体阳性 (n/%) | - | - | 76 (56.30) | - |
| ESR (mm/h) | 18.39 ± 6.38 | 82.63 ± 40.32 | <0.001 | |
| CRP (mg/L) | 10.54 ± 4.98 | 56.33 ± 38.07 | <0.001 | |
| 类风湿因子阳性 | - | - | 95 (70.37) | |
| 类风湿因子 (IU/mL) | - | 5.10 ± 1.37 | 144.13 ± 81.05 | <0.001 |
| DAS28 | - | - | 4.12 ± 1.36 | - |
表1：研究参与者的基线特征。 三个研究组在人口统计学特征方面具有可比性。类风湿关节炎（RA）患者表现出炎症标志物和类风湿因子（RF）水平升高。
| 变量 | OR | 95%CI | p-值 |
| 年龄（年） | 1.411 | 0.822–2.422 | 0.211 |
| 性别（男性/女性） | 1.209 | 0.707–2.067 | 0.489 |
| BMI（kg/m2） | 1.336 | 0.778–2.295 | 0.293 |
| 疾病持续时间（年） | 1.13 | 0.663–1.929 | <0.001 |
| MiR-483-3p | 0.166 | 0.097–0.284 | <0.001 |
表2：多变量逻辑回归分析得出的骨关节炎进展为类风湿关节炎的独立相关因素。 miR-488-3p 被确定与骨关节炎患者发展为类风湿关节炎的风险相关。
| 项目 | miR-488-3p（类风湿关节炎） | p值 |
| 相关性(r) | ||
| ESR（mm/h） | -0.718 | <0.001 |
| CRP（mg/L） | -0.726 | <0.001 |
| RF（IU/mL） | -0.805 | <0.001 |
| DAS28 | -0.836 | <0.001 |
表3：miR-488-3p与类风湿关节炎患者临床病理特征的相关性。 miR-488-3p在类风湿关节炎患者中与ESR、CRP、RF及DAS28评分呈显著负相关。
补充表 1. 细胞转染和 PCR 实验的序列信息。 本研究中使用的引物序列和转染试剂已汇总。请点击此处下载该文件。
讨论
正如 Smolen 等人1在最新的类风湿关节炎（RA）诊断与治疗指南中所强调的，新型生物标志物的开发具有重要的临床价值。本研究证实，RA 患者血清中的 miR-488-3p 显著下调，并表现出良好的诊断效能，具有相对满意的敏感性和特异性。RA 的早期诊断一直是临床难题，现有的生物标志物对 RA 的诊断敏感性尚不充分，而 miR-488-3p 显著的诊断潜力可能弥补这一空白，尤其有助于血清学阴性 RA 患者的识别。与健康个体相比，RA 患者表现出更明显的全身性炎症。尽管骨关节炎（OA）患者主要表现为局部退行性关节病变，但也常伴有低度全身性炎症。因此，miR-488-3p 在 RA 患者与健康个体之间的鉴别效能明显高于其在 RA 与 OA 患者之间的鉴别效能。本研究未将 miR-488-3p 的诊断性能与已确立的临床生物标志物进行直接比较。本研究所纳入的患者均依据当前 RA 的临床金标准进行诊断，该标准已包含抗环瓜氨酸肽（anti-CCP）抗体、类风湿因子（RF）、红细胞沉降率（ESR）和 C 反应蛋白（CRP）等公认的生物标志物。在 OA 与 RA 患者之间，这些标志物表现出显著差异（表 1）。因此，该队列不适合用于直接比较 miR-488-3p 与这些已确立生物标志物的诊断性能，此类比较需要独立的验证队列。
此外，研究发现 miR-488-3p 的表达水平与类风湿关节炎（RA）的多种临床指标呈显著负相关，包括全身性炎症标志物（ESR、CRP）28 和自身抗体（RF）6。尤其具有临床意义的是，miR-488-3p 与疾病活动度评分（DAS28）呈强负相关。DAS28 是一个综合指数，基于关节肿胀、压痛、炎症程度及患者的临床状况来反映疾病活动度。因此，这些结果提示 miR-488-3p 可能作为 RA 疾病活动度的潜在生物标志物。同时，这也支持了 miR-488-3p 在 RA 发病机制中的调控作用，其可能通过抑制炎症信号通路或自身免疫反应来影响疾病进展29。
在功能实验中，我们发现 miR-488-3p 抑制了类风湿关节炎（RA）患者来源的 HFLS-RA 细胞的增殖，并促进其凋亡，同时显著减少了炎症性细胞因子（IL-6、TNF-α 和 IL-1β）的产生。HFLS-RA 细胞在 RA 的病理过程中发挥关键作用，其异常增殖和侵袭性生长可导致滑膜增生和关节破坏，而炎症因子的过度产生则进一步加剧局部和全身性炎症反应3031。因此，miR-488-3p 对 HFLS-RA 细胞功能的调控可能直接抑制 RA 中的滑膜侵袭和骨侵蚀，为开发新型靶向治疗策略提供理论依据。既往研究表明，其他 miRNA（如 miR-155）可通过调控滑膜细胞功能影响 RA 的进展19，这进一步支持了我们的研究结果。
机制研究表明，miR-488-3p 可直接靶向 ROCK1，并通过与其 3'UTR 结合抑制其表达。ROCK1 是 Rho/ROCK 信号通路的关键效应分子，参与细胞骨架重排、炎症反应及纤维化过程32。既往研究显示，ROCK1 在类风湿关节炎滑膜细胞中高表达，并促进其迁移和侵袭能力33。与预期一致，ROCK1 的过表达显著逆转了 miR-488-3p 对 HFLS-RA 细胞的作用，表明其参与了 miR-488-3p 在类风湿关节炎进展中的调控作用。
然而，未来研究仍有许多工作有待开展。本研究中临床样本的miR-488-3p表达水平采用RT-qPCR检测，以内参基因U6进行标准化。既往研究对U6的稳定性报道存在争议，尤其是在血清等循环样本中。尽管本研究已开展初步实验以验证U6的稳定性，但U6潜在的表达波动仍构成一项局限性，可能增加误诊风险。因此，有必要采用更为稳定的内参基因进行进一步验证。另一方面，miR-488-3p的临床评估基于单中心队列，缺乏外部验证。样本量相对较小，受限于医院规模。此外，尚缺乏对miR-488-3p预后价值的纵向随访评估。上述局限性应在后续研究中予以解决。此外，部分研究表明 体内 miRNA的递送仍然是临床转化的主要挑战34未来的研究可通过构建条件性敲除小鼠或使用靶向递送系统（如纳米载体）在体内验证miR-488-3p的治疗潜力35.
综上所述，本研究揭示了miR-488-3p在类风湿关节炎（RA）诊断及潜在治疗靶向中的价值。miR-488-3p表现出良好的诊断效能，可抑制HFLS-RA细胞的增殖和炎症反应，同时促进细胞凋亡。这表明其可能是开发RA新型治疗策略的有前景的靶点。未来的研究应聚焦于以下三个方面：1）在大规模多中心队列中验证miR-488-3p的诊断稳定性；2）探索其与现有治疗药物（如JAK抑制剂或生物制剂）28的协同作用；3）优化miRNA递送系统，以提高其临床转化的可行性36。
数据可用性：
支持本研究结果的原始数据可在随本稿件提交的补充材料中获取。
披露
作者声明无利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒 | BD Bioscience | 556547 | 细胞凋亡 |
| 抗 Ago2 抗体 | Proteintech | 66720-1-Ig | RNA 免疫共沉淀 |
| CCK-8 溶液 | Dojindo | CK04 | 细胞增殖 |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher | 121000146 | 细胞培养 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10437028 | 细胞培养 |
| 流式细胞仪 | BD Bioscience | FACSCalibur | 细胞凋亡 |
| 人抗 CCP 抗体 ELISA 试剂盒 | Cusabio | CSB-E09077h | 抗 CCP 检测 |
| 人 RF-IgA ELISA 试剂盒 | Feien Biotechnology | EH4270 | RF 检测 |
| 人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA） | Cell Applications | HFLS-RA-200 | miR-488-3p 功能的体外验证 |
| IgG 对照抗体 | Abcam | ab205718 | RNA 免疫共沉淀 |
| 白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA 试剂盒 | R&D Systems | DY201-05 | 细胞内 IL-1β 浓度 |
| 白细胞介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒 | R&D Systems | D6050B | 细胞内 IL-6 浓度 |
| Liposome 转染试剂 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | 细胞转染 |
| 酶标仪 | BioTek | ELx808 | ELISA 检测 |
| Mir-X™ miRNA 第一链合成试剂盒 | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | 逆转录 |
| Opti-MEM 培养基 | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | 细胞转染 |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | ROCK1 过表达 |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | 细胞培养 |
| Phadia 250 实验室系统 | Thermo Fisher | Phadia 250 | 血液分析 |
| PrimeScript™ 逆转录试剂盒 | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | 逆转录 |
| 碘化丙啶（PI）/核糖核酸酶（RNase） | BD Bioscience | 550825 | 细胞凋亡 |
| QuantStudio 5 系统 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | PCR 检测 |
| RNAiso Plus 试剂 | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | RNA 提取 |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | PCR 扩增 |
| TargetScan 数据库 | TargetScan | N/A | 结合位点预测（https://www.targetscan.org/） |
| Tina-quant C-反应蛋白 IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | CRP 检测 |
| 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒 | R&D Systems | DY210-05 | 细胞内 TNF-α 浓度 |
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