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一种用于优先排序便秘型肠易激综合征中微生物代谢物相关宿主基因的计算工作流程

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DOI：

10.3791/72396

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2026年8月14日

1Department of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, Jazan University

本文内容

摘要

本方案整合了微生物代谢物靶点预测、直肠黏膜转录组学、蛋白质-蛋白质相互作用与通路富集分析、分子对接、分子动力学模拟以及分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）结合自由能估算，以生成一份排序后的候选代谢物相关宿主基因短名单，并对蛋白质-配体复合物按结构优先级排序，为后续实验验证提供假设生成依据。

摘要

目前尚无标准化的计算流程，用于从公开的化学、基因组和结构数据库中系统性地优先筛选与微生物代谢物相关的宿主基因及蛋白-配体复合物。本文描述了一个八阶段工作流程，该流程接受用户自定义的一组肠道微生物群衍生代谢物，输出一份排序后的候选代谢物相关宿主基因短名单、富集的生物学通路以及结构上优先排序的蛋白-配体复合物，供后续实验验证。该流程整合了以下步骤：（i）化学信息学代谢物分析；（ii）基于多数据库的候选靶点预测，使用蛋白-化学物相互作用数据库、基于配体的靶点预测工具及分子对接程序；（iii）对公开转录组数据进行差异表达基因分析；（iv）预测靶基因与差异表达基因的交集；（v）蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与通路富集分析；（vi）分子对接分析，使用分子对接程序；（vii）采用分子动力学引擎结合用于分子动力学模拟的蛋白力场进行200 ns分子动力学模拟；（viii）MM-PBSA结合自由能估算。以实例演示，本研究处理了九种代表短链脂肪酸、胆汁酸、色氨酸衍生代谢物及尿石素A的肠道微生物群衍生或微生物群修饰代谢物，使用公开的肠易激综合征便秘型（IBS-C）直肠黏膜转录组数据集GSE36701。该工作流程在该数据集中筛选出17个独特且差异表达的预测代谢物相关基因。通过分子对接、分子动力学模拟和MM-PBSA分析，结构上优先排序出五个代谢物-蛋白复合物：lithocholic acid-VDR、lithocholic acid-NR1H4/FXR、ursodeoxycholic acid-NR1H4/FXR、tryptamine-HTR2A（在显式1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）脂双层）以及尿石素A-CASP3。该方案设计为可适用于其他代谢物组合、疾病转录组数据集及靶点类别；所有输出结果均为假设生成型的计算预测，需经过独立的转录组学重复验证、蛋白水平验证以及功能性配体-反应实验，方可得出因果关系或治疗意义的结论。

引言

伴便秘的肠易激综合征（IBS-C）是一种常见的功能性胃肠道疾病，其特征为反复发作的腹痛、排便习惯改变、腹胀和便秘，全球患病率估计约为总人口的10–15%1,2。目前的药物治疗包括促分泌剂、促动力药和解痉药，可在部分患者中改善个别症状；然而，治疗反应存在异质性，且持久缓解较为罕见，这反映了该疾病复杂的多因素致病机制1,3,4。因此，需要更全面地了解肠道微生物信号在黏膜水平的转导机制，以提出可验证的新治疗靶点假说。

肠道微生物群通过产生和生物转化多种化学结构不同的代谢物，如短链脂肪酸（SCFAs）、次级胆汁酸、色氨酸衍生物以及鞣花素等多酚类衍生物，参与维持下胃肠道的稳态5,6,7,8。这些分子通过一系列广泛但尚未完全明确的分子靶点与宿主细胞进行通讯，其作用范围远超经典的代谢物感应膜受体，还包括核受体、胞质酶、组蛋白修饰蛋白、肽类激素前体以及细胞内信号蛋白9。已有研究记录到肠易激综合征（IBS）患者肠道微生物群落组成及代谢物谱的改变，这为探讨与微生物代谢物响应相关的宿主基因在IBS-C患者直肠黏膜中是否存在转录水平的扰动提供了生物学依据10。

该九种代谢物组合被预先定义，旨在提供一组紧凑、化学多样性丰富且生物学意义明确的由肠道微生物群产生或经微生物群修饰的小分子。筛选基于五个标准：代表参与宿主-微生物群信号传导的主要微生物代谢物类别；具有已知或合理的远端肠道黏膜暴露性；具备明确的 PubChem 标识符和标准化学结构；分子大小和结构适合基于配体的靶点预测与分子对接；以及在便秘型肠易激综合征（IBS-C）中对上皮、神经免疫、肠内分泌、核受体或运动功能相关信号通路具有先前合理性。所选组合包括作为短链脂肪酸（SCFAs）的丁酸和丙酸；作为胆汁酸的鹅脱氧胆酸、石胆酸和熊脱氧胆酸；作为色氨酸衍生代谢物的色胺、吲哚-3-丙酸和吲哚-3-乳酸；以及作为肠道微生物群衍生多酚类代谢物的尿石素 A5,6,7,8,9,10。

以往大多数计算和实验研究都是孤立地考察单个代谢物-受体或代谢物-酶的相互作用，这种方法无法捕捉微生物代谢物信号在宿主通路中广泛分布且具有汇聚性的本质9,11。多个分析阶段的整合提供了相互增强的筛选能力，这是单一阶段无法独立实现的。针对经过审编的数据库进行计算靶点预测，可为每种代谢物获得一组广泛的潜在宿主蛋白候选。与疾病相关转录组数据的交集分析可显著缩小该候选集，仅保留那些在疾病背景下转录水平发生变化的候选分子。随后，通路富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析将缩小后的候选列表映射到已知的生物学功能模块。分子对接提供了对每个候选复合物结合口袋互补性的初步计算评估，而进一步的200纳秒分子动力学（MD）模拟结合MM-PBSA结合自由能分解，则为结构优先级排序提供了时间分辨的热力学维度信息，这是仅靠对接评分无法获得的。若各步骤独立进行，缺乏系统性整合与逐级筛选，则所得候选列表将过于宽泛，难以进行实验验证，也无法识别出通路间的汇聚性结构特征。

在本实验方案的框架内，“代谢物相关基因”（MAG）指人类基因，其编码的蛋白质产物已被至少一个经过 curated 的计算预测数据库提名作为一种或多种肠道微生物群衍生代谢物的潜在分子靶点，并且该基因的转录本在用于演示本工作流程的疾病相关转录组数据集中表现出差异表达。这一操作性定义明确包括膜受体、核受体、胞质酶、信号转导蛋白、肽类激素前体以及其他细胞内蛋白。MAG 的指定并不代表代谢物与靶蛋白结合、形成蛋白-配体复合物、激活受体、改变蛋白丰度或导致疾病的实验证据，而是通过计算方法得出的、用于生成假设的提名，需进一步实验验证。

本方案描述了一个完整的八阶段计算工作流程（图1），提供了足够的操作细节，以支持独立重复、适应其他代谢物面板或疾病数据集，并扩展至其他宿主-微生物群相互作用的研究场景。该工作流程明确界定为一种假设生成和结构优先排序的框架，仅基于公开可用的组学和结构资源进行操作，不单独从计算结果中推断代谢物浓度变化、受体激活状态、蛋白质表达改变、下游信号活性或临床意义。本文以九种由肠道微生物群产生或经微生物群修饰的代谢物，以及公开的肠易激综合征便秘型（IBS-C）直肠黏膜转录组数据集GSE36701为例，演示该方案的具体应用，旨在识别代谢物-基因关联（MAGs），并对代谢物-蛋白质复合物进行优先排序，以供后续实验验证。

方案

分析仅使用了来自GSE36701的公开可用的去标识转录组数据，以及公开可获取的化学、蛋白质和结构数据库。这些数据库的访问时间介于2026年1月至2026年5月之间。任何更晚的访问日期均记录在单独的材料表中。

1. 研究设计、硬件和软件要求

  1. 在开始分析之前定义工作流程。使用八个阶段：代谢物筛选、靶点预测、差异表达分析、靶点与差异表达基因（DEG）重叠分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）/通路富集分析、分子对接、分子动力学（MD）模拟以及MM-PBSA结合自由能估算。
  2. 记录分子对接、分子动力学模拟和MM-PBSA分析仅作为结构优先级排序工具。不得将这些结果解释为结合、受体激活、蛋白丰度变化、治疗效果或疾病因果关系的实验证据。
  3. 在运行分子动力学模拟前确认计算硬件配置。应使用64位Linux操作系统、6核或更高性能的CPU、配备≥8 GB显存的GPU加速平台，或等效的GPU加速平台，且至少具备8 GB显存、最低32 GB内存以及每个MD系统至少200 GB的可用存储空间。
  4. 记录核心软件：分子动力学引擎、代谢物配体与靶标蛋白的分子对接程序、化学文件格式转换工具12、三维配体生成工具、配体预处理工具、对接输入准备工具包、代谢物配体与靶标蛋白的分子对接程序、通用编程环境、集成生物信息学软件框架的统计计算环境，以及差异基因表达分析软件包。
  5. 记录结构分析工具：基于网页的膜系统构建工具、兼容CHARMM的配体参数化服务、分子力学/连续介质溶剂模型结合能计算工具、分子拓扑与参数转换库、三维分子可视化程序，以及2021版分子可视化与二维相互作用图分析工具（下载链接和版本信息见材料表）。
  6. 在材料表/环境文件中记录分子动力学模拟所使用的精确蛋白力场、CGenFF、CHARMM-GUI、R/生物信息学软件框架，以及分子力学/连续介质溶剂结合能计算工具的版本标识符。对于缺失的标识符应标注为“无法恢复”；不得进行推断。

2. 代谢物筛选与化学信息学表征

  1. 在靶点预测前确定代谢物面板。包括丁酸（PubChem CID: 264）、丙酸（CID: 1032）、鹅去氧胆酸（CID: 10133）、石胆酸（CID: 9903）、熊去氧胆酸（CID: 31401）、色胺（CID: 1150）、吲哚-3-丙酸（CID: 3744）、吲哚-3-乳酸（CID: 92904）和尿石素A（CID: 5488186）。
  2. 获取每种代谢物的标准简化分子线性输入规范（SMILES）和PubChem CID。在靶点预测前核对同义词和重复结构。将最终标识符存储于代谢物主表中。
  3. 将标准SMILES字符串提交至理化性质与ADME预测网络工具13（见材料表）。记录分子量、拓扑极性表面积（TPSA）、共识logP、氢键供体数、氢键受体数、可旋转键数、预测的胃肠道吸收、P-糖蛋白预测结果，以及Lipinski、Veber、Ghose、Egan、Muegge和PAINS警示信息。
  4. 保留结构识别成功、分子量≤500 Da且无PAINS警示的代谢物。记录任何未通过的标准及保留或排除该代谢物的决定。
  5. 在后续靶点预测与分子对接前指定电离状态。丁酸和丙酸采用去质子化的羧酸根形式，胆汁酸采用中性羧酸形式，色胺采用质子化的铵根形式，其余代谢物采用中性形式。

3. 候选人类靶点预测

  1. 打开一个化学-蛋白质相互作用靶点预测工具14（参见材料表）。输入每种代谢物的名称或 PubChem CID，选择 Homo sapiens（分类学编号：9606），并将最低综合相互作用评分设置为 ≥0.700。
  2. 在化学-蛋白质相互作用靶点预测中，优先考虑实验数据和经人工审编的数据库证据来源。下载每种代谢物的完整蛋白质关联表格。
  3. 打开一个分子对接程序15（参见材料表）。提交每条规范 SMILES 字符串，并选择 Homo sapiens，保留预测概率 ≥0.70 的靶点。
  4. 将化学-蛋白质相互作用靶点预测结果与分子对接程序的输出结果合并，形成每种代谢物的并集。保留满足任一数据库阈值的靶点，并去除完全重复的基因符号条目。
  5. 使用蛋白质标识符映射至标准化的 HUGO 基因命名委员会（HGNC）批准的基因符号，或整合的人类基因信息数据库（参见材料表），将蛋白质条目标准化为 HGNC 批准的基因符号。将别名、过时符号和异构体注释统一为每个蛋白质对应一个基因符号。
  6. 将每个靶点分类为膜受体、核受体、酶、细胞内信号蛋白、肽类激素、激素相关蛋白或其他细胞内蛋白。在靶点表格中记录其分类。

4. 转录组数据集与差异基因表达分析

  1. 通过 NCBI 基于网络的差异基因表达分析工具访问 GSE3670116,17（参见材料表）。记录该数据集包含来自便秘型肠易激综合征（IBS-C）、腹泻型肠易激综合征（IBS-D）、感染后肠易激综合征以及健康志愿者组的直肠黏膜活检表达数据18。
  2. 在 GEO 和 ArrayExpress 中搜索独立的验证队列。使用以下关键词组合进行检索：IBS-C、便秘型肠易激综合征、直肠黏膜、结肠黏膜、活检、转录组、微阵列和 RNA-seq。记录所使用的数据库、检索词、检索日期，以及是否识别出可比较的验证数据集。
  3. 从 GSE36701 记录中启动基于网络的差异基因表达分析工具（参见材料表）。将 18 个 IBS-C 样本分配至 IBS-C 组，将 40 个健康志愿者样本分配至对照组，IBS-D 和感染后肠易激综合征样本不分配。
  4. 使用差异基因表达分析软件包框架进行差异表达分析，并采用 Benjamini-Hochberg 错误发现率（FDR）校正19。下载包含探针 ID、基因符号、基因名称、logFC、AveExpr、校正 t 统计量、原始 P 值和校正后 P 值的完整结果表格。
  5. 将探针合并为基因水平条目。移除无基因符号的探针；对于重复的基因符号，保留 FDR 值最低的探针；若 FDR 相同，则以绝对 logFC 值较大者为准。

5. 靶基因与差异表达基因重叠分析及统计评估

  1. 将每种代谢物特异性的预测靶基因列表与基因水平的差异表达基因（DEG）列表在错误发现率（FDR）< 0.05 的条件下进行交集分析。记录重叠基因、来源代谢物、logFC、校正后的P值及表达方向。
  2. 将各代谢物特异性的重叠基因列表合并为一个非冗余的代谢物关联基因（MAG）列表。统计预测靶基因总数、各代谢物特异性重叠基因数以及总的唯一MAG数量。
  3. 对具有多个探针的基因评估探针水平的表达方向一致性。若某基因的不同探针在表达方向上存在不一致，则对该基因进行标记。
  4. 使用基因合并后的总条目数、总差异表达基因数、总的唯一预测靶基因数以及实际观察到的MAG数量，构建Fisher精确检验的列联表。采用Fisher精确检验计算单尾P值、优势比（odds ratio）及95%置信区间。
  5. 若背景差异表达基因率超过50%，则将该重叠结果视为描述性结果，而非独立验证的富集证据。除非另行进行方向性检验，否则将一致的下调表达视为一种描述性的方向性模式。

6. 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析与通路富集

  1. 将完整的唯一MAG列表提交至蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与通路富集分析20（参见材料表）。选择Homo sapiens，并将最低相互作用得分设为0.700。
  2. 导出整合的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与通路富集网络及完整的相互作用表格。若文本挖掘导致拓扑结构异常密集，取消选择文本挖掘通道，仅保留实验验证、共表达和数据库来源的相互作用数据。
  3. 针对与短链脂肪酸相关、胆汁酸相关以及色胺/血清素能相关的MAGs，生成代谢物类别子网络。使用相同的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与通路富集分析的物种及置信度设置。
  4. 利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）21、Reactome22 和基因本体（GO）生物学过程23,24 进行蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与通路富集分析。应用Benjamini–Hochberg校正法（BH FDR <0.05），并导出所有富集分析结果表格。

7. 分子对接

  1. 从结构生物信息学研究协作蛋白质数据库 RCSB PDB25 中获取实验测定的受体结构（见材料表）。针对五个优先考虑的蛋白-配体复合物，分别使用 VDR/1DB1、NR1H4/FXR/3DCT、CASP3/2DKO 和 HTR2A/6A93。
  2. 通过保留 A 链并去除水分子、共结晶配体、辅因子、离子以及非蛋白质的 HETATM 记录来准备每个受体。对于 6A93，在受体准备前需移除 T4 溶菌酶融合片段。
  3. 使用分子结构工具包为每个受体添加极性氢原子，分配 Gasteiger 电荷，并将其保存为 PDBQT 格式。在转换为 PDBQT 格式前检查结合位点组氨酸的质子化状态，并记录所选状态。
  4. 在化学结构文件转换工具包中生成每个配体的三维结构。使用通用力场（UFF）进行 500 步的能量最小化，设定 pH 7.4 的电离状态，分配 Gasteiger 电荷，并保存为 PDBQT 格式。
  5. 定义一个以共结晶配体质心为中心、尺寸为 25 Å × 25 Å × 25 Å 的对接盒子。VDR 的中心坐标为 (10, 19, 33)，FXR 为 (137, 31, 78)，CASP3 为 (37, 34, 32)，HTR2A 为 (12, −1, 61)。
  6. 使用 exhaustiveness = 8、seed = 42、num_modes = 9 和 energy_range = 3 kcal/mol 的参数设置，对代谢物配体与靶标蛋白进行分子对接26,27。记录所有构象中排名最高的 Vina 评分及均方根偏差（RMSD）值。
  7. 为每个优先考虑的复合物选择第一构象模式。使用分子可视化软件和二维相互作用图工具生成二维配体-残基相互作用图，并使用三维分子可视化程序生成三维受体-配体结构视图。
  8. 对 VDR/1DB1 和 FXR/3DCT 进行重对接验证。当重原子 RMSD 相对于晶体结构构象小于<2.0 Å 时，接受该受体对接设置。
  9. 通过将石胆酸（LCA）对接至 CASP3 以及色胺对接至 VDR 来执行交叉对接验证。比较同源与非同源对接评分，并记录评分差异小于<1.0 kcal/mol 的情况。

8. 分子动力学模拟

  1. 使用与 CHARMM 兼容的配体参数化服务28（参见材料表）生成配体参数。检查所有惩罚分数，并标记任何惩罚值>50 的参数。
  2. 利用力场拓扑转换脚本将配体流文件转换为与分子动力学引擎兼容的 .itp 和 .prm 文件。将每个复合物的配体与蛋白质拓扑文件合并。
  3. 使用分子拓扑和参数转换库进行氢原子质量再分配。采用用于分子动力学模拟的蛋白质力场29和显式三站点水模型30生成水相体系的拓扑结构。
  4. 将水相复合物溶剂化于十二面体盒子中，溶质到盒子边缘的距离至少为 1.2 nm。中和体系，并添加 NaCl 至浓度为 0.15 M。
  5. 使用基于网页的膜系统构建工具31,32,33（参见材料表）构建色胺-HTR2A 膜系统。使用与膜蛋白取向数据库对齐的受体坐标34（参见材料表）、纯 POPC 双层膜、22.5 Å 厚的水层以及 0.15 M NaCl。
  6. 对所有体系进行最陡下降法能量最小化，最多执行 50,000 步。在平衡前确认收敛，要求最大作用力 Fmax <1000 kJ·mol-1·nm-1。
  7. 对水相体系依次进行粒子数、体积和温度恒定系综（NVT）以及粒子数、压力和温度恒定系综（NPT）的平衡。对膜体系采用基于网页的六步多阶段分子体系准备与平衡流程，逐步释放限制条件进行平衡。
  8. 对全部五个复合物运行 200 ns 的生产阶段分子动力学模拟。时间步长为 4 fs，采用氢质量再分配（HMR）、310 K 下的 V-rescale 温控器、1 bar 下的 Parrinello-Rahman 压控器、粒子网格埃瓦尔德（PME）静电相互作用35以及 LINCS 约束算法36。
  9. 使用分子动力学轨迹分析工具分析最终轨迹。以最后 150 ns 作为主要分析窗口，计算主链 RMSD、Cα 原子均方根涨落（RMSF）、回转半径、溶剂可及表面积（SASA）以及蛋白质-配体间的氢键。

9. MM-PBSA 结合自由能估算

  1. 为MM-PBSA分析提取轨迹快照。每个水相复合物使用2,001帧，膜嵌入的HTR2A子系统使用201个处理后的帧。
  2. 使用泊松-玻尔兹曼溶剂化模型、内部介电常数=1、外部介电常数=80、基于溶剂可及表面积（SASA）的非极性溶剂化项以及无熵校正，运行分子力学/连续介质溶剂结合能计算工具37。报告平均结合自由能及其标准偏差。
  3. 对所有五个复合物进行残基分解分析。报告绝对贡献值≥0.5 kcal·mol−1的稳定性和去稳定性残基。

    

结果

候选代谢物相关靶点

这九种代谢物在化学-蛋白质相互作用靶点预测和分子对接程序中产生了异质性的预测靶点集合。丙酸、色胺、胆汁酸和尿石素A均得到多个与胃肠道信号传导相关的已知靶点。预测的靶点谱包括经典的膜受体、核受体、细胞内酶、信号转导蛋白以及与肽类激素相关的蛋白。因此，后续结果被描述为代谢物相关基因（MAGs），而不仅限于受体发现（表1）。

与已报道的代谢物-蛋白质相互作用进行基准比较

为了将靶标预测结果与现有实验知识进行基准比较，将预测的代谢物相关靶标关系分为三个证据等级：（i）实验支持的直接或近缘类别水平的代谢物-蛋白质相互作用，其中该代谢物或结构相近的内源性代谢物已被报道可结合、激活、抑制或功能调控编码蛋白；（ii）通路或靶标类别支持的相互作用，其中预测的靶标属于已知代谢物响应通路或受体家族，但针对该特定代谢物-蛋白质组合的直接实验证据有限；（iii）仅基于计算的关联，即在所审查文献中未发现任何直接实验相互作用证据。该基准比较用于对预测的代谢物-靶标关联（MAGs）进行背景化解释，而非验证其准确性。

多个预测结果重现了先前报道的生物学现象。丙酸-FFAR2被视为具有实验支持，因为FFAR2/GPR43是经典的短链脂肪酸受体。丁酸-HDAC3被归类为具有实验或类别支持，因为丁酸是一种公认的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，且所预测的相互作用涉及HDAC家族成员。涉及NR1H4/FXR和VDR的胆汁酸相关预测被认为得到了已确立的胆汁酸核受体生物学的支持，特别是对于疏水性胆汁酸（如石胆酸LCA）；而熊去氧胆酸（UDCA）相关的FXR预测则需谨慎解读，因为UDCA通常是一种较弱或依赖于具体情境的FXR配体。色胺相关的HTR1B、HTR2A、HTR2B和HTR6预测被归类为由5-羟色胺通路支持，而非已确认的直接受体特异性相互作用，因为色胺是一种由微生物色氨酸衍生的单胺类物质，而5-羟色胺受体已被证实为调控胃肠道运动和分泌的关键因子。尿石素A-CASP3被认为具有通路支持，依据是已有文献报道了尿石素A与凋亡/半胱天冬酶（caspase）相关反应之间的联系，但尚无CASP3直接结合的实验证据。吲哚-3-乳酸-KYAT1和吲哚-3-丙酸-KYAT1则被保留为仅基于计算的假设，因为现有广泛文献支持微生物来源的吲哚衍生物在宿主信号传导中的作用，但并未证实这些特定代谢物与KYAT1的直接结合7,8,38,39,40。

因此，表1 区分了计算靶点提名与先前实验或通路支持的水平。同时，针对每个靶点，提供了预测来源（化学-蛋白质相互作用靶点预测、分子对接程序，或两者兼有）、化学-蛋白质相互作用靶点预测的综合相互作用评分，以及通过分子对接程序鉴定靶点时的对接概率。对于缺乏直接先前实验证据的预测靶点，将其描述为候选的代谢物相关基因，需进行独立的蛋白质水平和配体响应验证。

预测靶基因与便秘型肠易激综合征（IBS-C）差异表达基因之间的重叠

联合预测靶基因列表与基因水平差异表达结果的交集分析，鉴定出17个独特的预测代谢物相关基因，这些基因在便秘型肠易激综合征（IBS-C）与健康志愿者的比较中呈现显著差异表达。所有17个基因均下调表达。该基因集合包括膜受体和核受体（CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR）以及非受体蛋白（CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN）（表1，图2A,B）。

全部17个MAGs的错误发现率（FDR）均低于0.05；其中16个达到更严格的FDR < 0.001标准，仅余下的一个基因（HTR1B）在FDR < 0.05水平上具有显著性。在17个靶基因中，有7个（CASP3、GCG、GNAQ、GPHN、GPR68、HDAC3、TBXA2R）同时满足FDR < 0.001且绝对log2倍数变化超过1.0（logFC范围为−1.34至−1.10），表明该亚组基因表现出强烈且一致的下调。其余靶基因则表现为中等程度但具有统计学显著性的下调（|logFC|范围为0.45至0.97）。鉴于该数据集具有全基因组表达特征（见下文统计评估），对该一致描述性模式的解读需持谨慎态度。

目标基因与差异表达基因重叠的统计学评估

为了正式评估17个基因重叠的统计学显著性，采用单尾Fisher精确检验，以17个预测靶基因作为查询集，以GSE36701中检测到的全部18,296个唯一基因折叠条目作为基因组背景。在此背景中，有17,296个基因（94.5%）在FDR < 0.05水平上差异表达，反映出在IBS-C直肠黏膜比较中近乎普遍的转录抑制现象。所有17个预测靶基因均属于差异表达基因（实际重叠为17/17，占100%）。鉴于背景中差异表达基因的比例为94.5%，任意随机选择的17个基因集合的预期重叠基因为16.1个。Fisher精确检验得到的p值为0.384，连续性校正后的比值比为2.03（95%置信区间为0.12–33.73），在α = 0.05水平上无统计学显著性（图3A–C）。

该结果表明，观察到的17/17重叠并未超过在此数据集全基因组表达谱下由随机因素预期的重叠程度。因此，这些发现应被解读为一种描述性方向性模式，即所有17个预测靶基因在便秘型肠易激综合征（IBS-C）直肠黏膜组织中均一致且显著地下调，而非在基因组背景下具有统计学富集或独立验证的证据。正式的富集检验需要在差异表达谱更具选择性的转录组数据集中进行重复验证，其中显著差异表达的基因比例应远低于全部基因的一半。需要强调的是，这17个重叠基因的统一下调是一种描述性观察结果，而非经过独立验证的统计学结果，因为该数据集的差异表达背景基因本身也以普遍下调为主，重叠基因之间存在共同的下调方向是预期之中的现象，且未经过正式的方向性检验。因此，这种一致的方向性不应被解释为协同性、代谢物特异性调控的独立统计学证据。

特异性代谢物模式

丙酸影响的基因中重叠数量最多，包括 CASR、FFAR2、GCG、GNAQ、GPHN、GPR68、MLN 和 TBXA2R，提示短链脂肪酸响应性及与 Gq 相关的信号通路可能参与其中。丁酸与 HDAC3 存在重叠，这与丁酸相关的组蛋白去乙酰化酶生物学功能一致，但仅凭 mRNA 下调尚不足以确立丁酸响应性的改变。胆汁酸相关重叠基因包括核受体 VDR 和 NR1H4，二者均被公认为肠道中胆汁酸信号传导的作用分子38,39。色胺与 HTR1B、HTR2A、HTR2B 和 HTR6 存在重叠，提示血清素能信号通路可能作为一个候选模块，该系统在胃肠道运动和分泌中具有明确的重要作用40。吲哚-3-乳酸和吲哚-3-丙酸与 KYAT1 存在重叠，尿石素 A 则与 CASP3 存在重叠。

通路富集

对17个重叠基因进行的功能富集分析结果显示，这些基因参与了G蛋白偶联受体（GPCR）下游信号通路、Gαq信号通路、GPCR配体结合、5-羟色胺能突触、神经活性配体-受体相互作用、钙信号转导、cAMP信号通路以及肽类激素分泌等过程。这些结果与基因集的组成一致，支持其生物学上的功能相关性，但反映的是所提交基因的功能注释信息，而非通路水平活性的独立证据。

蛋白质-蛋白质相互作用网络结构

蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建和通路富集分析在三个互补网络中进行了解读。在整合的17基因元网络（网络1）中，最显著的、有注释支持的结构是以GNAQ为核心的GPCR/Gαq信号通路组分，将GNAQ与受体相关基因（包括TBXA2R、CASR、HTR2A和HTR2B）连接起来。5-羟色胺受体之间的连接较为有限，其中HTR2A与HTR2B之间的连接最为显著，而在所选置信度阈值下，其他多个基因则保持孤立或连接较弱。丙酸特异性网络（网络2）表现出更局限的拓扑结构，其中GNAQ保留了与CASR和TBXA2R之间有注释支持的连接，而FFAR2、GPR68、GCG、GPHN和MLN则处于孤立或弱连接状态。色胺/5-羟色胺网络（网络3）包含HTR1B、HTR2A、HTR2B和HTR6；在此子集中，HTR2A与HTR2B显示出主要的、有注释支持的连接，而HTR1B和HTR6在所选阈值下未直接相连（图4A–C）。

分子对接

对五种选定的代谢物-蛋白质复合物进行了分子对接。胆汁酸-核受体组合的Vina评分优于尿石素A-CASP3和色胺-HTR2A。LCA-VDR的评分最佳，为−10.0 kcal/mol，其次是LCA-NR1H4/FXR（−9.9 kcal/mol）和UDCA-NR1H4/FXR（−9.4 kcal/mol）。尿石素A-CASP3和色胺-HTR2A的评分较低，但仍然合理，分别为−7.1 kcal/mol（表2）。

对于LCA-VDR复合物（PDB ID: 1DB1），预测的结合构象得到了LCA羧基氧与Ser278之间形成的经典氢键（4.29 Å）的支持，同时还存在涉及Leu230、Val234、Trp286、Val300、His305、Tyr295、Leu233和His397的广泛疏水相互作用，以及与Met272、Leu313、Ile271、Ile268、Leu309、Phe422、Val418、Ala231、Ala303、Cys288、Ser275和Phe150的额外范德华相互作用。排名最高的构象的Vina评分为−10.0 kcal/mol，结合腔大小为2055 Å3，网格中心坐标为(10, 19, 33)（表3，图5A,B）。

对于LCA-NR1H4/FXR复合物（PDB编号：3DCT），其对接得分为−9.9 kcal/mol，预测存在涉及His294和Ile335的氢键，与His294的π-σ相互作用，以及涉及Met290、Met328、Ala291、Leu287、Ile352和His447的疏水性烷基或π-烷基接触，并有进一步的范德华相互作用，支持类固醇骨架在FXR结合口袋中的容纳（表4，图6A,B）。

UDCA-NR1H4/FXR复合物（PDB ID: 3DCT）的预测构象显示，其与His447形成一个常规氢键（3.66 Å），与Gly322形成另一个氢键（3.46 Å），与Val325存在π-阴离子相互作用（4.96 Å），并与Trp469形成碳-氢键（4.51 Å）。相互作用图谱还发现与Arg395（3.89 Å）和Gln396（3.40 Å）之间存在不利的供体-供体接触，提示UDCA在同一受体结合口袋中的Vina评分低于LCA，可能是由于局部几何构型或静电相互作用较不理想所致（表5，图7A、B）。

在尿石素A-CASP3复合物（PDB ID: 2DKO）中，预测的结合模式包含与Gln161（3.78和4.19 Å）、Ser120（3.95 Å）以及Arg207（3.05和3.77 Å）形成的常规氢键，并通过与Arg207的π-阳离子相互作用、与Cys163的π-供体氢键，以及涉及Arg64、Ala162、His121、Ser205和Trp206的额外π-烷基和范德华接触进一步稳定（表6，图8A,B）。

对于色胺-HTR2A 复合物（PDB ID: 6A93），预测的结合构象通过色胺的质子化胺基与Asp155之间形成的静电盐桥而稳定，Asp155是跨膜螺旋3中保守的天冬氨酸残基（Ballesteros-Weinstein 编号中的 D3.32），可在5-羟色胺及其相关受体中锚定胺类配体的质子化胺基41,42,43；此外，还存在与Thr160和Ser159的氢键作用、与Phe340和Trp336的芳香相互作用，以及与Val156和Ile163的π-烷基相互作用。其他范德华相互作用包括Tyr370、Phe339、Ser242、Phe243、Phe332和Leu123，共同支持正构结合位点的结合模式（表7，图9A,B）。

对接方案验证

为评估对接方案的可靠性，进行了两项互补的对照实验。在重新对接（阳性）对照中，将共结晶配体从其参考X射线结构中提取，并重新对接至其天然结合位点。维生素D类似物VDX在VDR/1DB1中的最高排序预测构象与晶体结构位置偏差为0.87 Å，FXR/3DCT中的共结晶配体WAY-362450偏差为1.79 Å；两个值均低于常规接受阈值2.0 Å，表明该对接方案在这些受体系统中具有几何学上的有效性（图10A，B）。在交叉对接（阴性）对照中，将石胆酸对接至其非已知配体的半胱氨酸蛋白酶caspase-3（2DKO），所得预测得分为−8.3 kcal/mol，比其在天然靶标VDR（−10.0 kcal/mol）低1.7 kcal/mol，符合预测的结合位点选择性。色胺对接至VDR的预测得分为−6.4 kcal/mol，而其在天然靶标HTR2A上的得分为−7.1 kcal/mol，差异为0.7 kcal/mol，该差异处于代谢物配体对接至靶蛋白得分的已报道不确定性范围内，因此表明该小分子配体仅有较弱的预测选择性（图10C）。综上所述，这些对照实验表明，在测试条件下，该对接方案能够重现已知的结合几何构象，并能区分天然配对与非天然配对，但这些计算预测结果不能替代实验测得的亲和力数据（表8）。

分子动力学模拟

对五种优先选择的复合物进行了200 ns生产轨迹的分子动力学模拟。四个可溶性核受体复合物在显式水溶剂中进行模拟，而色胺-HTR2A复合物则在显式POPC脂双层中进行模拟，以为该G蛋白偶联受体提供生理上合适的膜环境。分析验证了对接构象在时间依赖条件下的动态稳定性，并允许比较不同复合物之间的相对结构行为（表9）。

LCA-VDR/1DB1 复合物的 RMSD 曲线显示，在前 10 ns 内经历短暂的平衡阶段，随后进入稳定平台期，波动范围主要在 0.20–0.28 nm 之间（图11A）。RMSF 值较低，主链波动也较小 < 大多数残基为 0.15 nm图11B）。氢键分析显示存在一个持续的2–5个氢键网络，偶尔可增加至7个（图11C). 回转半径（Rg）保持在1.25–1.75 nm范围内，溶剂可及表面积（SASA）维持在约130 nm2 (图11D，E).

尿石素A-CASP3/2DKO复合物表现出更强的动态活性。其RMSD值初始阶段上升，随后在0.4至0.7 nm之间波动，并在约165 ns时出现短暂的高偏差事件（图12A）。RMSF分析显示残基水平具有较高的移动性，其中残基175附近的柔性环区域波动最为显著（图12B）。氢键分析表明，在前30–40 ns内存在一个由约2–5个氢键组成的广泛网络，随后主要维持在0到2个间歇性氢键（图12C）。相应的回转半径和溶剂可及表面积（SASA）曲线如图12D、E所示。

对于NR1H4/FXR（3DCT）胆汁酸体系，主链RMSD值在大部分轨迹过程中保持在相对狭窄的范围内图13A），而RMSF曲线显示核心区域的移动性较低，柔性区域的波动较高（图13B）。在整个轨迹过程中，LCA-3DCT 复合物维持了大约三个到四个持续存在的氢键，而 UDCA-3DCT 复合物则表现出更大的氢键波动性，并在约 125 ns 后氢键数量减少。LCA 和 UDCA 结合体系的回转半径分布如图所示 图13C，D，相应的SASA谱图如图所示 图13E，F.

色胺-HTR2A复合物的膜分子动力学

在包含258个脂质分子的显式POPC脂双层、显式三站点水模型以及0.15 M NaCl环境中，对色胺-HTR2A/6A93复合物进行了200 ns的模拟，总体系规模约为100,925个原子33,44,45。在整个轨迹过程中，受体稳定地嵌入脂双层中（图14）。主链RMSD在前100 ns内从约0.10 nm上升至接近0.15–0.20 nm的稳定平台期，之后保持稳定，所有值均低于0.25 nm，表明受体在膜环境中维持了稳定的构象，未发生全局去折叠（图15A）。残基分辨率的RMSF显示跨膜螺旋核心区域波动较小，而环区和末端区域表现出预期的较高灵活性，符合典型GPCR的柔性特征（图15B）。回转半径紧密限制在约2.06至2.12 nm之间，SASA在狭窄范围内波动且无持续漂移趋势，两者均证实了跨膜螺旋束的紧凑结构得以保持（图15C,D）。

在整个轨迹过程中，蛋白质与配体之间的氢键得以维持（图15E），氢键数量出现显著波动，范围为1至3个。为专门评估关键离子相互作用的持续性，监测了色胺质子化铵氮原子与Asp155（D3.32）羧酸根氧原子之间的最小距离在整个轨迹过程中的变化。该距离始终紧密分布在平均0.270 nm附近（最小值0.247 nm，最大值0.424 nm），盐桥接触（< 0.4 nm）在99.9%的模拟时间内得以保持，仅出现两次短暂的瞬时偏离，未发生持续性解离事件（图16）。这些结果表明，在整个膜模拟过程中，保守的Asp155离子相互作用足以稳定色胺在HTR2A正构结合口袋中的构象。

MM-PBSA 结合自由能及残基分解

采用MM-PBSA分析方法为五个复合物（表10）增加了额外的能量优先级评估层。对于四个水相复合物，按残基分解分析确定了每种预测结合模式中的主要能量贡献残基。在LCA-VDR/1DB1复合物中，配体和Gln317表现出有利的贡献，而Trp286则表现出不利的贡献。在尿石素A-CASP3/2DKO复合物中，Arg64和Arg207显示出显著的负向残基贡献，表明存在较强的极性或静电稳定作用；然而，相应的轨迹仍表现出高度动态性，说明仅凭有利的残基水平能量特征并不能保证复合物稳定性的持久维持。对于3DCT体系，LCA的结合主要由Arg331驱动，而UDCA的结合则涉及一个更为分散的能量网络，包括Glu326、Asp394、Arg395、Arg441和Asp470。在四个水相体系中，MM-PBSA分解结果支持对基于LCA的复合物进行相对优先排序。

对于膜嵌入的色胺-HTR2A/6A93复合物，对从双层轨迹中提取的蛋白质-配体子系统进行了MM-PBSA分析46,47。配体和Asp155（D3.32）表现出有利的贡献，其中Asp155在残基水平上的稳定作用最为显著，这与对接分析和轨迹距离分析中发现的盐桥相互作用一致。在构成结合口袋内衬的芳香族和极性接触网络的周围正构口袋残基（Ser86、Phe87、Phe133、Phe140、Phe141、Val156、Ser159、Thr160、Ile163、Val167、Tyr171）中，Trp137表现出最大的不利残基贡献。这些数值代表了用于结构优先级排序的相对计算估计值，并非实验测得的结合亲和力。

代谢物筛选流程图：预测靶点、转录组分析、分子对接。
图1：针对便秘型肠易激综合征（IBS-C）中与代谢物相关的宿主基因优先排序的计算工作流程。 该八阶段整合工作流程的示意图，涵盖代谢物筛选、靶点预测、转录组差异表达分析、重叠分析、网络与通路富集分析、分子对接、分子动力学模拟以及MM-PBSA结合自由能分析。请点击此处查看此图的放大版本。

显示基因表达分析的火山图和维恩图；IBS-C 研究结果，差异表达基因的鉴定。
图 2：IBS-C 黏膜中差异表达与代谢物靶基因重叠分析。（A）GSE36701 数据集中基因水平差异表达的火山图。蓝色点表示显著下调的基因；红色点表示显著上调的基因；灰色点表示无显著性差异的基因。部分重叠的代谢物相关基因已标注。（B）维恩图显示 330 个唯一预测的代谢物靶基因与 GSE36701 中下调基因之间的重叠情况；共有 17 个基因重叠。请点击此处查看该图的放大版本。

柱状图、统计分析、基因表达、log2FC、比较、差异表达基因（DEGs）、背景基因与目标基因。
图3：基于GSE36701数据集对17个预测代谢物靶基因的统计评估。（A）17个基因各自的log2倍数变化，按显著性等级着色。（B）背景基因与预测靶基因的差异表达率，采用Fisher精确检验。（C）Fisher精确检验所用的2×2列联表。全部17个靶基因均显著下调；该重叠被视为一种描述性的方向性模式，而非统计富集。请点击此处查看该图的高清版本。

基因网络相互作用图；节点标注为 CASP3、HTR1B、HTR2B；基因连接性分析。
图4复合蛋白-蛋白相互作用网络构建及重叠代谢物相关基因的通路富集蛋白-蛋白相互作用网络 (A网络1：全部17个基因的整合元网络。B网络2：8个与丙酸特异性相关的基因（CASR、FFAR2、GCG、GNAQ、GPHN、GPR68、MLN、TBXA2R）。C网络3：色胺/5-羟色胺网络，包含四个基因（HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6）。该网络基于智人（Homo sapiens）构建，采用蛋白质-蛋白质相互作用网络构建方法，通路富集置信度≥0.700。边表示由注释支持的功能关联 请点击此处以查看此图的放大版本。

蛋白质-配体复合物示意图，分子相互作用可视化，范德华力，氢键。
图 5：石胆酸与维生素D受体（VDR）复合物的三维和二维结构示意图（PDB ID: 1DB1）。（A）三维表面与卡通图，其中石胆酸以球状表示。（B）二维相互作用图，显示Ser278的氢键及周围的疏水和范德华相互作用。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白-配体相互作用图解与分子结构，显示氢键和范德华力。
图6。石胆酸与NR1H4/FXR复合物的三维和二维结构示意图（PDB ID: 3DCT）。（A）三维表面与卡通表示。 （B）二维相互作用图谱，显示与His294和Ile335的氢键、π-σ相互作用以及周围的接触。 请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质-配体相互作用，三维分子结构，范德华力，氢键，ARG-GLN分析示意图。
图7：熊去氧胆酸与NR1H4/FXR复合物的三维及二维结构示意图（PDB ID: 3DCT）。（A）三维表面与卡通表示图。（B）二维相互作用图谱，显示与His447和Gly322形成的氢键、与Val325的π-阴离子相互作用、与Trp469形成的碳-氢键，以及与Arg395和Gln396之间的不利供体-供体接触。请点击此处查看此图的放大版本。

尿石素A与CASP3结合的蛋白-配体相互作用分析示意图，显示氢键和π-阳离子相互作用。
图8：尿石素A与CASP3复合物的三维与二维结构示意图（PDB ID: 2DKO）。（A）三维表面与卡通结构示意图。（B）二维相互作用图谱，显示与Gln161、Ser120和Arg207形成的氢键，与Arg207的π-阳离子相互作用，与Cys163的π-供体氢键，以及周围的接触作用。请点击此处查看此图的放大版本。

蛋白质-配体相互作用示意图及突出显示结合位点和分子作用力的三维结构。
图9：色胺与HTR2A复合物的三维和二维结构示意图（PDB编号：6A93）。（A）在三维分子可视化程序中生成的三维表面与卡通模型示意图。（B）通过分子可视化软件及二维相互作用图工具生成的二维相互作用图，展示Asp155盐桥及其他结合位点的相互作用。请点击此处查看此图的高清版本。

分子对接模拟图，包含 RMSD 和 Vina 评分；包括数据分析图表。
图 10：对接方案验证。（A,B）共结晶配体重新对接至 VDR/1DB1（RMSD 0.87 Å）和 FXR/3DCT（RMSD 1.79 Å）；晶体结构构象与重新对接构象叠加显示，均低于 2.0 Å 的可接受阈值。（C）交叉对接选择性：石胆酸和色胺的同源与非同源 Vina 评分对比。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质动力学分析图：RMSD 与时间关系、RMSF 与残基关系、氢键、回转半径、SASA。
图11．LCA-VDR/1DB1 复合物在 200 ns 内的分子动力学轨迹分析。（A）RMSD 曲线。（B）RMSF 曲线。（C）氢键数量。（D）回转半径曲线。（E）SASA 曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

分子动力学图表；随时间变化的RMSD、RMSF、氢键、回转半径和SASA；数据分析。
图12：尿石素A-CASP3/2DKO复合物在200 ns内的分子动力学轨迹分析。（A）RMSD曲线显示广泛的构象波动，并在约165 ns处出现短暂的高偏差事件。（B）RMSF曲线显示在残基175附近存在显著的残基水平柔性。（C）氢键数量。（D）回转半径曲线。（E）SASA曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

分子动力学数据图表：蛋白质-配体复合物的RMSD、RMSF、Rg、SASA随时间变化。
图13：NR1H4/FXR（3DCT）胆汁酸体系在200 ns内的分子动力学轨迹分析。（A）3DCT复合物的主链RMSD曲线。（B）主链RMSF曲线。（C）3DCT-LCA的回转半径曲线。（D）3DCT-UDCA的回转半径曲线。（E）3DCT-LCA的溶剂可及表面积（SASA）曲线。（F）3DCT-UDCA的溶剂可及表面积（SASA）曲线。请点击此处查看该图的高清版本。

蛋白质-脂质双分子层相互作用示意图；HTR2A、色胺在POPC双分子层中；分子结构。
图14：嵌入显式POPC脂质双分子层中的色胺-HTR2A复合物。 受体以卡通形式展示，横跨脂质双分子层；POPC脂质以线条表示，磷酸头部基团被突出显示；色胺位于正构结合口袋内。膜的上下方显示有水分子。请点击此处查看该图的放大版本。

分子动力学分析、RMSD、RMSF 图谱、蛋白质稳定性可视化、波动数据
图 15：色胺-HTR2A/6A93 复合物在显式 POPC 脂双层中 200 ns 的分子动力学轨迹分析。（A）主链 RMSD 曲线。（B）残基级别 RMSF 曲线。（C）回转半径曲线。（D）溶剂可及表面积（SASA）曲线。（E）蛋白质-配体氢键数量。请点击此处查看该图的放大版本。

色胺接触图，Asp155，200 纳秒，距离（纳米）与时间关系，轨迹分析，分子动力学图。
图 16：色胺与 Asp155（D3.32）离子相互作用在 200 纳秒膜轨迹中的持续性。 图示为色胺铵离子氮原子与 Asp155 羧酸根氧原子之间的最短距离随时间的变化；虚线标示 0.4 nm 的盐桥接触阈值。该接触在模拟过程中维持了 99.9% 的时间。请点击此处查看此图的放大版本。

基因符号来源代谢物功能类别log2FCFDR（校正P值）显著性等级
GCG丙酸肽类激素相关蛋白−1.3421.97e−7FDR <0.001 & |logFC| > 1
HDAC3丁酸酶−1.2342.44e−6FDR <0.001 & |logFC| > 1
CASP3尿石素A酶−1.1986.66e−7FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPR68丙酸膜受体−1.1374.35e−6FDR <0.001 & |logFC| > 1
GNAQ丙酸细胞内信号蛋白−1.1221.05e−6FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPHN丙酸其他细胞内蛋白−1.1091.13e−6FDR <0.001 & |logFC| > 1
TBXA2R丙酸膜受体−1.1044.04e−7FDR <0.001 & |logFC| > 1
HTR6色胺膜受体−0.9672.17e−5FDR <0.001
VDR石胆酸核受体−0.9425.73e−7FDR <0.001
HTR2A色胺膜受体−0.9374.99e−6FDR <0.001
FFAR2丙酸膜受体−0.8891.44e−4FDR <0.001
NR1H4石胆酸 / 熊去氧胆酸核受体−0.8613.68e−6FDR <0.001
HTR2B色胺膜受体−0.7021.29e−4FDR <0.001
MLN丙酸肽类激素相关蛋白−0.6057.39e−5FDR <0.001
KYAT1吲哚-3-乳酸 / 吲哚-3-丙酸酶−0.5303.61e−4FDR <0.001
CASR丙酸膜受体−0.4834.05e−4FDR <0.001
HTR1B色胺膜受体−0.4553.18e−2FDR <0.05

表1：IBS-C直肠黏膜数据集中差异表达基因与预测的代谢物相关靶基因的重叠情况。 所列重叠基因均为下调基因。表1作为电子表格单独提交，其中列出了每个靶基因对应的来源代谢物、功能类别、靶点预测来源（化学-蛋白质相互作用靶点预测、分子对接程序，或两者均有）、化学-蛋白质相互作用靶点预测的综合相互作用评分，以及在可用情况下的分子对接程序预测概率、预测等级、log2倍数变化、FDR及表达显著性等级。数据来源：基因表达值来自GSE36701基因折叠后的差异表达表（每个基因取FDR最低的探针）。靶点预测来源及置信度值根据化学-蛋白质相互作用靶点预测和分子对接程序的输出结果整合而成，筛选阈值为化学-蛋白质相互作用靶点预测综合评分≥0.700，分子对接程序预测概率≥0.70。化学-蛋白质相互作用靶点预测评分为0–1范围内的综合评分；STP表示分子对接程序预测概率。等级1（Tier 1）= 化学-蛋白质相互作用靶点预测严格支持；等级1+（Tier 1+）= 化学-蛋白质相互作用靶点预测严格支持且得到分子对接程序交叉验证。

复合物蛋白 (PDB ID)配体Vina 评分 (kcal/mol)空腔体积 (A^3)格点中心 X,Y,Z (A)搜索盒 (A)
LCA-VDRVDR (1DB1)石胆酸−10.0205510, 19, 3325 x 25 x 25
LCA-NR1H4/FXRNR1H4/FXR (3DCT)石胆酸−9.93395137, 31, 7825 x 25 x 25
UDCA-NR1H4/FXRNR1H4/FXR (3DCT)熊去氧胆酸−9.43395137, 31, 7825 x 25 x 25
尿石素 A-CASP3CASP3 (2DKO)尿石素 A−7.123337, 34, 3225 x 25 x 25
色胺-HTR2AHTR2A (6A93)色胺−7.1323812, −1, 6125 x 25 x 25

表2：分子对接结果：五种优先级最高的蛋白-配体复合物中，代谢物配体与靶标蛋白对接的最高排序分数及结合腔参数。 结合腔大小以 Å3 表示。数据来源：Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx，工作表 'Original_Docking_Scores'。代谢物配体与靶标蛋白的分子对接；对接搜索穷尽性（exhaustiveness）= 8，随机种子（seed）= 42（固定），所有复合物的对接模式数（num_modes）= 9；报告最高排序（模式1）的构象。

相互作用类型残基距离 (Å)备注
传统氢键Ser2784.29LCA 羧酸根氧原子
疏水/π-烷基接触Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397-
范德华接触Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150-

表3：石胆酸与VDR（PDB ID: 1DB1）对接生成的结合模式。 来源：分子可视化及二维配体-残基相互作用图工具2D配体-残基相互作用图，如文稿结果部分（分子对接）所述。‘-’表示该相互作用距离未单独报告。

相互作用类型残基距离 (Å)备注
氢键His294-
氢键Ile335-
Pi-σ 相互作用His294-
烷基 / Pi-烷基（疏水相互作用）Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447-
范德华接触其他结合口袋残基（来源中未单独列出）-支持甾体骨架的容纳

表4：石胆酸与NR1H4/FXR（PDB ID: 3DCT）对接生成的结合模式。

来源：分子可视化和二维相互作用图工具2D配体-残基相互作用图，如文稿结果部分（分子对接）所述。“-”表示该接触未单独报告距离值。

相互作用类型残基距离 (Å)备注
传统氢键His4473.66
氢键Gly3223.46
π-阴离子相互作用Val3254.96
碳-氢键Trp4694.51
不利的供体-供体接触Arg3953.89
不利的供体-供体接触Gln3963.40

表5：熊去氧胆酸与NR1H4/FXR对接生成的结合模式（PDB ID: 3DCT）。 来源：分子可视化及二维相互作用图工具生成的二维配体-残基相互作用图，详见论文结果部分（分子对接）。‘-’表示该相互作用距离未单独报告。

相互作用类型残基距离 (Å)备注
常规氢键Gln1613.78
常规氢键Gln1614.19第二个接触点
常规氢键Ser1203.95
常规氢键Arg2073.05
常规氢键Arg2073.77第二个接触点
π-阳离子相互作用Arg207-
π-供体氢键Cys163-
π-烷基 / 范德华接触Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206-

表6：尿石素A与CASP3（PDB ID: 2DKO）分子对接生成的结合模式。 来源：分子可视化及二维相互作用图工具2D配体-残基相互作用图，如论文结果部分（分子对接）所述。‘-’表示该相互作用距离值未单独列出。

相互作用类型残基距离 (Å)备注
静电盐桥Asp155 (D3.32)-色胺的质子化胺基
氢键Thr160-
氢键Ser159-
芳香环接触Phe340, Trp336-
π-烷基相互作用Val156, Ile163-
范德华接触Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123-

表7：色胺与HTR2A（PDB ID: 6A93）对接生成的结合模式。 来源：分子可视化及二维配体-残基相互作用图工具（2D ligand-residue interaction diagrams），如论文结果部分（分子对接）所述。‘-’表示该相互作用距离未单独报告。

(A) 重新对接验证（阳性对照）
PDB ID蛋白质共结晶配体Vina 评分 (kcal/mol)RMSD (Å)阈值 (Å)结果
1DB1VDRVDX (维生素D类似物)−13.00.872.0PASS
3DCTFXRWAY-362450 (064)−11.91.792.0PASS
(B) 交叉对接验证（阴性对照）
配体同源靶标 (PDB)同源评分 (kcal/mol)非同源靶标 (PDB)非同源评分 (kcal/mol)差值 (kcal/mol)选择性
Lithocholic acidVDR (1DB1)−10.0CASP3 (2DKO)−8.31.7确认
TryptamineHTR2A (6A93)−7.1VDR (1DB1)−6.40.7中等（在 Vina 不确定性范围 +/−0.5–1.0 内）

表8：对接协议验证结果：重对接RMSD值（阳性对照）和交叉对接评分（阴性对照）。 来源：Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx 和 Docking_Validation/Logs/*.log（代谢物配体与靶标蛋白的分子对接，搜索穷尽性 = 8，随机种子 = 42，对接盒子尺寸为 25 Å × 25 Å × 25 Å）。RMSD通过重原子、原子名称匹配计算得出（无结构叠合）。

复合物RMSD (nm)，均值 ± 标准差（范围）Rg (nm)，均值 ± 标准差（范围）SASA (nm^2)，均值 ± 标准差（范围）氢键数，均值 ± 标准差（范围）RMSF (nm)，均值（最大值）
LCA-VDR/1DB10.230 ± 0.025 (0.167–0.296)1.889 ± 0.009 (1.863–1.919)130.4 ± 2.3 (122.3–137.4)1.9 ± 0.9 (0–7)0.093（最大值 0.600，位于残基 120）
LCA-NR1H4/FXR/3DCT0.190 ± 0.020 (0.135–0.281)1.824 ± 0.008 (1.804–1.849)129.7 ± 2.3 (121.9–138.1)3.8 ± 0.7 (1–6)0.113（最大值 0.298）
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT0.190 ± 0.020 (0.135–0.281)1.834 ± 0.013 (1.809–1.921)131.0 ± 3.4 (121.6–143.5)1.1 ± 1.1 (0–5)0.113（最大值 0.298）
Urolithin A-CASP3/2DKO0.521 ± 0.058 (0.244–0.755)1.892 ± 0.024 (1.839–1.984)134.9 ± 3.0 (126.4–146.4)0.6 ± 0.7 (0–3)1.172（最大值 2.532，位于残基 175）
Tryptamine-HTR2A/6A93 (membrane)0.177 ± 0.017 (0.131–0.227)2.089 ± 0.007 (2.070–2.116)165.1 ± 2.7 (156.–172.7)1.7 ± 0.7 (0–4)0.090（最大值 0.319）

表9：五种优先级蛋白-配体复合物（包括膜嵌入的色胺-HTR2A体系）200纳秒分子动力学模拟行为的汇总。 数据来源：依据实验方案第8.8步，对每个200纳秒生产阶段的最后150纳秒（50–200纳秒）分子动力学轨迹分析工具（.xvg文件）——gmx rms、gmx gyrate、gmx sasa、gmx hbond、gmx rmsf——进行计算。RMSD/Rg基于主链拟合；SASA探针半径为0.14 nm；氢键供体-受体截断距离为0.35 nm / 30°。LCA-3DCT和UDCA-3DCT共享一条蛋白主链轨迹（RMSD、RMSF），但具有配体特异性的Rg/SASA/氢键数据。

色胺-HTR2A/6A93（膜）— 按残基定量分解
残基总ddG贡献值（kcal/mol），均值 ± 标准差作用方向
Asp155 (D3.32)−89.94 ± 6.81稳定作用（主导）
色胺（配体）−13.01 ± 6.22稳定作用
Tyr17113.62 ± 4.54去稳定作用
Val16723.32 ± 3.96去稳定作用
Val15620.03 ± 3.81去稳定作用
Thr1604.86 ± 3.64去稳定作用
Ser15924.16 ± 3.48去稳定作用
Ser8624.48 ± 3.65去稳定作用
Phe8735.18 ± 4.04去稳定作用
Phe13332.80 ± 3.70去稳定作用
Phe14030.63 ± 3.84去稳定作用
Phe14135.25 ± 3.55去稳定作用
Ile16327.64 ± 3.71去稳定作用
Trp13753.77 ± 4.32去稳定作用（最不利）
其余四个复合物 — 残基分解中鉴定出的残基（定性）
复合物残基作用方向
LCA-VDR/1DB1配体（LCA）有利作用
LCA-VDR/1DB1Gln317有利作用
LCA-VDR/1DB1Trp286不利作用
LCA-NR1H4/FXR/3DCTArg331有利作用（主导）
UDCA-NR1H4/FXR/3DCTGlu326混合/分布网络
UDCA-NR1H4/FXR/3DCTAsp394混合/分布网络
UDCA-NR1H4/FXR/3DCTArg395混合/分布网络
UDCA-NR1H4/FXR/3DCTArg441混合/分布网络
UDCA-NR1H4/FXR/3DCTAsp470混合/分布网络
尿石素A-CASP3/2DKOArg64强有利作用（极性/静电）
尿石素A-CASP3/2DKOArg207强有利作用（极性/静电）

表10：每残基MM-PBSA分解简要摘要：五个优先考虑的蛋白-配体复合物中具有稳定或去稳定作用的残基（绝对贡献值 ≥ 0.5 kcal mol⁻1），包括嵌入膜中的色胺-HTR2A体系。 数据来源：Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat（分子力学/连续溶剂结合能计算工具广义玻恩模型（GB）的每残基分解结果，“复合物：总能量分解”）。残基编号已从CHARMM-GUI构建系统的内部编号（偏移量+68）转换为本论文其他部分所使用的原始PDB编号6A93。

来源：先前的分子动力学模拟数据/1DB1,2KD0, LCA 与 UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg 以及论文结果（MM-PBSA 结合自由能及逐残基分解）。这四个复合物在项目目录中没有数值形式的逐残基 .dat/.csv 输出文件（仅有渲染后的 SVG 图像，其文本为矢量路径，无法机器提取）；仅在论文文本中报告了残基身份及其促进或抑制结合的方向性信息。这四个复合物的精确 kcal/mol 贡献值在源代码仓库中不可获取。

讨论

这项探索性计算研究展示了一种整合的、可重复的工作流程，用于优先筛选与微生物代谢物相关的宿主基因及蛋白-配体复合物，并在此应用于一个公开的便秘型肠易激综合征（IBS-C）直肠黏膜转录组数据集。通过该工作流程，一组预测的与微生物代谢物相关的基因与数据集中持续下调的基因重叠，这些基因富集于G蛋白偶联受体（GPCR）、5-羟色胺能、钙信号传导、神经活性配体-受体以及核受体相关通路中，这些系统在微生物群-宿主通信中的作用日益受到关注48,49。这些发现应严格视为假设生成性的结果：本分析并未测量微生物代谢物浓度、受体蛋白丰度、配体结合、受体激活、下游信号传导、肠道运动、分泌功能、疼痛反应或临床结局。最有力的可支持结论是，所鉴定出的基因和通路是值得进一步实验验证的候选对象，而非已被证实的疾病机制。

相较于以往仅孤立研究单一代谢物-受体配对的工作，本方案的关键意义在于将靶点预测、公共转录组学数据、网络分析、分子对接（含验证对照）、分子动力学模拟以及MM-PBSA方法整合为一个连续的优先级排序流程。每个阶段均对前一阶段产生的候选结果进行筛选和生物学背景化，这种逐级过滤机制使得最终的候选列表在实验上具有可操作性。本文鉴定出的以GNAQ为核心的GPCR模块以及与5-羟色胺受体相关的模块在生物学上具有合理性：Gq信号通路在磷脂酶C激活、肌醇1,4,5-三磷酸生成、钙离子动员、分泌过程及肠内分泌功能中发挥重要作用；短链脂肪酸和色氨酸代谢产物介导的信号通路在黏膜稳态中具有明确功能，而5-羟色胺能信号在胃肠道运动、分泌、内脏敏感性及肠-脑通讯中亦有公认作用10,18,50,51。

本研究的一个关键方法学特征是对膜嵌入型受体 HTR2A 的处理。由于溶液相模拟无法重现调控 G 蛋白偶联受体构象行为的脂质环境，因此在明确的 POPC 双分子层中对色胺-HTR2A 复合物进行了模拟。在此膜环境中，受体在整个 200 ns 的轨迹过程中保持结构稳定，且色胺的铵基与 Asp155（D3.32）之间的盐桥在几乎整个模拟过程中均得以维持。三种独立证据——对接构象、轨迹中持续的接触距离以及每残基 MM-PBSA 分析的主要贡献——均指向相同的保守 D3.32 相互作用，这为预测的色胺结合模式提供了内在一致性，该模式重现了胺类配体在5-羟色胺受体上的典型结合几何构型。

在重复本工作流程时，需考虑某些方法学问题。经典结构错误或泛测定干扰化合物（PAINS）标记的化合物会通过靶点预测和分子对接传播，因此需要准确选择代谢物并进行化学信息学的审慎整理。应始终应用置信度标准（化学-蛋白质相互作用靶点预测：≥0.700；分子对接程序：≥0.70；蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与通路富集：≥0.700），以减少由噪声驱动产生的靶点集合。预测的靶点应按功能类别进行分组，以避免将所有与代谢物相关的基因误判为受体。PDB结构的精确预处理、配体能量最小化以及在已知结合残基周围合理设置网格是对接过程中的关键环节；本文引入的自对接和交叉对接对照可为对接方法的正确性提供客观评估。分子动力学的可重复性范围由力场参数化、适当的溶剂化或膜结构构建、分阶段平衡以及充分的生产阶段采样共同决定。

常见的调整和故障排除步骤包括：如果目标预测未返回任何结果，可放宽阈值；对于具有多个探针的基因，需在探针水平检查方向一致性；将孤立的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建和通路富集节点解释为依赖于阈值的结果，而非生物学上无关的信号。对于膜受体，应使用明确的脂质双分子层模拟而非水相模拟，本文所述的HTR2A方法即为范例。当需要进行残基级别的能量分解时，必须使用具备分解功能的计算引擎，并将报告的残基编号与天然受体的编号对应，以避免歧义。我们建议将通路富集结果视为候选基因列表的组织性背景，而非通路水平的验证依据。从机制上看，只要基因列表中包含多个5-羟色胺受体基因，无论蛋白质水平是否存在共调控，都可能导致G蛋白偶联受体（GPCR）、5-羟色胺能或钙信号通路术语的富集。在分析嵌入膜中的HTR2A体系的RMSD、Rg和RMSF值时，应考虑脂质双分子层的影响：轨迹后期Rg的降低可能反映的是双分子层驱动的跨膜结构域构象适应，而非整体去折叠；配体-蛋白质间持续存在的氢键应结合整体RMSD的稳定性一并解读。

本研究的局限性较大，限制了结果的解释。研究基于一个相对较小的公共数据集，且在主要的公共转录组数据库（基于网络的差异基因表达分析工具和 ArrayExpress）中未发现与本研究设计和平台相当的独立肠易激综合征便秘型（IBS-C）直肠黏膜转录组数据集，可用于分析时的重复验证队列。缺乏独立的转录组重复验证是一项主要局限性，本文中的任何结论均不应被解读为对单数据集发现结果的外部验证。该数据集显示出近乎普遍的差异表达（约 94.5% 的基因具有显著性，其中绝大多数为下调），这一特性使得传统的富集统计方法失去信息价值，无法得出关于靶基因下调相对于基因组背景特异性的结论；因此，重叠结果仅作为描述性的方向性模式报告，而非统计学上的富集。 bulk 黏膜转录组学无法区分真实的基因调控与细胞组成变化。mRNA 表达水平不能决定蛋白质丰度或功能反应。靶点预测数据库存在注释偏差，而分子对接、分子动力学（MD）和 MM-PBSA 的结果依赖于力场的选择、配体参数化、起始位置、模拟时间以及采样充分性。部分网络服务器和软件包组件的精确版本/构建标识未知，包括 CHARMM 兼容配体参数化服务、CHARMM-GUI 和统计计算环境

软件包构建以及分子力学/连续溶剂结合能计算工具的子版本无法从存档的项目记录中完全恢复，应注明在单独的材料表中提供。MM-PBSA 值为相对估算值，不包含显式的构型熵项，不应被解释为实验测得的亲和力。本研究缺乏代谢组学数据，无法确定在便秘型肠易激综合征（IBS-C）中配体的可及性是否发生改变，也无法判断所观察到的表达变化是病因、结果、代偿性反应还是无关的相关性。

该方法的未来应用应包括独立的转录组学重复验证、定量聚合酶链式反应（qPCR）和蛋白质水平验证，通过单细胞或空间转录组学进行细胞类型定位，对相关代谢物类别进行代谢组学分析，以及在患者来源的结肠类器官、黏膜外植体或类似模型中开展功能性配体-反应检测。与腹泻型肠易激综合征、混合型肠易激综合征、炎症性肠病及非肠易激综合征型便秘队列1,2的比较将有助于确立疾病的特异性。在结构研究方面，重复分子动力学（MD）轨迹模拟、采用不同初始构象进行敏感性分析，并完整记录拓扑结构、轨迹以及MM-PBSA输入和输出文件的存放信息，将进一步增强研究的可重复性。实验性的配体-反应检测仍是确定优先结合复合物是否具有功能相关性的必要手段；目前的结果尚不支持任何临床或治疗方面的主张。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究未获得外部资金支持。谨此感谢GSE36701数据集以及STITCH、SwissTargetPrediction、SwissADME、STRING、RCSB蛋白质数据库、基因表达综合数据库、CHARMM-GUI和膜蛋白取向（OPM）资源的公开获取，同时感谢AutoDock Vina、GROMACS、CHARMM36m、CGenFF、gmx_MMPBSA、Open Babel、PyMOL和Discovery Studio Visualizer软件的公开使用。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AutoDock VinaScripps Research / 开源v1.2.7；https://vina.scripps.edu/ 代谢物配体与靶蛋白的分子对接。
CGenFF/ParamChemSilcsBio / 马里兰大学v4.6；https://cgenff.com/用于分子动力学模拟的配体力场参数化。
CHARMM36m 力场CHARMM 开发团队 / 开源CHARMM36m；https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/用于分子动力学模拟的蛋白质力场。
CHARMM-GUI 膜构建器CHARMM-GUI / 利哈伊大学网络服务器；具体版本不可追溯；https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane显式POPC膜系统的构建与平衡设置。
Discovery Studio VisualizerBIOVIA (Dassault Systèmes)2021；https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download二维配体-残基相互作用分析。
GEO2RNCBI 基因表达综合数据库网络工具；访问时间：2026年1月至5月；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/GSE36701 的差异表达分析。
GeneCards魏茨曼科学研究所网络数据库；访问时间：2026年1月至5月；https://www.genecards.org/在靶点标准化过程中进行基因符号和基因信息验证。
gmx_MMPBSA开源（Valdés-Tresanco 等）1.5.x；https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/MM-PBSA 结合自由能估算及残基分解分析。
GROMACSGROMACS 开发团队 / 开源2024.2；https://www.gromacs.org/分子动力学模拟引擎。
GSE36701 转录组数据集NCBI 基因表达综合数据库GSE36701；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701公开的肠易激综合征便秘型（IBS-C）直肠黏膜表达数据集。
Open Babel开源3.2.0；https://openbabel.org/化学文件格式转换、三维配体生成及配体预处理。
OPM 数据库密歇根大学网络数据库；访问时间：2026年1月至5月；https://opm.phar.umich.edu/用于对齐 HTR2A 的膜蛋白取向坐标数据库。
ParmEdParmEd 开发团队 / 开源4.x；https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html氢原子质量重分配及分子模拟拓扑结构处理。
PyMOLSchrödinger / 开源2.x；https://www.pymol.org/三维结构可视化及受体-配体图像绘制。
RCSB 蛋白质数据库RCSB PDB网络数据库；访问时间：2026年1月至5月；https://www.rcsb.org/实验蛋白质结构及PDB坐标的来源。
STITCHSTITCH 联盟（EMBL）v5.0；https://stitch.embl.de/化学-蛋白质相互作用靶点预测。
STRINGSTRING 联盟 / ELIXIRv12.0；https://version-12-0.string-db.org/蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与通路富集分析。
SwissADMESIB 瑞士生物信息学研究所 / 洛桑大学网络工具；访问时间：2026年1月至5月；https://www.swissadme.ch/化学信息学描述符、药代动力学预测及PAINS评估。
SwissTargetPredictionSIB 瑞士生物信息学研究所 / 洛桑大学网络工具；访问时间：2026年1月至5月；https://www.swisstargetprediction.ch/基于配体的人类蛋白质靶点预测。
UniProt ID 映射UniProt 联盟网络服务；访问时间：2026年1月至5月；https://www.uniprot.org/id-mapping将蛋白质标识符映射为标准化的HGNC批准基因符号。
NVIDIA RTX 3080NVIDIA 公司RTX 3080；≥8 GB 显存；论文中未指定 CUDA/驱动版本支持 CUDA 的图形处理器，用于分子动力学模拟。
CUDA 兼容 GPUNVIDIA 公司论文中未指定 CUDA 工具包版本；≥8 GB 显存支持 CUDA 且显存 ≥8 GB 的 GPU；工作站还需配备 ≥32 GB 内存和 6 核 CPU。
Ubuntu LinuxCanonical Ltd. / 开源22.04 LTS64 位 Linux 操作系统。
Python 3.9Python 软件基金会3.9用于工作流脚本编写和数据分析的通用编程环境。
基因表达综合数据库（GEO）NCBI / 美国国家医学图书馆公共网络存储库；论文中未指定软件版本公共功能基因组学数据存储库。
AutoDockTools/MGLTools分子图形学实验室，Scripps Research1.5.7分子结构与对接输入准备工具包。
GROMACS 分析工具GROMACS 开发团队 / 开源2024.2分子动力学轨迹分析工具。
CHARMM-GUI 六步协议CHARMM-GUI / 利哈伊大学网络协议；具体版本不可追溯基于网络的多阶段分子系统准备与平衡工作流程。
cgenff_charmm2gmx_py3.py开源转换脚本；论文中未注明来源论文中未指定版本力场拓扑结构转换脚本。
PythonPython 软件基金会3.9通用编程环境。
SciPySciPy 社区 / 开源论文中未指定版本科学计算库。
scipy.stats.fisher_exactSciPy 社区 / 开源论文中未指定 SciPy 版本Fisher’s 精确检验实现。
R统计计算基金会4.3.x统计计算环境。
BioconductorBioconductor 项目 / 开源3.18生物信息学软件框架。
limmaBioconductor 项目 / 开源论文中未指定版本差异基因表达分析软件包。
Benjamini–Hochberg 方法统计方法不适用（统计过程）错误发现率校正方法。
NVIDIA RTX 3080NVIDIA 公司RTX 3080；≥8 GB 显存；论文中未指定 CUDA/驱动版本至少配备 8 GB 显存的图形处理器。
CUDA 兼容 GPUNVIDIA 公司论文中未指定 CUDA 工具包版本；≥8 GB 显存支持通用并行计算的图形处理器。
Ubuntu Linux 22.04 LTSCanonical Ltd. / 开源22.04 LTS64 位 Linux 操作系统。
TIP3PCHARMM 力场开发团队 / 开源TIP3P；无适用软件版本三站点显式水模型。
MM/PBSAgmx_MMPBSA 开发团队 / 开源gmx_MMPBSA 1.5.x分子力学/泊松–玻尔兹曼表面面积结合能方法。

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