miR-488-3p 可能作为类风湿关节炎（RA）的一种新型非侵入性诊断标志物。miR-488-3p 通过 ROCK1 调控滑膜细胞的生物学功能，在类风湿关节炎患者中，其表达水平与疾病严重程度呈显著负相关。
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miR-488-3p 可能作为类风湿关节炎（RA）的一种新型非侵入性诊断标志物。miR-488-3p 通过 ROCK1 调控滑膜细胞的生物学功能，在类风湿关节炎患者中，其表达水平与疾病严重程度呈显著负相关。
由于现有生物标志物的局限性，类风湿关节炎（RA）的诊断仍然具有挑战性。本研究旨在探讨血清中miR-488-3p作为RA生物标志物的潜力，并揭示其潜在的作用机制。研究共纳入135例RA患者、130例骨关节炎（OA）患者和125名健康对照者。采用RT-qPCR检测miR-488-3p的表达水平。通过功能实验（CCK-8、流式细胞术、ELISA）和靶点验证实验（荧光素酶报告基因、RIP）分析其作用机制。结果显示，RA患者血清中miR-488-3p的表达水平显著低于骨关节炎（OA）患者和健康对照组（p ＜ 0.001）。ROC曲线分析表明，miR-488-3p在区分RA患者与健康对照及OA患者方面具有较高的诊断准确性。miR-488-3p的表达水平与红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）以及DAS28评分呈负相关。功能验证显示，miR-488-3p过表达可抑制滑膜细胞的增殖和炎症反应，并诱导细胞凋亡。机制研究表明，miR-488-3p可直接靶向Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCK1），从而介导其保护作用。血清miR-488-3p有望成为一种新型无创性RA诊断标志物，并对滑膜细胞损伤具有保护作用。
类风湿关节炎（RA）是一种常见的自身免疫性疾病，其特征为滑膜炎症、关节侵蚀和破坏1,2。全球RA的患病率约为0.5%–1%3，严重影响患者的生活质量和工作能力。该病起病隐匿，早期症状常不典型，容易误诊或漏诊4。随着病情进展，可导致关节畸形、功能丧失，甚至增加心血管疾病等并发症的风险5，给患者、家庭及医疗系统带来沉重负担。
目前，类风湿关节炎（RA）的诊断需要结合临床症状、体征、实验室检查和影像学评估6。常用的实验室指标包括红细胞沉降率（ESR）和C反应蛋白（CRP），二者为系统性炎症的非特异性标志物；此外还包括类风湿因子（RF）和抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP），它们是RA重要的血清学生物标志物7,8。然而，这些传统生物标志物存在局限性：RF在部分健康人群及其他自身免疫性疾病患者中也可呈阳性（假阳性率约为5%）；anti-CCP虽然特异性高（>95%），但在疾病早期敏感性有限（约60–70%）4,9，且部分RA患者始终表现为血清阴性10。因此，寻找更敏感且特异的生物标志物，对于RA的早期诊断、疾病监测及预后评估具有重要意义11。
微小RNA（miRNA）是一类内源性非编码调控RNA分子，长度约为22–25个碱基12,13。研究发现，miRNA在多种疾病的发生发展中发挥关键调控作用，其异常表达与疾病发病机制密切相关13,14,15，因此miRNA有望成为疾病诊断和治疗监测的潜在生物标志物。近年来，miRNA在类风湿关节炎（RA）中的作用受到越来越多关注16。研究表明，多种miRNA在RA患者的血清、滑膜组织及外周血单个核细胞（PBMCs）中呈现表达失调（如miR-146a、miR-155等）17,18,19。这些miRNA通过调控炎症因子的产生、促进滑膜细胞增殖与侵袭以及影响破骨细胞分化等方式参与RA的发病过程20。其中，miR-488定位于人类1号染色体q25.2区域21，既往研究已证实其具有神经保护作用：它在胶质瘤22和神经母细胞瘤23的进展中发挥调控作用，值得注意的是，miR-488-3p可促进骨关节炎（OA）中骨关节炎软骨细胞的凋亡24。尽管OA与RA是不同的关节疾病，但二者在滑膜炎症和软骨破坏等病理过程中存在共同机制25。我们推测miR-488-3p可能通过调控相似的靶向通路在RA中发挥作用。然而，miR-488-3p在RA中的具体作用及其潜在机制尚未明确。
该研究探讨了类风湿关节炎（RA）患者血清中miR-488-3p表达水平的变化及其与疾病活动度和临床指标的关系，旨在评估其作为RA无创诊断标志物的潜在价值。本研究为RA的早期筛查和疾病进展预测提供了新的见解，从而有助于改善RA患者的预后。
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本研究经合肥京东方医院伦理委员会批准（批准号：2021–1），所有参与者在入组前均签署了书面知情同意书。
患者与标本
本研究从合肥京东方医院风湿免疫科招募了135名类风湿关节炎患者（根据2010年ACR/EULAR分类标准诊断），从骨科招募了130名骨关节炎患者（根据2018年中国医学会骨关节炎诊断标准诊断），并从同一家医院体检中心招募了125名年龄和性别匹配的健康对照者。所有参与者年龄为30至80岁。通过详细的病史回顾、体格检查和实验室检测，确认健康对照者无自身免疫性疾病、关节疾病及急性感染。若参与者合并其他自身免疫性疾病、在过去3个月内有感染或外伤史、患有恶性肿瘤，或处于妊娠或哺乳期，则被排除在外。
取样与制备
采集所有研究对象的空腹静脉血。室温静置凝固30分钟后，以1500 × g 离心15分钟分离血清。血清储存于-80°C，待后续分析使用。
临床和血清学标志物的检测
为了全面评估疾病状态和炎症活动性，采用标准化的临床实验室方法检测了临床和血清学生物标志物。使用魏氏法测定红细胞沉降率（ESR），以评估非特异性全身性炎症。采用免疫比浊法测定C反应蛋白（CRP），正常参考值为<10 mg/L，用于评价急性期炎症反应。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测类风湿因子（RF），正常参考值为≤20 IU/mL。采用第二代ELISA法检测抗环瓜氨酸肽（anti-CCP）抗体，为类风湿关节炎（RA）的诊断提供血清学依据。
细胞系与培养
采用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良培养基（DMEM）培养类风湿关节炎患者来源的人成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）。细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养，所有实验均使用第3至第6代之间的细胞。
RNA 提取与定量实时逆转录 PCR
采用RNA提取试剂从血清样本中提取总RNA。根据制造商说明书，使用miRNA第一链合成试剂盒对miRNA进行逆转录，使用逆转录试剂盒对信使RNA（mRNA）目的基因进行逆转录。采用基于SYBR Green的PCR预混液，在实时PCR系统上进行定量实时聚合酶链式反应（RT-qPCR）。热循环程序设置为：95 °C 预变性30 s；随后进行40个扩增循环（95 °C 变性5 s，60 °C 退火/延伸30 s）。每个样本均设三个重复。U6小核RNA（U6 snRNA）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）分别作为miRNA和mRNA归一化的内参基因。引物序列已汇总于补充表1中。采用2−ΔΔCt法计算miR-488-3p及其目的基因的相对表达水平。同时分析miR-488-3p过表达或抑制后目的基因mRNA水平的变化，以验证其调控关系。
细胞转染
将HFLS-RA细胞以每孔5 × 105个细胞的密度接种至6孔板中。根据制造商说明书，使用基于脂质体的转染试剂对细胞进行转染。转染分组包括单转染组和共转染组。单转染组包括：1）对照组——未转染的细胞；2）mimic阴性对照（NC）——转染miR-488-3p mimic阴性对照的细胞；3）miR-488-3p mimic组——转染miR-488-3p mimic的细胞；4）inhibitor阴性对照（NC）——转染miR-488-3p inhibitor阴性对照的细胞；5）miR-488-3p inhibitor组——转染miR-488-3p inhibitor的细胞。共转染组包括：1）miR-488-3p mimic + 过表达阴性对照（oe-NC）——同时转染miR-488-3p mimic和ROCK1过表达载体阴性对照的细胞；2）miR-488-3p mimic + oe-ROCK1——同时转染miR-488-3p mimic和ROCK1过表达载体的细胞。所有转染序列均已汇总于补充表1中。ROCK1的过表达载体通过将编码序列（CDS）区克隆至pcDNA 3.1质粒中构建而成。转染后48小时，细胞可用于后续实验。
细胞功能检测
细胞增殖实验（细胞计数试剂盒-8 [CCK-8]）：将转染后的HFLS-RA细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种至96孔板中，每组设三个复孔。转染后0、24、48和72小时，每孔加入10 µL CCK-8溶液，随后在37 °C孵育2小时。使用酶标仪在450 nm（检测波长）和630 nm（参考波长）处测定吸光度。以0小时为基准计算相对增殖率。
细胞凋亡检测（流式细胞术）： 采用Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒分析细胞凋亡情况。将细胞转染相应的质粒后，经胰蛋白酶消化收集细胞，通过流式细胞术测定细胞凋亡率。
炎症因子检测（酶联免疫吸附测定 [ELISA]）：将 HFLS-RA 细胞接种至 24 孔板中，并转染指定的 miR-488-3p 模拟物、miR-488-3p 抑制剂或相应的阴性对照，转染时间为 48 小时。使用 ELISA 试剂盒对细胞培养上清液中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的浓度进行定量检测。
靶点验证
靶基因预测：使用 TargetScan 数据库预测 ROCK1 为 miR-488-3p 的下游靶基因26。同时鉴定了 miR-488-3p 与 ROCK1 3′-非翻译区（3′UTR） 之间的预测结合位点。
双荧光素酶报告基因检测：将ROCK1的野生型或突变型3′非翻译区（3′UTR）克隆至pGL3质粒中。预测的结合位点及突变位点如图4所示。将miR-488-3p模拟物或抑制剂与构建好的载体共同转染至HEK-293T细胞中27。转染miR-488-3p模拟物或抑制剂48小时后检测荧光素酶活性。
RNA 免疫沉淀（RIP）：将 HFLS-RA 细胞与抗 Argonaute 2（Ago2）抗体（RRID: AB_2882071，1:200 稀释）或免疫球蛋白 G（IgG）对照抗体（RRID: AB_2819160，1:5000 稀释）孵育，随后提取 RNA，并按照上述方法对 ROCK1 mRNA 富集情况进行定量 PCR（qPCR）分析。
统计学分析
采用 SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) 和 GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798) 进行统计学分析。计量资料以均值 ± 标准差 (SD) 表示。所有实验均设置三个生物学重复，每个生物学重复进行三次技术重复。原始数据已附在补充材料中。在进行参数统计检验前，使用正态概率 (P-P) 图对数据进行评估。连续型基线变量（如年龄、体重指数 [BMI] 等）的比较采用独立样本 t 检验，分类变量（如性别等）的比较采用卡方检验。基因表达水平的比较采用独立样本 t 检验。不同时间点细胞增殖变化采用重复测量方差分析 (ANOVA) 进行分析，而流式细胞术测定的细胞凋亡率比较则采用单因素方差分析 (one-way ANOVA)。相关性分析根据变量是否符合正态分布分别采用 Spearman 相关（非正态分布变量）和 Pearson 相关（正态分布变量）。诊断效能通过受试者工作特征 (ROC) 曲线分析进行评估。最佳截断值、敏感性和特异性通过最大 Youden 指数确定。所有统计检验均为双侧检验，以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。
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研究参与者的基本特征
本研究纳入了125名健康对照者、130名骨关节炎（OA）患者和135名类风湿关节炎（RA）患者进行系统分析（表1）。三组在年龄（p = 0.191）、性别比例（p = 0.203）和体重指数（BMI）（p = 0.562）等基线特征上无显著差异，确保了研究人群的可比性。在疾病特征方面，RA组的红细胞沉降率（ESR）（82.63 ± 40.32 vs. 18.39 ± 6.38 mm/h，p < 0.001）和C反应蛋白（CRP）水平（56.33 ± 38.07 vs. 10.54 ± 4.98 mg/L，p < 0.001）显著高于OA组，反映了系统性炎症的程度。同时，与RA相关的血清学标志物类风湿因子（RF）在70.37%（95/135）的患者中呈阳性，血清浓度显著更高（144.13 ± 81.05 vs. 5.10 ± 1.37 IU/mL，p < 0.001）；R...
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正如 Smolen 等人1在最新的类风湿关节炎（RA）诊断与治疗指南中所强调的，新型生物标志物的开发具有重要的临床价值。本研究证实，RA 患者血清中的 miR-488-3p 显著下调，并表现出良好的诊断效能，具有相对满意的敏感性和特异性。RA 的早期诊断一直是临床难题，现有的生物标志物对 RA 的诊断敏感性尚不充分，而 miR-488-3p 显著的诊断潜力可能弥补这一空白，尤其有助于血清学阴性 RA 患者的识别。与健康个体相比，RA 患者表现出更明显的全身性炎症。尽管骨关节炎（OA）患者主要表现为局部退行性关节病变，但也常伴有低度全身性炎症。因此，miR-488-3p 在 RA 患者与健康个体之间的鉴别效能明显高于其在 RA 与 OA 患者之间的鉴别效能。本研究未将 miR-488-3p 的诊断性能与已确立的临床生物标志物进行直接比较。本研究所纳入的患者均依据当前 RA 的临床金标准进行诊断，该标准已包含抗环瓜氨酸肽（anti-CCP）抗体、类风湿因子（RF）、红细胞沉降率（ESR）和 C 反应蛋白（CRP）等公认的生物标志物。在 OA 与 RA 患者之间，这些标志物表现出显著差异（
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作者声明无利益冲突。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒 | BD Bioscience | 556547 | 细胞凋亡 |
| 抗 Ago2 抗体 | Proteintech | 66720-1-Ig | RNA 免疫共沉淀 |
| CCK-8 溶液 | Dojindo | CK04 | 细胞增殖 |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher | 121000146 | 细胞培养 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10437028 | 细胞培养 |
| 流式细胞仪 | BD Bioscience | FACSCalibur | 细胞凋亡 |
| 人抗 CCP 抗体 ELISA 试剂盒 | Cusabio | CSB-E09077h | 抗 CCP 检测 |
| 人 RF-IgA ELISA 试剂盒 | Feien Biotechnology | EH4270 | RF 检测 |
| 人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA） | Cell Applications | HFLS-RA-200 | miR-488-3p 功能的体外验证 |
| IgG 对照抗体 | Abcam | ab205718 | RNA 免疫共沉淀 |
| 白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA 试剂盒 | R&D Systems | DY201-05 | 细胞内 IL-1β 浓度 |
| 白细胞介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒 | R&D Systems | D6050B | 细胞内 IL-6 浓度 |
| Liposome 转染试剂 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | 细胞转染 |
| 酶标仪 | BioTek | ELx808 | ELISA 检测 |
| Mir-X™ miRNA 第一链合成试剂盒 | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | 逆转录 |
| Opti-MEM 培养基 | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | 细胞转染 |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | ROCK1 过表达 |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | 细胞培养 |
| Phadia 250 实验室系统 | Thermo Fisher | Phadia 250 | 血液分析 |
| PrimeScript™ 逆转录试剂盒 | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | 逆转录 |
| 碘化丙啶（PI）/核糖核酸酶（RNase） | BD Bioscience | 550825 | 细胞凋亡 |
| QuantStudio 5 系统 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | PCR 检测 |
| RNAiso Plus 试剂 | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | RNA 提取 |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | PCR 扩增 |
| TargetScan 数据库 | TargetScan | N/A | 结合位点预测（https://www.targetscan.org/） |
| Tina-quant C-反应蛋白 IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | CRP 检测 |
| 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒 | R&D Systems | DY210-05 | 细胞内 TNF-α 浓度 |
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