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使用基于EDTA脱钙法制备用于空间转录组学的福尔马林固定、石蜡包埋骨髓样本

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DOI：

10.3791/72474

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2026年8月28日

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1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

本文内容

摘要

制备用于空间转录组学的福尔马林固定、石蜡包埋骨组织样本的标准化流程包括为期10天的EDTA脱钙步骤，以保持RNA完整性。关键的质量控制检查点有助于判断样本是否符合下游空间基因表达分析的要求。

摘要

骨髓（BM）是一种复杂且动态的结构，其空间关系影响着细胞的行为、信号传导和功能。因此，要全面理解细胞相互作用的动态过程，需要采用能够保留并绘制细胞群体原位空间结构的互补性空间分析技术。in situ。尽管单细胞技术已取得显著进展，有助于揭示健康与病变骨髓组织的转录异质性，但不同细胞类型的空間组织、微环境特异性调控程序及其相互作用仍需进一步研究。近年来空间转录组学的发展使得在多种组织中能够进行具有空间背景的无偏基因表达分析，从而使这些技术成为缺乏空间分辨率的单细胞方法的重要补充。尽管空间转录组学已在软组织中广泛应用，但由于骨组织处理过程中的技术挑战，其在骨髓等矿化组织中的应用仍受限。本文所介绍的方案可用于制备来自健康及病变小鼠和人类组织的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本。方案中包含一个为期10天的乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙步骤，以保持RNA完整性，并支持在长骨样本上进行空间转录组学分析。本方案详细描述了骨髓样本的空间转录组学分析前处理流程，包括组织处理、保存和切片，以及关键的质量评估步骤，如切片完整性、组织形态学和RNA质量的评估。该工作流程还支持细胞类型鉴定，并可与单细胞转录组数据整合，用于表征细胞组成、定义细胞间相互作用，并可视化转录异质性细胞在健康与病变状态下的空间分布。总体而言，该流程可在保持骨髓结构完整性的同时，为完全矿化的健康及恶性组织进行空间转录组学分析做好准备。

引言

骨髓（BM）是一个高度复杂且具有区室结构的器官，是造血作用和免疫细胞成熟的主要场所1,2。这一异质性组织包含多种造血细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞谱系，它们共存于一个高度特化且有序的三维微环境之中3,4。在此微环境中，每种细胞群体占据特定的解剖区域，空间位置在调控细胞行为、信号传导和功能方面发挥着基础性作用4,5。细胞与特定结构（如骨小梁或血管网络）的物理邻近性调控着重要的生理过程，包括造血干细胞（HSC）静息状态的维持和骨重塑6,7。因此，这一动态微环境及其细胞与基质成分之间 tightly regulated 的相互作用，构成了维持稳态并影响血液系统恶性肿瘤进展的调控网络8,9,10,11,12,13。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步彻底改变了我们对骨髓细胞多样性的认知，使得人们能够发现此前未被识别的细胞亚型，并预测其在微环境中的相互作用3,10,11,12,14,15,16然而，单细胞转录组学虽然能够提供造血微环境各个组分的高分辨率信息，但其本身受限于组织消化过程，该过程会将细胞从其天然环境中解离，可能改变其天然状态17以及缺乏定义骨组织结构的空间环境4,18这种位置信息的丢失使得无法明确绘制出特定转录特征不同的细胞群体所处的位置，也无法确定它们如何与邻近细胞相互作用19此外，致密的骨组织通常只能部分解离，导致单细胞RNA测序数据集中关键细胞群体（如骨细胞和脂肪细胞）的代表性不足，从而造成组织异质性的偏差表征。20,21空间转录组学技术能够实现基因表达的研究 原位在空间结构得以保留的组织切片中，从而恢复其背景信息，并克服单细胞技术的局限性8,19,22,23,24,25,26该技术代表了该领域的关键进展，因为它能够实现对构成骨髓（BM）的不同细胞群体进行精确的空间定位和结构组织，这对于理解这些细胞在其天然微环境中的相互作用及功能角色至关重要。8,26此外，在疾病研究背景下，空间转录组学能够帮助研究人员和临床医生弥合传统病理学与高通量基因组学之间的鸿沟，从而将分子数据叠加到形态学图像上1,8空间转录组学技术可分为两大类：基于测序的方法和基于成像的方法17,24基于测序的平台，例如 Visium、Curio Seeker、GeoMx 数字空间分析仪（GeoMx DSP）、Stereo-seq、组织测序中的确定性条形码技术（DBiT-seq）以及开源平台 Open-ST，可在空间条形码阵列或微珠上捕获 mRNA，随后进行高通量测序。基于成像的方法包括多重抗误差荧光原位杂交（MERFISH） 原位 多重错误鲁棒荧光原位杂交（MERFISH）、分子图谱技术（Molecular Cartography）、RNAscope、CosMX 和 Xenium 可直接可视化转录本 原位 通过多重杂交或锁式探针化学法27,28或者，可根据平台是否需要基于探针的检测，将其分为靶向型和非靶向型17,24.

空间转录组学方法已广泛应用于脑、心和肝等软组织，这些组织易于制备完整的组织学切片29,30,31。相比之下，由于骨组织具有矿化特性，实施空间转录组学分析面临更大挑战，需进行脱钙处理32,33，即可控地去除磷酸钙，使组织软化以适用于切片以及后续的组织学或分子分析8,20,23,34。临床实践中常规使用的传统脱钙方法通常依赖强酸性溶液，如盐酸、硝酸、甲酸或磷酸，这些试剂会严重降解RNA完整性并破坏细胞形态35,36。此类分子降解会降低空间检测中的信噪比，导致基因检出率远低于软组织水平8,10。这一局限性凸显了建立标准化脱钙流程的必要性，以在基于测序的空间分析中可靠地保持矿化样本中的mRNA完整性8,20。

本方案介绍了一种用于制备福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）骨髓（BM）样本以进行空间转录组学分析的标准化流程，此前已被Muiños-Lopez等人8所采用。该流程包括在受控pH条件下使用乙二胺四乙酸（EDTA）进行为期10天的脱钙步骤。与强酸不同，EDTA作为一种温和的螯合剂，可有效保护显微结构并维持核酸质量，因而适用于分子生物学应用8,20,33,36,37。为验证该方案的可行性，已在健康及多发性骨髓瘤（MM）小鼠模型的骨组织样本以及来自健康个体和患者的中国台湾人骨髓样本上实施该流程，并在Visium空间基因表达平台38上进行测序。该流程涵盖了从人和小鼠骨组织样本中获取组织、固定、脱钙、脱水、石蜡包埋及切片的标准化操作，随后进行一系列质量控制步骤，包括切片完整性评估、苏木精和伊红（H&E）染色、RNA质量评价（DV200）以及可选的免疫荧光（IF）以验证细胞类型。这些预处理步骤确保仅有高质量的切片进入下游的空间转录组学流程，包括组织切片的预处理、文库构建、测序以及后续的数据质量控制与分析。

该标准化流程支持人和小鼠骨髓样本的空间转录组学分析前处理及质量评估，旨在促进对血液系统和骨骼系统疾病中特定微环境调控程序的研究。

方案

所有动物实验均依照欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU进行，并经纳瓦拉大学动物伦理委员会（Comité de Ética para la Experimentación Animal；方案编号CEEA082-20和CEEA039-20）批准。动物的饲养、操作和安乐死均遵循西班牙法律法规，以最大程度减少疼痛与痛苦。

本研究已获得纳瓦拉大学医学院研究伦理委员会（Comisión de Ética de Investigación, CEI；项目编号 2022.100mod1 和 2023.172）以及纳瓦拉卫生服务研究伦理委员会（CEIm–Departamento de Salud de Navarra；项目编号 PI_2022/92 MS-1）的批准。所有涉及人类受试者的操作均遵循《赫尔辛基宣言》的伦理原则。个人数据的处理严格保密，符合西班牙个人数据保护与数字权利保障法 3/2018（Organic Law 3/2018）以及西班牙生物医学研究法 14/2007（Law 14/2007）的规定。

注意：本研究中所用试剂与设备的详细清单见于文末 材料表骨组织中空间转录组学实施的完整实验流程示意图如图所示 图1 并分为三个操作阶段：样本获取、质量控制（QC）和空间转录组分析。样本获取包括采集人或小鼠的骨碎片，随后进行固定、EDTA脱钙、脱水、石蜡包埋以及切片和载玻片制备。质量控制阶段评估组织学完整性和RNA保存状况。经验证合格的骨切片随后进行载玻片上的组织通透、文库构建、测序及数据分析。

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图1：小鼠和人骨组织的样本采集及基于EDTA的制备流程。采集小鼠股骨和人骨样本，经固定、EDTA脱钙、脱水、石蜡包埋并切片。通过苏木精和伊红（H&E）染色和RNA完整性（DV200）评估样本质量，随后进行空间转录组组织预处理、文库构建、测序及数据质量控制。缩写：BM = 骨髓；DV200 = 长度超过200个核苷酸的RNA片段百分比；EDTA = 乙二胺四乙酸；H&E = 苏木精和伊红；QC = 质量控制。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 骨组织样本的获取与处理

  1. 小鼠骨骼采集
    1. 用5%异氟烷麻醉动物，并确认反射消失。
    2. 完全麻醉后，根据机构和监管指南，通过颈椎脱位实施安乐死。
      ​注意：安乐死必须由经过培训的人员执行，并在进行组织采集前确认动物已经死亡。
    3. 用70%乙醇喷洒小鼠背部表面以消毒皮肤，使用手术剪做一个小切口，小心去除皮肤并暴露后肢。
    4. 在髋关节上方切断后肢，取下后肢并转移至含有10 mL冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液的50 mL离心管中 （DPBS）。将试管置于冰上。
    5. 使用无菌镊子和手术刀去除附着的肌肉和结缔组织。
    6. 将骨骼转移至预先装有洁净、冰冷的DPBS的50 mL无菌容器中，然后将容器置于冰上。
    7. 立即进行样本组织固定以保持组织完整性。
  2. 人骨样本处理
    1. 将骨髓 core 活检样本或手术骨碎片置于 100 mL 无菌容器中接收。
    2. 将骨碎片转移至预先装有冷DPBS的洁净无菌100 mL容器中，然后置于冰上。
    3. 立即进行样品固定以保持组织完整性。
      注意：人类样本必须在生物安全二级（BSL 2）条件下操作。
  3. 骨组织固定
    1. 取装有骨样本的50 mL或100 mL容器，弃去DPBS。
    2. 标记塑料包埋盒，并将骨样本分别放入独立的包埋盒中。盖紧盒盖，以防止后续处理过程中组织丢失。
      ​注意：对于小鼠样本，每个包埋盒放置一块骨骼。对于人骨样本，如有必要，使用无菌手术刀将组织切割成足够小的碎片，以适配标准包埋盒，每个包埋盒放置一块碎片。如果人骨样本在此阶段过硬难以切片，可保持完整并转移至脱钙液中；待脱钙完成后，软化的组织可再切割成适当大小的碎片，并放入标记好的包埋盒中。
    3. 加入4%缓冲甲醛溶液，按1:20的样本与固定剂比例混合，于24 h内孵育样本 4 °C.
      注意：由于固定剂具有毒性且会释放挥发性气体，须在化学通风橱内操作。
      注意：避免过度固定>48 小时），这会降低福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）流程中的RNA完整性39.
  4. 矿化骨组织的脱钙
    1. 弃去福尔马林，用超纯水清洗骨样本。用水冲洗，短暂振荡，弃去液体，以去除残留的福尔马林。
    2. 用超纯水配制 0.25 M EDTA 溶液，并将 pH 调至 6.95。
      注意：尽管在传统的脱钙方案中，EDTA 通常调节至 pH 8.0，但本实验流程使用 pH 约为 6.95 的 EDTA，以在有效螯合的同时保持组织形态和 RNA 质量8.
    3. 将EDTA溶液加入盛有骨样本的容器中，在4 ℃下孵育10天 4 °C 轻柔振荡。
      ​注意：对于小鼠样本，通常使用约50 mL EDTA溶液即可；对于人骨样本，通常使用约100 mL。然而，可根据骨组织大小调整体积，以确保完全浸没和有效的脱钙。
    4. 5 分钟后 脱钙数天后，弃去EDTA溶液，并更换等体积的新鲜EDTA溶液，因为螯合能力会随时间推移而饱和。继续在相同条件下孵育。
    5. 孵育10天后，弃去EDTA溶液，并评估脱钙是否完全。
      1. 使用无菌手术刀在组织的角落或边缘区域做一个小切口，或插入一根细的无菌针头，始终选择分析意义较低的区域，以避免影响感兴趣区域。将骨组织置于无菌培养皿中，以在切割或插入针头时稳定样本。如果组织易于切割，或针头能以极小阻力穿过，则表明样本已充分脱钙。
      2. 对于小鼠股骨，可用镊子轻轻弯曲骨骼以评估其柔韧性，这是判断矿物质是否完全去除的可靠指标。
        注意：脱钙步骤的持续时间取决于骨样本的大小和厚度，以及所用EDTA的体积。如果初始孵育期后骨组织仍然坚硬，需继续脱钙直至组织足够柔软，易于切割。过度延长脱钙时间可能影响组织质量和RNA完整性，因此延长的时间应限制在达到充分软化所需的最短时间范围内。20.
  5. 脱水
    1. 用超纯水冲洗盛有骨样本的容器，然后在室温下孵育5分钟 4 °C 振荡。
    2. 弃去水，更换为70%乙醇溶液，于 4 °C.
      注意：此步骤可作为暂停点。样品可在70%乙醇中保存。 4 °C 在进行后续步骤之前。本方案未对最长保存时间进行实验验证，因此使用者应遵循各自实验室的标准操作规范进行操作。
    3. 依次用浓度递增的乙醇（70%、80%、96%；1 h 每个 4 °C），随后在100%乙醇中过夜 4 °C.
    4. 弃去100%乙醇，加入二甲苯。室温（RT）孵育4小时。
    5. 弃去二甲苯，将样本盒放入盛有熔融洁净石蜡的玻璃容器中，于熔融石蜡中孵育过夜，温度为 60 °C.
      注意：当使用真空辅助处理系统时，可缩短浸润时间，因为这些设备有助于更高效地渗透石蜡40,41,42.
      警告：所有涉及二甲苯和梯度乙醇溶液的操作步骤必须在化学通风橱内进行，以确保充分通风，并尽量减少接触有毒且易燃的蒸气。
  6. 石蜡包埋
    ​注意：使用RNase去污染溶液清洁包埋台表面，以防止RNA降解。
    1. 打开包埋机，预热石蜡储存区、包埋盒石蜡浴、包埋模石蜡浴和包埋模加热板至 60 °C开启冷台，使其在包埋前冷却。
    2. 让石蜡完全熔化后，再将含有石蜡浸透样品的包埋盒放入石蜡浴中。孵育2小时，以确保包埋前彻底清除二甲苯。
    3. 将所有必需的模具放入模具石蜡浴中。
      注意：对于人源样本，使用标准金属包埋模具。对于小鼠样本，使用与 Visium 平台兼容的塑料包埋模具，模具应包含一个方形腔室，其尺寸适合将组织切片准确放置于 Visium 载玻片上。由于完整的小鼠骨骼无法完全放入这些模具的方形腔室内，因此需在包埋前立即使用无菌手术刀将骨骼切割成合适大小的片段。每个模具可包埋一个或两个骨片段，具体数量取决于片段的尺寸。
    4. 通过包埋工作站的中央出蜡口加入一层薄薄的新鲜石蜡作为基底。
    5. 打开包埋盒，用预热的镊子将组织从包埋盒轻柔转移至模具中。
    6. 将装有石蜡的模具置于模具预热板上，在石蜡仍处于液态时，用预热的镊子将组织调整至所需的切面方向。
    7. 将模具置于包埋工作站的冷表面上，以短暂固定骨碎片的位置。
    8. 使用分配器将熔化的石蜡完全填充模具，确保组织被完全覆盖且无大泡残留。
    9. 将标记好的包埋盒置于模具上方，使其成为石蜡块的底部。
    10. 将带有包埋盒的模具转移至包埋机的冷台上。静置10分钟，使石蜡完全凝固，直至组织块呈现不透明且质地坚硬。
    11. 凝固后，将石蜡块从模具中取出并储存于 4 °C 直至切片前
      注意：此步骤可作为暂停点。石蜡包埋块可储存于 4 °C；然而，只要条件允许，应在包埋后尽快进行组织切片及后续的空间转录组学分析，以尽量减少储存期间的RNA降解43,44.
  7. 切片与载玻片制备
    注意：使用 RNase 去污染溶液清洁切片机和水浴槽，以防止 RNA 降解。
    1. 将蒸馏水加入水浴锅中，并预热至 42 °C打开切片机并安装新刀片。用铅笔标记载玻片。
    2. 将石蜡包埋块安装在标本夹持器中，确保包埋盒朝向符合所需的纵向切面方向。
      ​注意：准备一个装有冰块的塑料袋，当石蜡因过软而难以切片时，将冰袋直接放置在仍固定于切片机上的组织块上，用橡皮筋固定数分钟，以硬化石蜡，改善切片质量。
    3. 将切片机厚度设置为 20 µm 并执行修剪切割。
    4. 将切片机设置更改为5 µm. 收集四份 5 µm 将切片放入已标记的无RN酶的1.5 mL微量离心管中。将管子置于干冰上，并储存于-80 °C.
    5. 继续以5为间隔进行切片 µm 将切片条放入水浴中漂浮。待切片完全展开且无皱褶后，用标记好的载玻片将其捞起。
      1. 每隔一定数量的切片（例如每 5-10 条切片带，具体取决于组织大小），额外收集 4 到 5 张切片 µm 将切片转移至新标记的1.5 mL离心管中。重复此操作，直至获得总共三个含有5的1.5 mL离心管 µm 切片
        注意：如果组织出现裂纹、断裂或无法获得连续切片，则表明样本脱钙不完全，需要延长脱钙时间。通过逆向操作实验流程，将样本恢复至脱钙阶段。具体操作为，将石蜡包埋块在 60 °C 约2小时后，将样本转移至二甲苯中（2小时）。通过梯度乙醇溶液（100%、96%、80%、70%）使样本复水，随后转入蒸馏水中。将复水后的样本重新置于新鲜的0.25 M EDTA（pH 6.95）中，根据需要延长脱钙时间，然后进行脱水、重新包埋和切片。该恢复程序应仅作为最后手段严格使用，因为逆转FFPE处理可能影响RNA完整性。
    6. 将载玻片放入 37 °C 烘箱中过夜以蒸发残留水分，然后将其储存于 4 °C.
    7. 为增强组织黏附性，可选择将载玻片在 42 °C 在37°C下孵育过夜之前 37 °C.
      注意：使用本文件所列玻璃载片时，此步骤通常并非必需 材料表，因为这些载玻片具有较强的黏附性，组织通常在整个处理过程中保持牢固附着。此步骤可作为暂停点。载玻片可存放于 4 °C；但应尽可能在包埋后尽快进行后续的空间转录组学分析，以尽量减少储存期间的RNA降解43,44.

2. 样本质量评估

  1. 切片质量评估
    1. 在标准明场光学显微镜下（4倍）依次检查所有切片×–10×）。检查每张切片，确保组织切片无破碎，并记录每张切片的质量。
      ​注意：检查是否存在褶皱、裂纹、压缩或震颤痕迹，这些可能提示石蜡硬度、刀片锋利度或脱钙不完全存在问题。确认在切片或转移至水浴过程中无组织脱落导致的组织缺失区域。
    2. 选择保存最完好的组织区域用于空间转录组学分析（结构最完整、形态最佳）。
    3. 确定与所选部分相邻的连续区域，并将其保留用于 H&E 染色和免疫荧光，确保染色图像与将进行测序的组织尽可能对应。
  2. H&组织完整性伊红染色
    1. 将载玻片放入玻璃载玻片染色架中，在室温下孵育15分钟 60 °C.
    2. 将架子转移至盛有二甲苯的玻璃染色缸中，处理15分钟 分钟
    3. 将切片架依次移入盛有100%、96%、80%和70%乙醇的染色缸中，进行水化，每缸孵育5分钟 每种溶液中孵育时间均为 min。
      ​警告：所有涉及二甲苯和梯度乙醇溶液的操作步骤必须在化学通风橱内进行，以确保充分通风，并尽量减少接触有毒且易燃的蒸气。
    4. 将载玻片冲洗5次 在盛有水的染色缸中孵育 min。
    5. 将染色架浸入苏木精染液中10分钟，然后用流动的自来水冲洗，直至冲洗液变得澄清。
    6. 将架子浸入含有五滴浓盐酸的水中，轻轻搅动，直至出现红褐色色调。
    7. 将架子转移至用碳酸锂饱和的水中，直至出现稳定的蓝色，然后在水中短暂冲洗。
    8. 用1%（w/v）伊红染色5分钟，然后再次用清水冲洗。
    9. 将载玻片架依次浸入盛有水、70%、80%、96% 和 100% 乙醇的染色缸中进行脱水，每种溶液中孵育 5 分钟。
    10. 用二甲苯清洗载玻片 15 分钟 最小
    11. 轻轻擦干每张载玻片背面，在盖玻片上滴加封片剂，然后封片。将载玻片置于室温下干燥 室温孵育24小时 成像前 h
    12. 使用高分辨率显微镜以20倍放大倍数进行组织成像。
      注意：执行 H&E 染色相邻切片，首先作为质控步骤以评估样本是否适用于空间转录组学分析。选定后，进行第二次 H&E 染色直接在用于空间转录组学的切片上进行，遵循空间基因表达平台制造商在相关指南中列出的组织制备说明 材料表.
  3. RNA完整性评估（DV200）
    ​注意：在空间基因表达实验方案中，传统的RNA完整性指数（RIN）并不适用，因为固定组织中通常缺乏18S和28S核糖体RNA峰。因此，DV200指标（定义为长度超过200个核苷酸的RNA片段所占的百分比）比RIN更常被用作评估RNA质量的有效参数 对于降解的临床样本。Visium v2 平台，10x Genomics 建议使用 DV200 值 ≥ 30% 的 FFPE 组织块，以确保探针有效杂交和最佳检测性能。选择可用 DV200 值最高的组织块有助于防止测序数据丢失并最大化点阵的检测灵敏度。
    1. 取出含有样本的1.5 mL离心管 5 µm 在组织切片步骤中收集的切片置于冰上，以提取RNA。
    2. 提取总RNA。该标准化流程包括样本脱蜡、蛋白酶K消化以逆转甲醛交联、DNase I处理去除基因组DNA，以及最终将纯化的RNA洗脱于无RN酶的水中。
    3. 使用基于毛细管电泳的高灵敏度 RNA 检测系统评估 RNA 完整性。工作流程概要如下所示 补充文件 142,45,46,47,48.
  4. 可选的细胞类型验证免疫荧光
    1. 将FFPE切片放入玻璃载玻片染色架中，在以下条件下孵育15分钟 60 °C.
    2. 将架子转移至含有二甲苯的玻璃染色缸中，处理15分钟 最小
    3. 将切片置于染色架中，依次在100%、96%、80%和70%乙醇中各孵育2分钟进行水化，随后在水中孵育5分钟，再在PBS-Tween（含0.1% Tween-20的1× PBS）中孵育5分钟。
      警告：所有涉及二甲苯和乙醇的操作步骤必须在化学通风橱内进行。
    4. 根据一抗说明书推荐的方法进行抗原修复，确保修复缓冲液、pH值和加热条件与抗体说明书一致。注：本实验流程中采用10 mM Tris和1 mM EDTA，pH 9.0，在煮锅加热系统中加热30 min 95 °C，然后在室温下冷却20分钟。
    5. 用 PBS-Tween 洗涤载玻片，每次 10 分钟，共洗涤两次。
    6. 使用疏水屏障笔在组织周围画出疏水屏障，并通过加入含5% BSA的1x DPBS溶液封闭组织切片，以阻断非特异性结合，作用时间至少40分钟 室温湿盒中孵育最小时间
      注意：通过在塑料切片染色盒中放置一张滤纸，并用蒸馏水充分浸湿，以在抗体孵育期间维持稳定的湿润环境，从而制备湿盒。
    7. 在1x DPBS中按每种抗体推荐的稀释比例配制一抗溶液。
      注意：在此工作流程中，分别使用针对 Emcn（V.7C7）和 Cd271（ME20.4）的一抗来鉴定小鼠内皮细胞（EC）和间充质干细胞（MSC），而根据制造商的说明书，使用针对 CD31（JC70A）或 PRRX1（多克隆）的抗体来鉴定其人源对应细胞。
    8. 轻轻将玻片边缘在吸水纸上轻拍，以去除残留的封闭液液滴，然后加入一抗混合液，于4 °C 避光孵育过夜 4 °C 在湿化室中。
    9. 将载玻片在 PBS-Tween 中洗涤两次，每次 5 分钟。按照制造商推荐的稀释比例配制二抗溶液，确保荧光染料光谱兼容且不重叠。
      注意：在此实验流程中，使用了 Alexa Fluor 标记的二抗，稀释比例为 1:200。
    10. 加入二抗混合液，孵育30分钟 室温下避光孵育，置于湿盒中。
    11. 用 PBS-Tween 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤两次。
    12. 用1:1的PBS-甘油溶液将含DAPI的封片剂（见材料表）稀释至1:10，取适量滴加于样品，孵育5分钟。
    13. 用盖玻片封片，并用指甲油密封边缘以防止干燥。
    14. 使用多光谱成像平台观察染色组织。

补充文件1：RNA完整性评估和Visium空间转录组学工作流程的步骤概要。 本补充文件提供了按照制造商说明书执行的操作步骤的详细总结，包括：（i）高灵敏度RNA ScreenTape检测，用于评估RNA完整性（DV200），如主方案第2.3.3步所述；（ii）Visium CytAssist空间基因表达工作流程概述，涵盖组织预处理、文库构建和测序（主方案第3.1–3.3步）。请点击此处下载该文件。

3. 空间转录组学

注意：使用 材料表 中列出的平台和试剂进行空间转录组学实验流程，并遵循相应的用户指南42,45,46。补充文件1 汇总了主要的组织预处理、文库构建和测序步骤。

  1. 空间转录组数据质量控制
    1. 使用 Visium 数据集的标准流程对空间转录组数据进行解卷积（参见 材料表).
    2. 将测序读段比对至相应的 Ensembl 105 参考基因组。
      注意：人类样本使用 GRCh38，小鼠样本使用 mm10。
    3. 使用相同的流程生成过滤后的特征-条形码矩阵，并将其导入下游的单细胞/空间分析环境（参见 材料表).
    4. 检查 H&E 图像在空间转录组学分析流程提供的可视化界面中（参见 材料清单）并根据数据集情况，手动去除与皮质骨区域或骨组织重叠的斑点。
    5. 使用单细胞分析工作流程中常用的方差稳定化转换方法对数据集进行标准化（参见 材料表).

结果

为了评估该基于EDTA的实验流程在不同物种和疾病背景下的适用性，本方案应用于四份骨髓样本：两份小鼠股骨样本和两份分别代表健康状态与多发性骨髓瘤（MM）状态的人类骨组织样本（表1和图1）。

样本编号物种性别年龄疾病状态
YFPcγ1MouseFemale210 daysHealthy
mMMMouseMale314 daysMM
hHBMHumanMale76 yearsHealthy
hMMHumanFemale50 yearsMM

表1：本研究中包含的小鼠和人类骨样本。 提供了每个样本的物种、性别、年龄和健康状况。缩写：hHBM = 健康人类骨髓；hMM = 人类多发性骨髓瘤；mMM = 小鼠多发性骨髓瘤；MM = 多发性骨髓瘤；YFPcγ1 = 健康对照小鼠。

本研究中使用的样本此前已在该研究团队的早期出版物中进行过表征和报道，具体见 Muiños-Lopez 等人和 Cenzano 等人的研究，但 MM 小鼠样本除外。对于此前已报道的样本，其空间转录组学数据和结果已在那些研究中呈现8,10。因此，本文所包含的材料仅用于评估该方案在空间转录组学中的技术适用性，而非呈现新的生物学发现。

小鼠股骨样本取自BIC（BIcγ1）基因工程多发性骨髓瘤（MM）小鼠模型及其相应的健康对照小鼠（YFPcγ1）8,49，该模型可重现MM患者的临床和免疫学特征。每只动物取单侧股骨，按照标准化方案进行采集、清理和处理（图2A）。选择股骨进行这些分析，是因为其骨髓含量丰富、微环境质量优良，且易于实现可重复性处理，非常适合基于测序的空间转录组学平台8,10。通过镊子手动操作时组织柔韧性显著增强，肉眼观察即可确认对照小鼠股骨脱钙成功（图2B）。随后，利用一种专为兼容空间转录组学设计的模具，将该骨组织片段高效地包埋于石蜡中，以在后续分子分析中保持RNA完整性和组织结构（图2C）。

还分析了两个处理历史不同的供体人骨髓（BM）样本8,10。一份来自血液学健康的供体，为纳瓦拉大学医院骨科髋关节置换手术过程中产生的手术废弃物中获取的新鲜人骨髓样本（图2D–F）。为展示本方案的转化应用价值，该样本的处理方式与小鼠样本相同。与小鼠组织观察到的结果一致，通过肉眼观察组织完全软化（表现为针头可无阻力穿入）可确认人骨组织已成功完成EDTA脱钙（图2E）。脱钙后的人骨碎片可使用标准金属模具成功包埋于石蜡中，用于后续处理（图2F）。第二个样本为来自纳瓦拉大学临床医院（CUN）病理科存档的多发性骨髓瘤（MM）患者髂嵴骨髓FFPE活检组织。值得注意的是，该存档的MM样本此前已采用含强酸的标准临床方案完成脱钙处理36。该样本可与EDTA处理的样本进行定性对比；然而，由于组织来源、固定历史、储存条件及脱钙方法均存在差异，所观察到的差异不能仅归因于脱钙剂的不同。

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图2：基于EDTA处理过程中的小鼠和人骨样本。（A）脱钙前完整的小鼠股骨对照样本。（B）脱钙后的小鼠股骨对照样本，显示柔韧性增强。（C）包埋在石蜡中的小鼠骨碎片对照样本。（D）髋关节手术中获取的未脱钙健康人骨碎片。（E）同一碎片经EDTA脱钙后的状态，显示针头可穿透。（F）EDTA脱钙后包埋于石蜡中的健康人骨样本。比例尺：（A, B）5 mm；（C–F）1 cm。缩写：EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid（乙二胺四乙酸）。请点击此处查看该图的放大版本。

为了分析一般组织结构，H&E 染色已进行（图3）。在小鼠切片中观察到的更佳形态学保存效果，可能反映了样本处理和加工过程中的差异，而非固有的物种特异性特征。小鼠股骨专为进行空间转录组学分析而采集，并作为完整骨骼立即进行处理，从而保留了其原有结构（图3A, B）。相比之下，人源样本则来自髋关节置换手术中获取的剩余组织材料（图3C) 或来自诊断性多发性骨髓瘤骨活检样本（图3D)，这两种样本的预分析组织质量可能存在差异。因此，EDTA 脱钙的人类样本与酸脱钙的多发性骨髓瘤活检样本之间的形态学差异较为细微，因为这两种人体标本均已表现出由脱钙过程以及常规组织处理所引入的基础结构局限性图3C, D）。 因此，对空间转录组学样本质量进行全面评估需要分析多个不同的参数。首先，必须仔细监测组织完整性，因为结构保存情况可能因具体样本类型而异，而不仅仅取决于所使用的脱钙酸。其次，还应评估RNA质量，因为脱钙条件可能对其产生影响。20,35,36.

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图3：用于组织质量评估的H&E染色切片。 连续的FFPE切片分别对应于（A）健康对照小鼠10、（B）多发性骨髓瘤（MM）小鼠、（C）健康人骨8,10以及（D）人多发性骨髓瘤活检样本8。比例尺 = 500 µm。缩写：FFPE = 甲醛固定、石蜡包埋；H&E = 苏木精和伊红；MM = 多发性骨髓瘤。 请点击此处查看该图的放大版本。

为补充组织学分析，对RNA质量进行了评估。尽管H&E染色显示的差异较为模糊，RNA完整性则清晰地区分了两种脱钙方法的效果（表2）。来自小鼠样本和健康人骨标本的DV200值均超过了Visium FFPE检测所推荐的阈值，表明RNA片段长度分布足以支持探针杂交和文库构建。YFP健康小鼠样本的DV200值为82.55%，健康人骨（hHBM）样本达到58%，均显著高于10x Genomics定义的30%可接受阈值。MM小鼠（mMM）样本的DV200值为31.3%，接近可接受范围的下限，这可能反映了石蜡包埋块在切片前于4 °C长期储存等因素的影响，以及其他样本特异性因素。相比之下，经酸法脱钙的人MM活检样本（hMM）DV200值仅为8%，其RNA完整性明显较低，即使形态学退化并不显著。综上所述，进行结构与分子双重评估对于判断样本是否适用于后续空间分析至关重要。

样本鉴定DV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200：总RNA片段百分比 > 200个核苷酸
2该样本采用包含强酸的标准临床方案进行脱钙处理。

表2：研究样本的RNA质量。 DV200是指长度超过200个核苷酸的RNA片段所占的百分比；至少30%的样本被认为适用于后续的空间转录组学分析。缩写：hHBM = 健康人骨髓；hMM = 人多发性骨髓瘤；mMM = 小鼠多发性骨髓瘤。

还可进行其他质量评估。为进一步验证组织完整性，并确认EDTA脱钙后特定细胞区室的保存情况，对小鼠和人源组织的相邻FFPE切片进行了可选的免疫荧光（IF）染色。在骨髓瘤（MM）小鼠样本中，使用内黏蛋白（Endomucin, Emcn）和Cd271抗体分别标记内皮细胞（EC）和间充质细胞（MSC）（图4A）。染色结果显示，经EDTA处理的组织呈现出结构清晰的血管系统，Emcn染色连续，基质网络得以保留，表明所检测的标志物在处理后仍可被有效识别。此外，利用自动化多光谱成像系统进行高分辨率成像，进一步证实所检测的抗原仍可被识别，可用于细胞类型鉴定，从而在空间转录组分析前提供额外一层质量控制。这些结果在健康老年个体的人体样本中也得到了验证，其中使用CD31抗体检测到内皮细胞（EC）的表达，使用PRRX1 （Paired Related Homeobox 1）抗体检测到间充质细胞（MSC）的表达，表明在EDTA脱钙后，所检测的微环境标志物仍可被识别（图4B）。 相比之下，在接受多种酸法脱钙方案处理的人源MM活检样本中，无法重复上述结果。如前所述，这些样本中的RNA完整性较低，限制了后续转录组分析。由于这些人源样本存在明显降解，其后续应用仅限于基础转录组谱型分析8以及对恶性浆细胞（PC）进行免疫组织化学（IHC）评估（图4C）。

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图4：用于细胞类型验证的可选免疫荧光与免疫组织化学染色。 （A）小鼠多发性骨髓瘤（MM）组织，显示DAPI标记的细胞核（蓝色）、CD271阳性间充质基质细胞（MSC，绿色）以及EMCN阳性内皮细胞（EC，红色）。（B）健康人骨组织，显示DAPI标记的细胞核（蓝色）、PRRX1阳性间充质基质细胞（MSC，绿色）以及CD31阳性内皮细胞（EC，红色）10。（C）人多发性骨髓瘤活检组织，显示CD138阳性恶性浆细胞（PC）8。比例尺：（A）250 µm（概览图）、20 µm（合并放大图）和50 µm（单通道图像）；（B）500 µm（概览图）和20 µm（合并及单通道放大图）；（C）500 µm。缩写：DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；EC = 内皮细胞；MM = 多发性骨髓瘤；MSC = 间充质基质细胞；PC = 浆细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织形态学和DV200结果共同表明，经EDTA处理的样本适用于后续的空间转录组学分析。此前已有研究报道过该制备流程在空间转录组学中的应用8,10。

讨论

通过整合基于EDTA的可控脱钙、标准化的FFPE处理流程以及严格的质控检查点，本方案克服了传统骨组织样本在空间转录组学制备过程中存在的诸多局限性，尤其是由强酸法脱钙所导致的RNA降解和形态学损伤8,10,20,33,36。在矿化样本的空间转录组学处理流程中，最关键的步骤是脱钙。脱钙不充分会导致骨组织仍过于坚硬而无法切片，从而在物理上无法获得适用于空间转录组学的高质量切片8,20,23,37,50。当骨组织硬度仍然过高时，会在切片过程中与切片刀发生碎裂或震动，导致切片撕裂或出现孔洞，无法真实反映骨髓（BM）的天然结构。值得注意的是，脱钙是否成功直至切片阶段才能完全确认：即使表面看似已软化的样本，仍可能含有残留矿物质，只有在尝试切割薄层FFPE切片时才会显现。因此，必须仔细监测脱钙进程，以确保结果的可重复性。

该实验流程使用 pH 6.95 的 0.25 M EDTA 处理 10 天，并在第 5 天更换溶液，期间持续振荡8,10。在方案开发过程中，评估了单独使用 EDTA、添加聚乙烯吡咯烷酮的 EDTA 以及 10% 甲酸溶液，并比较了不同的脱钙时间和溶液更换方案；相关对比数据未在此展示。脱钙时间短于 10 天时，小鼠样本在切片过程中常出现组织断裂，而人源样本则表现出个体差异性。因此，小鼠股骨采用 10 天脱钙时间，而人源样本则需根据其密度和骨小梁含量决定是否延长脱钙时间。在石蜡包埋前应进行物理质量控制检查。若在切片过程中发现脱钙不充分，仅可将再处理步骤作为最后的补救措施，因为额外的加热、溶剂暴露和再水化可能影响 RNA 质量。

该方法的主要局限性在于处理时间较长，这与临床病理学中常用的快速酸基方案形成鲜明对比20,36。尽管在研究环境中较长的处理时间通常可以接受，但近期研究（如Miao等人描述的方案）表明，人们日益关注加快骨组织的空间检测制备流程，该方案使用Morse溶液（22.5%甲酸和10%柠檬酸钠）在24小时内完成脱钙20。然而，酸基方法历来存在更高的RNA降解风险，会降低DV200值，最终限制其与空间转录组学技术的兼容性1,8,35,36。这种基于EDTA的方法优先考虑RNA的保存而非速度，确保与Visium等基于测序的空间分析平台兼容。

骨髓空间转录组学的一个潜在局限性是浆细胞（PC）来源的免疫球蛋白转录本丰度较高，这可能会降低低丰度基因的检出率。与该研究团队先前研究所采用的质量控制和过滤策略类似，包括去除低质量的点（<200个UMI和<150个检测到的基因）、在去卷积分析过程中过滤贡献度较低的细胞类型（每点<20%），以及筛选空间转录组数据集中检测到的标志基因，免疫球蛋白转录本也可在下游分析中通过计算方法进行过滤，以在适当时最大限度地减少其影响8。靶向空间转录组学方法可能进一步提高特定应用中低丰度转录本的检测能力。

该方法的潜在应用范围十分广泛。近期对空间数据与单细胞数据的整合揭示了人类成骨微环境的特化区域以及从骨小梁发出的复杂信号梯度3,26。此外，空间转录组学研究表明，衰老通过改变内皮细胞（EC）的空间组织结构和细胞间通讯，重塑了骨髓（BM）微环境，导致成骨支持功能受损，并在衰老的微环境中形成炎症信号网络10。多组学分析还鉴定出不同的微环境区域，例如支持早期髓系造血的动脉-骨内膜区域，以及富含造血干细胞和祖细胞的脂肪细胞周围区域3。在多发性骨髓瘤（MM）的研究背景下，本方案可实现空间转录组与单细胞转录组框架的整合，用于表征患病小鼠骨髓的细胞组成及细胞间相互作用。先前的研究揭示了恶性浆细胞（PC）在空间上的特异性分布，并鉴定出与肿瘤富集区域呈负相关的免疫和炎症程序，如中性粒细胞胞外诱捕网（NETosis）和IL-17信号通路。此外，恶性浆细胞密度的增加与T细胞从效应状态向耗竭状态的转变相关。这些发现也在人类福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）骨髓样本中得到验证，表明其在不同疾病负荷下均具有转化医学价值8。最终，该样本制备流程为研究骨髓矿化结构内复杂的细胞相互作用提供了必要的技术基础。

高分辨率空间基因表达平台可在接近单细胞分辨率下实现全转录组分析38,51,52。这些方法可能将该制备流程的应用扩展至对空间有序的骨髓及血液系统恶性肿瘤的更高分辨率分析。因此，该流程为未来研究生理性及恶性造血提供了技术基础。

披露

作者声明无竞争利益。关于MM的MIcγ1小鼠模型的技术知识及实验用途的专利已授权给MIMO Biosciences（申请号：PCT/EP2023/071025）。

致谢

本研究得到了卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）的支持，并由欧洲区域发展基金（ERDF）“欧洲之路”项目共同资助（PI22/00983）；CIBERONC（CB16/12/00489）、RICORS TERAV（RD21/0017/0009）和 RICORS TERAV Plus（RD24/0014/0010）；AGATA 0011-1411-2020-000010/0011-1411-2020-000011；纳瓦拉政府卫生部（Departamento de Salud Gobierno de Navarra，GN2024/04）；英国癌症研究基金会（Cancer Research UK）[C355/A26819]；西班牙抗癌协会（FC AECC）与意大利癌症研究协会（AIRC）联合设立的加速器奖计划（Accelerator Award Program）；国际骨髓瘤基金会（The International Myeloma Foundation，Brian van Novis）以及 Paula 和 Rodger Riney 基金会对 FP 的资助。IAC 获得了欧洲委员会玛丽·居里基金（H2020-MSCA-IF-837491）、西班牙抗癌协会人才基金（AECC Talent grant，INVES258003CALV）以及纳瓦拉政府卫生部（GN2023/03）的支持。MC 获得了科学、创新与大学部（Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades）FPU 博士奖学金（FPU22/03283）的支持。我们衷心感谢纳瓦拉大学CIMA高级基因组学实验室和动物实验中心工作人员提供的宝贵技术和智力支持。同时感谢纳瓦拉大学临床医院（Clínica Universidad de Navarra, CUN）和纳瓦拉大学医院病理科提供骨髓样本并给予卓越的合作。特别感谢 José Ángel Martínez-Climent 和 Marta Larrayoz 提供多发性骨髓瘤小鼠模型。感谢 Patxi San Martín-Uriz、Tania López 和 Eduardo Larequi 在技术优化、实验方案开发以及小鼠和人骨髓样本的空间转录组学处理过程中提供的出色支持。我们还感谢 Beñat Ariceta 和 Asier Ullate 在空间转录组学计算分析方面所做的全部工作。最后，我们向慷慨参与本研究的患者和健康供体表示深深的感激之情。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管Eppendorf15625367
100 mL 无菌容器 deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991A基于毛细管电泳–的RNA完整性评估系统
50 mL 无菌容器 IberoMedREOR001
50 mL 离心管 FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EA疏水屏障笔 
兔抗PRRX1抗体Sigma-AldrichHPA051084
BSA（牛血清白蛋白）Sigma-AldrichA9418-50G
包埋盒 KartellLABWARE2921
CD271（NGF受体）单克隆抗体（ME20.4）Invitrogen14-9400-82
CD31，内皮细胞（浓缩液）克隆 JC70AAligent DakoM0823
盖玻片Fisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI（含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂）Vector LaboratoriesH-1200-10
脱蜡液Qiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals 磷酸盐缓冲液（DPBS，1×），Dulbecco配方，不含钙，不含镁
组织学用DPX封片剂Sigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687乙二胺四乙酸（EDTA），0.5 M 溶液，分子生物学级，超纯
包埋机 Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Emcn 抗体（V.7C7）Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Ensembl参考基因组（GRCh38 / mm10，版本105）EMBL-EBIN/A用于序列比对的参考基因组。
伊红Millipore SigmaHT110116
乙醇Millipore SigmaE7023-500ML手术剪刀
Falc Instruments B-I 组织学水浴锅Falc610.1030.00
4% 甲醛 PanReac AppliChem25243113153.7%–4.0% w/v 甲醛，缓冲至 pH = 7，并以甲醇稳定（CE-IVD），用于临床诊断
玻璃载片染色架 WHEATONZ710970-3EA
玻璃染色缸 BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
甘油Sigma-AldrichC3H803
山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
山羊抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
苏木精 Millipore SigmaMHS16
高灵敏度RNA ScreenTapeAgilent5067-5579RNA完整性评估
高灵敏度RNA ScreenTape 标准品Agilent5067-5581RNA完整性评估
高灵敏度RNA ScreenTape 样品缓冲液Agilent5067-5580RNA完整性评估
高分辨率显微镜 Leica BiosystemsN/AAperio CS2 扫描仪
盐酸（0.1 N HCl）Fisher ChemicalSA54-1
Illumina NextSeq 2000 平台Illumina20038897
Invitrogen 山羊抗大鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
虹膜剪刀 - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009异氟烷
碳酸锂 Merck554-13-2
Loupe 浏览器（v6.0.0） 10x GenomicsN/A用于可视化HE图像和筛选Visium位点的软件；可打开分析流程生成的.cloupe文件。
金属包埋模具Bio-Optica07-BM24256
显微镜载玻片avantor631-0108Superfrost Plus 显微镜载玻片
切片机刀片FEATHERFEAT207500006_U
切片机 HM 340EEprediaN/AHM 340E 型号
针头BD301156BD Microlanc 3 针头 21 G 1 英寸（25 mm）
Nikon Optiphot-2Nikon71052明场光学显微镜
石蜡 PanReac AppliChem256993熔点55–58°C的塑化石蜡 + DMSO颗粒（CE-IVD），用于临床诊断
培养皿 CorningCLS430167-100EA
塑料包埋模具 Bio-Optica07-MP7070
Potts-Smith 镊子F.S.T 11012-18镊子
Qubit 3.0 荧光计Invotrogen Q33216
Qubit 测定管Invotrogen Q32856
Qubit RNA HS 测定试剂盒Invotrogen Q32855
无RNase 1.5 mL 微量离心管Thermo Scientific AM12400
无RNase水 MerkW4502
RNaseZap RNase去除剂Invotrogen AM9780去污溶液
RNeasy FFPE 试剂盒（50）Qiagen73504总RNA提取
SCTransform（v0.3.5）Satija LabN/A在Seurat中实现的方差稳定化归一化方法。
Seurat（v4.3.0.1） Satija LabN/A用于单细胞和空间转录组学分析的R软件包。
Space Ranger（v2.0.1）10x GenomicsN/A用于Visium数据集的解复用、比对和生成特征-条形码矩阵的软件。
Stlime 手术刀 Schreiber GmbH 51-11-030
STutility（v1.1.1）Bergen LabN/A用于空间转录组可视化和整合的R软件包。
手术刀片 No.23Swann-Morton210手术刀片
PCR仪 Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455用于免疫荧光可视化的多光谱成像平台
Visium 附件试剂盒 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium 人转录组探针试剂盒 小包装 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium 小鼠转录组探针试剂盒 小包装 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium 空间基因表达载片试剂盒 4次反应 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
二甲苯Panreac214736二甲苯，异构体混合物，用于分析，ACS，ISO标准

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