本方案展示了在慢性不可预测性轻度应激诱导的抑郁小鼠模型中评估加味逍遥散的效果，包括对神经元坏死性凋亡的行为学、组织学和分子水平评估。
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摘要
摘要
神经元丢失和损伤是抑郁症的重要病理特征，坏死性凋亡（necroptosis）已被提出作为神经元死亡的潜在机制。对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集（GSE54565、GSE54566 和 GSE54568）的分析揭示了抑郁症与坏死性凋亡之间的关联，提示抑制该通路可能是一种潜在的治疗策略。加味逍遥散（Modified Xiaoyao San, MXYS）是在传统中药逍遥散基础上改良而成的复方制剂，通过加入清热、凉血、益智及促苏醒类药材以增强疗效。然而，MXYS 对神经元坏死性凋亡的影响及其进入脑组织的活性成分尚不明确。本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS）初步鉴定了在脑组织中检测到的 MXYS 成分。通过慢性不可预知性轻度应激（chronic unpredictable mild stress, CUMS）小鼠抑郁症模型，结合行为学评估、组织病理学检查、免疫荧光、蛋白质印迹及生物信息学分析，评估了 MXYS 的治疗效果。结果显示，MXYS 给药可改善类抑郁行为，减轻脑组织病理损伤，并降低受体相互作用蛋白激酶 3（receptor-interacting protein kinase 3, RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL）的磷酸化水平。这些结果表明，MXYS 可发挥类抗抑郁作用，其机制与降低神经元坏死性凋亡相关标志物有关，为将 MXYS 进一步开发为抑郁症潜在治疗策略提供了实验依据。
引言
抑郁症是一种属于心境障碍谱系的严重精神疾病，主要特征为持续性情绪低落，受多种因素影响1。临床上，抑郁症患者常表现为情绪低落、认知迟缓、言语交流及躯体活动减少，严重者可出现自伤行为和自杀意念2。由于其高患病率、高复发率、高致残率和高自杀率，抑郁症已成为全球致残的主要原因，给社会和经济带来沉重负担3。根据世界卫生组织预测，到2030年，抑郁症将成为全球疾病负担的首要因素，超过癌症以及心脑血管疾病3。此外，2019冠状病毒病（COVID-19）大流行导致全球重度抑郁症患病率上升了27.6%4。在中国，抑郁症的年患病率为3.6%，终生患病率为6.8%5。由于病因复杂且影响因素众多，抑郁症的发病机制尚未完全阐明。因此，治疗手段仍有限，约30%–40%的患者因对现有抗抑郁药物疗效不佳而发展为难治性抑郁症6。此外，现有抗抑郁药物起效延迟、残留症状、神经毒性及不良反应等问题，仍构成重大的治疗挑战7。
程序性细胞死亡长期以来一直是生物医学研究的主要焦点。越来越多的证据表明，抑郁症与坏死性凋亡相关8,9,10,11。坏死性凋亡与凋亡一样，是一种程序性细胞死亡形式；然而，与凋亡不同的是，它会引发显著的免疫和炎症反应12。在caspase-8活性缺失的情况下，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）结合，导致受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）被激活13。活化的RIPK1与受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）相互作用，形成坏死小体复合物，进而激活混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）14。MLKL在寡聚化后从细胞质转位至质膜，引起细胞器肿胀15,16、细胞膜完整性破坏以及包括损伤相关分子模式（DAMPs）和TNF-α、白细胞介素（IL）-1、IL-6等炎性介质在内的细胞内物质释放，从而加剧炎症反应17。坏死性凋亡已被证实参与多种炎症性和神经退行性疾病，包括多发性硬化、抑郁症、肌萎缩侧索硬化、帕金森病和阿尔茨海默病18,19,20。蛋白质组学分析显示，慢性不可预知性轻度应激（CUMS）诱导的抑郁症与RIPK3和MLKL表达升高以及坏死性凋亡通路的激活相关2。在另一项CUMS小鼠抑郁症模型中，氟西汀发挥出类似抗抑郁的作用，该作用与抑制RIPK1介导的坏死性凋亡相关10。此外，坏死性凋亡抑制剂Nec-1s已被证明可改善脂多糖（LPS）诱导的类抑郁行为21。由于神经元损伤是抑郁症的重要病理特征，靶向坏死性凋亡可能成为治疗抑郁症的一种有前景的治疗策略。
中医治疗抑郁症具有悠久的历史。根据中医理论，肝主疏泄气机，因此抑郁症主要归因于情志不畅导致的肝气郁结。相应地，主要的治疗策略是疏肝解郁。逍遥散（XYS）是一种经典的中药方剂，广泛用于此目的，大量证据支持其在抑郁症治疗中的应用22。此外，已有报道表明XYS具有抗坏死性凋亡的特性23,24。基于中医“肝郁化火”和“清阳上升于脑”的理论，通过在XYS中加入牡丹皮（Moutan Cortex，Mudan Pi）和栀子（Gardeniae Fructus，Zhizi）以清热凉血，同时加入石菖蒲（Acori Tatarinowii Rhizoma，Shi Changpu）和远志（Polygalae Radix，Yuan Zhi）以促进认知功能和醒神开窍，从而对原方进行了加减化裁。所得新方命名为加味逍遥散（Modified Xiaoyao San，MXYS），旨在依据中医理论增强治疗效果。然而，本研究未对MXYS与原始XYS方剂进行直接比较25。临床研究已证实MXYS具有抗抑郁疗效26,27,28，其治疗作用可能与调节下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴及抑制神经炎症有关29,30,31。然而，MXYS是否与减轻神经元坏死性凋亡相关，目前尚不明确。
在本研究中，采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS）对在脑组织中检测到的MXYS来源化合物进行初步鉴定。通过公开可用的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集及生物信息学分析，包括加权基因共表达网络分析（WGCNA）、差异表达分析和富集分析，探讨MXYS、抑郁症与坏死性凋亡之间的关联。基于上述发现，我们提出假设：MXYS可能通过降低神经元坏死性凋亡标志物水平发挥类抗抑郁作用，其中激活转录因子4（ATF4）/cAMP反应元件结合蛋白（CREB）/脑源性神经营养因子（BDNF）通路可能是潜在的相关机制。为验证该假设，采用UHPLC-HRMS对脑组织中检测到的化合物进行初步鉴定，进行生物信息学分析以识别潜在治疗靶点，并开展体内实验以检测MXYS干预是否与坏死性凋亡标志物及ATF4/CREB/BDNF通路相关分子的变化有关。这些结果为MXYS在抑郁症治疗中的潜在应用提供了初步证据，同时指出仍需开展与原始XYS配方的比较研究以及剂量-效应关系的验证工作。
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方案
动物实验经河南中医药大学动物伦理委员会批准（批准编号：DWLLGZR202200023）。所有操作均按照机构和国家关于动物福利的指南进行，并符合ARRIVE指南要求。雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠来自有资质的实验动物供应商。动物饲养环境温度和湿度受控，光照/黑暗周期为12小时，自由摄取标准饲料和水。
脑组织中MXYS成分的鉴定
冻干MXYS粉末的制备：
将MXYS的11味药材用10倍体积的蒸馏水浸泡2小时，然后煮沸40分钟。薄荷在煎煮最后5分钟时加入。用8倍体积的蒸馏水以相同方法进行第二次煎煮。合并两次煎液，经纱布过滤，减压浓缩至1 g/mL（相当于生药浓度），再于真空条件下冻干48小时，得到冻干MXYS粉末。提取率为21.7%（w/w）25,29,31。
动物与 MXYS 给药：
将十二只雄性 SD 大鼠随机分为两组，分别通过口服灌胃每天给药两次 MXYS 或纯化水。每日两次给药时间分别为上午 8:00 和晚上 8:00（间隔 12 小时）。MXYS 粉末溶于纯化水中，给药剂量为 24.4 g/kg（约为大鼠临床剂量的两倍）25。对照组给予等体积的纯化水（10 mL/kg）。
含MXYS的脑组织制备：
末次给予MXYS后2小时，所有大鼠均以戊巴比妥钠（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉。经心脏灌注生理盐水后采集脑组织。立即取出全脑并置于冰上，以获取空白脑组织及MXYS处理的脑组织样本。
色谱/质谱条件与数据库：
采用配备HSS-T3柱（100 × 2.1 mm，1.8 μm）的超高效液相色谱系统，对冻干的MXYS粉末、添加MXYS粉末的空白脑组织、空白脑组织以及含MXYS的脑组织提取物进行分析，色谱柱温度维持在35°C。流动相由含0.1%甲酸的水（流动相A）和含0.1%甲酸的乙腈（流动相B）组成。样品在0.3 mL/min流速下进行梯度洗脱：0–1 min保持5% B，1–17 min线性升至98% B，17–17.5 min返回5% B，17.5–20 min保持5% B。
质谱数据采用正负电喷雾离子化模式，通过依赖数据的采集方式在全扫描范围内获取 m/z 90–1,300 范围内。采用20、40和60 eV的梯度高能量碰撞解离碰撞能量，对强度最高的10个前体离子生成MS/MS谱图。毛细管温度保持在 320°C，探针加热器温度设定为 350°C.
通过将精确质量、同位素分布和二级质谱（MS/MS）谱图与内部自建的中药数据库以及公共数据库GNPS32、ReSpect33和MassBank34进行比对，完成化合物注释。保留具有可靠MS/MS匹配结果且色谱峰形一致的化合物。初步鉴定出的化合物完整列表见补充表1。
生物信息学
从 GEO 数据库中选择和预处理数据集：
通过在 GEO 数据库中以“depression”为关键词进行检索，探讨坏死性凋亡（necroptosis）在抑郁症病理过程中的潜在作用。根据筛选标准，共确定三个数据集（GSE54566、GSE54565 和 GSE54568）用于进一步分析。这些数据集来源于不同的脑区：GSE54565（前扣带皮层）、GSE54566（杏仁核）和 GSE54568（背外侧前额叶皮层，BA9）。所有数据集均采用 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 平台（GPL570）生成，包含重度抑郁症（MDD）患者与非精神病对照个体的死后脑组织样本。各数据集的样本详细特征汇总于补充表 2中。这些数据集涵盖了抑郁症相关三个脑区的转录组数据。对每个数据集分别进行 MDD 组与对照组之间的差异基因表达分析，并使用 R 语言的 Robust Rank Aggregation（RRA）软件包整合一致上调和下调的基因。
所有数据集均使用稳健多阵列平均（RMA）算法进行背景校正和归一化预处理。在RMA归一化之后，应用sva R软件包中实现的ComBat算法，以校正不同数据集间的批次效应，其中将数据集来源作为批次协变量。该步骤减少了数据集间的技术变异，提高了后续分析的可比性。
使用 R 软件（版本 4.2.1）进行生物信息学分析。主要使用的 R 软件包包括：ClusterProfiler（版本 4.8.2），用于基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；WGCNA（版本 1.72），用于加权基因共表达网络分析；RRA，用于差异基因整合；以及 sva（版本 3.48.0），用于 ComBat 批次校正。分析流程包括数据获取、RMA 标准化、ComBat 批次校正、结合 RRA 整合的差异表达分析、WGCNA 模块构建、以错误发现率（FDR）< 0.05 为阈值的 GO 和 KEGG 富集分析，以及通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析进行靶标预测。
运用 WGCNA 构建共表达基因网络并鉴定与抑郁症和坏死性凋亡显著相关的模块：
WGCNA 通过应用软阈值幂（β 值）以逼近无标度拓扑结构，从而构建加权基因共表达网络。当 log(k) 与 log(p(k)) 之间的相关系数至少达到 0.9 时，选定相应的 β 值。在确定 β 值后，采用动态树剪切法（dynamic tree cut method）识别基因模块。其他参数设置如下：minModuleSize = 30，cutHeight = 0.25，deepSplit = 2。用于网络构建的软阈值幂为 β = 7。为每个模块计算模块特征基因（Module Eigengene, ME），以概括基因表达模式并评估其与生物学性状的关联性。随后计算基因显著性（Gene Significance, GS）和模块成员度（Module Membership, MM），并通过相关系数（cor）及相应的 p-值评估模块与性状之间的关系。较高的相关系数和较低的 p-值表明基因模块与生物学性状之间存在更强的关联。
功能富集分析及 PPI 网络构建：
使用 ClusterProfiler 进行 KEGG 通路富集分析。采用 Benjamini–Hochberg FDR 方法对多重检验进行校正，以校正后的 p 值（FDR）< 0.05 为具有统计学显著性。在确定目标模块后，将该模块内的关键基因与 MXYS 及坏死性凋亡（necroptosis）相关基因取交集。随后利用 STRING 数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
脑组织中检测到的化合物靶点预测：
在给予MXYS后，从大鼠脑组织中初步鉴定出143种化合物，并用于靶点预测。针对每种化合物，通过GeneCards数据库的“相关靶点”（Related Targets）功能，检索其潜在靶点，并设定相关性评分 > 5. 合并重复靶点，仅保留具有正式基因符号的人类基因，最终获得 3,164 个非重复靶点。使用 ClusterProfiler R 软件包对这些靶点进行 GO 和 KEGG 富集分析，设定 FDR < 0.05 被认为具有统计学显著性。背景基因集包含 KEGG 数据库中注释的所有人类蛋白编码基因。
实验验证
细胞培养：
HT-22 细胞购自普诺赛生命科技有限公司（CL-0697，RRID: CVCL_0321），使用添加 10% 胎牛血清（FBS）和 100 U/mL 青霉素/链霉素的完全培养基进行培养。细胞置于含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中，于 37°C 恒温培养。
MXYS 的抗坏死性凋亡活性：
将冻干的 MXYS 粉末用细胞培养基重悬至浓度为 1.0 g/mL，经 0.22 μm 微孔滤膜除菌，−20°C 保存备用。HT-22 细胞以每孔 8,000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，每组设 3 个复孔。将 MXYS 用培养基稀释至终浓度分别为 2、4 和 6 mg/mL。细胞孵育 12 小时后，先加入 SM-164 盐酸盐（10 nM）和半胱天冬酶抑制剂 z-VAD-fmk（20 μM）处理 30 分钟，随后加入人肿瘤坏死因子-α（h-TNF-α；20 ng/mL）刺激 12 小时。根据试剂盒说明书，采用化学发光法检测细胞活力，使用酶标仪测定发光值。在倒置显微镜下观察细胞形态，并采集代表性图像用于分析。
动物：
动物实验经河南中医药大学动物伦理委员会批准（批准号：DWLLGZR202200023）。所有操作均按照机构和国家关于动物福利的指南进行，并符合ARRIVE指南要求。仅使用6–8周龄的雄性BALB/c小鼠建立CUMS模型。动物饲养环境保持恒定的温度与湿度，光照周期为12小时明/12小时暗，自由摄取标准饲料和饮水。
慢性不可预知性温和应激（CUMS）诱导的抑郁模型：
将小鼠随机分为对照组和CUMS组。经过一周的适应期后，CUMS组小鼠接受间断且不可预知的温和应激刺激，而对照组小鼠则不进行任何干预。应激方案包括13种不同的温和应激方式，分别为笼子倾斜、笼子摇晃、更换笼子、潮湿垫料、饮水剥夺、频闪光照、噪音暴露、持续光照、持续黑暗、间断照明、冷水游泳（4°C）、温水游泳（40°C）、束缚应激以及其他温和应激刺激。每种应激刺激每次持续2–6小时，按随机顺序实施，以确保不可预测性。每天根据随机安排对小鼠施加一种或两种不同的应激刺激。
分组与药物处理：
经过六周的CUMS暴露后，小鼠被随机分配至CUMS模型组、MXYS组、帕罗西汀组或Nec-1组。MXYS组通过口服灌胃给予冻干MXYS粉末，剂量为35.2 g/kg/天；帕罗西汀组通过口服灌胃给予帕罗西汀（20 mg/kg）；Nec-1组则通过腹腔注射给予Nec-1（10 mg/kg），连续给药四周。在同一时期，对照组和CUMS模型组小鼠通过口服灌胃给予等体积的生理盐水。
行为学实验：
在开始给药前，使用计算机生成的随机数字序列将小鼠随机分配至各实验组。随机化序列由一名独立的研究人员生成，该人员未参与后续实验或数据分析。
行为学实验由一名对处理分组不知情的研究人员进行。同一名研究人员使用自动化追踪软件对基于视频的行为学指标（不动时间、移动距离以及在中心区域停留的时间）进行评分，以尽量减少主观偏差。在所有行为学数据收集和记录完成之前，该盲法研究人员无法获取分组分配代码。
免疫荧光分析由另一位独立的研究人员完成，该研究人员同样对实验分组情况设盲。样本采用编码标识进行标记，分组信息仅在完成密度测定或荧光强度测量后才予以揭示。统计学分析由第三位研究人员执行，该研究人员在所有定量数据汇总完成前，对分组情况及相应的实验结果均保持盲态。
蔗糖偏好试验（SPT）： 在最后一次给药后进行行为学测试。测试前，先让小鼠适应1%蔗糖溶液：提供两个均含1%蔗糖溶液的瓶子，持续12小时；随后提供一个含1%蔗糖溶液的瓶子和一个含饮用水的瓶子，再持续12小时。正式测试前，小鼠禁食禁水12小时。测试期间，每只小鼠提供一个含1%蔗糖溶液的瓶子和一个含饮用水的瓶子。12小时后，测量每只小鼠从两个瓶子中各自消耗的液体体积。蔗糖偏好率按以下公式计算：
悬尾实验（TST）： 使用胶带将每只小鼠的尾巴固定在测试装置的顶部。利用行为视频记录与分析软件记录小鼠6分钟内的行为。量化测试最后4分钟内的静止持续时间。
旷场实验（OFT）：将每只小鼠单独置于旷场实验装置的中央，使用行为追踪软件记录并分析其5分钟内的行为活动，包括运动距离和活动水平。每次实验结束后，用75%乙醇清洁装置。
样本采集：
在CUMS操作过程中死亡或出现严重疾病症状（例如， >体重减轻20%、出现明显感染症状或无法移动的动物被排除在研究之外。安乐死由经认证的人员通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（150 mg/kg）实施。在动物失去意识后，采用颈椎脱位法作为辅助手段以确保死亡。用于尼氏染色和免疫荧光分析的样本，每组随机选取3只小鼠。用于Western blot分析的海马组织在冰上迅速解剖后，立即用液氮速冻。
尼氏染色：
进行尼氏染色和免疫荧光分析时，小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）深度麻醉后，不进行心脏灌流即断头处死。迅速取出脑组织，并在4%多聚甲醛中固定24–48小时，随后进行石蜡包埋。将石蜡切片切成3 μm厚度。石蜡切片依次在脱蜡液、无水乙醇和75%乙醇中孵育以完成脱蜡，然后用流水冲洗。如使用冷冻切片，则将其恢复至室温，用组织固定剂固定15分钟，再用流水冲洗。组织切片用尼氏染色液染色2–5分钟，水洗后用0.1%冰醋酸分化，再用水洗涤以终止反应，在显微镜下监控分化程度，随后干燥，用二甲苯透明10分钟，最后用中性封片剂封片。
免疫荧光：
免疫荧光实验采用标准方法进行。脑组织经4%多聚甲醛固定后，包埋于石蜡中用于免疫荧光染色。组织切片与以下一抗在4°C下孵育过夜：NeuN（1:200）、MLKL（1:300）、ATF4（1:5000）和CREB（1:1000）。一抗孵育结束后，切片用PBS洗涤4次，随后在避光条件下与相应的荧光二抗室温孵育1小时：针对小鼠抗ATF4使用CY3标记的山羊抗小鼠IgG（1:300，Servicebio，GB21301）；针对小鼠抗MLKL使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（1:400，Servicebio，GB25301）；针对兔抗NeuN使用CY3标记的山羊抗兔IgG（1:300，Servicebio，GB21303）；针对兔抗CREB使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（1:400，Servicebio，GB25303）。随后，切片在室温下用DAPI染色10分钟，经PBS洗涤后，使用抗荧光淬灭封片剂封片，并通过共聚焦显微镜采集荧光图像。
蛋白质印迹（Western Blot）：
脑组织在放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液中进行匀浆。测定蛋白浓度后，每泳道上样20 μg总蛋白，通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，随后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。封闭后，膜在4°C下与一抗（1:1000稀释）孵育过夜，随后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温孵育1小时。使用化学发光成像系统显影蛋白条带，并用ImageJ软件对条带强度进行定量分析。对于海马组织的蛋白质印迹分析，每组分析了两只小鼠，图中显示为代表性免疫印迹结果。HT-22细胞实验的蛋白质印迹分析作为代表性实验仅进行一次。这些数据以定性趋势观察形式呈现，而非统计学定量结果。
统计学分析：
采用单因素方差分析（ANOVA）对各组间差异进行分析，随后进行Tukey多重比较检验。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。p 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。
数据可用性：
本研究生成和分析的数据集已包含在本发表文章及其补充材料中。UHPLC-HRMS化合物鉴定结果见补充表1，用于生物信息学分析的GEO数据集特征总结于补充表2。其他支持性数据，包括GFAP免疫荧光图像（补充图1）、p-RIPK3和p-MLKL的免疫荧光染色结果（补充图2）、实验设计与动物分组时间线（补充图3）以及原始未裁剪的Western blot图像（补充图4），均可在补充材料中获取。
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结果
WGCNA 鉴定出一个在坏死性凋亡通路中富集的抑郁症相关基因模块
采用 RRA 软件包整合 GSE54566、GSE54565 和 GSE54568 数据集中一致上调和下调的差异表达基因，共鉴定出 2,513 个基因。这些基因的热图如图 1A所示。这三个数据集来源于不同的脑区——前扣带皮层、杏仁核和背外侧前额叶皮层——并包含重度抑郁症（MDD）患者与非精神疾病对照者的样本。RRA 方法识别出在多个独立数据集中始终排名靠前的差异表达基因，从而减少了数据集特异性的变异。随后，利用 WGCNA 对整合后的基因表达谱进行分析。
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讨论
异常神经元死亡在抑郁症的发病机制中起着关键作用8。坏死性凋亡（necroptosis）是一种程序性细胞死亡形式，近年来已被广泛研究，推动了靶向该通路抑制剂的显著进展39。自2005年发现坏死性凋亡抑制剂Nec-1以来40，针对坏死性凋亡信号通路关键组分的化合物研发已取得显著进展。Nec-1在神经系统疾病、心血管疾病和肾脏疾病的模型中均表现出对坏死性凋亡的保护作用41。此外，靶向中枢神经系统的坏死性凋亡抑制剂SAR443060已进入临床试验阶段42，但因在临床前开发过程中观察到毒性而被中止42。尽管坏死性凋亡抑制剂在神经系统疾病中的研究已较为深入，其在抑郁症中的潜在应用仍基本未被探索。与传统化学药物相比，中药具有多项潜在优势，包括适合长期给药、毒性和不良反应相对较低，以及药物研发成本较低。因此，开发调控坏死性凋亡的中药制剂可能为抗抑郁药物的研发提供一条有前...
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披露
利益冲突：
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究受到中国河南省高等学校重点科研项目（编号：26A360008）、河南省中医药科研项目（编号：2025ZY3152）、国家自然科学基金（编号：82274496）、河南省科技攻关项目（编号：232301420018）以及国家中医药管理局科技司张仲景传承与创新项目（编号：GZY-KJS-2022-044-1）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott；Shi Changpu） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 231001 | 中药成分（12 g） |
| 胶带 | 不适用 | 不适用 | 尾悬吊实验 |
| 当归（Angelica sinensis (Oliv.) Diels；Dang Gui） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | G01230507-16 | 中药成分（10 g） |
| 抗ATF4抗体（免疫荧光） | Servicebio | GB111137 | 一抗 |
| 抗ATF4抗体（Western blot） | MedChemExpress | HY-P80486 | 一抗 |
| 抗BDNF抗体 | MedChemExpress | HY-P80567 | Western blot用一抗 |
| 抗CREB抗体 | Beyotime | AF1018 | Western blot和免疫荧光用一抗 |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | 上样对照 |
| 抗MLKL抗体 | Proteintech | 66675-1-Ig | Western blot和免疫荧光用一抗 |
| 抗NeuN抗体 | Servicebio | GB11138 | 免疫荧光用一抗 |
| 抗磷酸化CREB抗体 | Beyotime | AF5785 | 一抗 |
| 抗磷酸化MLKL抗体 | Bioss | bsm-54104R | 一抗 |
| 抗磷酸化RIPK1抗体 | Biolynx | BX60008 | 一抗 |
| 抗磷酸化RIPK3抗体 | Abcam | ab195117 | 一抗 |
| 抗RIPK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3493S | 一抗 |
| 抗RIPK3抗体 | Proteintech | 17563-1-AP | 一抗 |
| 白术（Atractylodes macrocephala Koidz.；Bai Zhu） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 230801 | 中药成分（10 g） |
| 自动行为追踪软件 | Panlab (Harvard Apparatus) | N/A | 用于旷场实验和尾悬吊实验的SMART 3.0视频追踪软件 |
| BCA蛋白定量检测试剂盒 | CWBIO | CW0014S | 蛋白定量 |
| 行为记录系统 | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | 旷场实验和尾悬吊实验 |
| Bio-Rad化学发光成像系统 | Bio-Rad | 12003154 | ChemiDoc MP成像系统，用于化学发光Western blot检测 |
| CellTiter-Lumi II发光细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | C0056XL | 细胞活力检测 |
| 共聚焦显微镜 | Nikon Eclipse C1 | N/A | 免疫荧光成像 |
| DAPI | Servicebio | G1012 | 细胞核染色 |
| 环保型脱蜡液 | Servicebio | G1128 | 石蜡脱蜡 |
| 胎牛血清（FBS） | BI | C04001-500 | 细胞培养添加剂 |
| 栀子（Gardenia jasminoides J. Ellis；Zhi Zi） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 22102109 | 中药成分（12 g） |
| 甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.；Gan Cao） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 230301 | 中药成分（3 g） |
| CY3标记的山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB21301 | 用于小鼠抗ATF4的荧光二抗（IF，CY3，1:300） |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB25301 | 用于小鼠抗MLKL的荧光二抗（IF，Alexa Fluor 488，1:400） |
| CY3标记的山羊抗兔IgG | Servicebio | GB21303 | 用于兔抗NeuN的荧光二抗（IF，CY3，1:300） |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG | Servicebio | GB25303 | 用于兔抗CREB的荧光二抗（IF，Alexa Fluor 488，1:400） |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Absin | abs20040 | Western blot用二抗 |
| HRP标记的小鼠抗兔IgG轻链二抗 | ABclonal | AS061 | Western blot用二抗 |
| 人TNF-α | Novoprotein | C008 | 坏死性凋亡诱导剂 |
| HT-22细胞 | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| HyClone培养基 | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | 细胞培养基 |
| ImageJ | NIH | 免费软件 | 条带定量分析 |
| 倒置显微镜 | Nikon | Eclipse Ti-SR | 细胞形态观察 |
| 液氮 | 河南吉来新能源科技有限公司 | N/A | 组织保存 |
| Molecular Devices酶标仪 | Molecular Devices | SpectraMax M5 | 发光检测 |
| 牡丹皮（Paeonia suffruticosa Andr.；Mu Danpi） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 22121714 | 中药成分（12 g） |
| Necrostatin-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | RIPK1抑制剂 |
| 多聚甲醛 | Servicebio | G1101-500ML | 组织固定 |
| 盐酸帕罗西汀半水合物 | Aladdin | P129711 | 阳性对照 |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | 洗涤缓冲液 |
| 薄荷（Mentha haplocalyx Briq.；Bo He） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 230101 | 中药成分（6 g） |
| 青霉素–链霉素 | Gibco | 15140-122 | 细胞培养抗生素 |
| 远志（Polygala tenuifolia Willd.；Yuan Zhi） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 20221101 | 中药成分（12 g） |
| 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 | Merck Millipore | ISEQ00010 | Western blot |
| 茯苓（Wolfiporia cocos；Fu Ling） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | D23070601 | 中药成分（15 g） |
| 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液 | CWBIO（江苏科威生物科技有限公司） | CW2333S | 蛋白提取 |
| 柴胡（Bupleurum chinense DC.；Chai Hu） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 230801 | 中药成分（12 g） |
| SDS-PAGE试剂 | Solarbio；Servicebio；上海源叶生物科技有限公司 | 不适用 | 丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tris、SDS、APS和TEMED均为实验室自配 |
| 戊巴比妥钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 69020181 | 麻醉剂 |
| 超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLC系统 | LC-MS分析 |
| UHPLC HSS-T3色谱柱（100 × 2.1 mm，1.8 μm） | Waters | 186003539 | 色谱分离 |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | 广谱caspase抑制剂 |
参考文献
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