本方案展示了在慢性不可预测性轻度应激诱导的抑郁小鼠模型中评估加味逍遥散的效果，包括对神经元坏死性凋亡的行为学、组织学和分子水平评估。
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本方案展示了在慢性不可预测性轻度应激诱导的抑郁小鼠模型中评估加味逍遥散的效果，包括对神经元坏死性凋亡的行为学、组织学和分子水平评估。
神经元丢失和损伤是抑郁症的重要病理特征，坏死性凋亡（necroptosis）已被提出作为神经元死亡的潜在机制。对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集（GSE54565、GSE54566 和 GSE54568）的分析揭示了抑郁症与坏死性凋亡之间的关联，提示抑制该通路可能是一种潜在的治疗策略。加味逍遥散（Modified Xiaoyao San, MXYS）是在传统中药逍遥散基础上改良而成的复方制剂，通过加入清热、凉血、益智及促苏醒类药材以增强疗效。然而，MXYS 对神经元坏死性凋亡的影响及其进入脑组织的活性成分尚不明确。本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS）初步鉴定了在脑组织中检测到的 MXYS 成分。通过慢性不可预知性轻度应激（chronic unpredictable mild stress, CUMS）小鼠抑郁症模型，结合行为学评估、组织病理学检查、免疫荧光、蛋白质印迹及生物信息学分析，评估了 MXYS 的治疗效果。结果显示，MXYS 给药可改善类抑郁行为，减轻脑组织病理损伤，并降低受体相互作用蛋白激酶 3（receptor-interacting protein kinase 3, RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL）的磷酸化水平。这些结果表明，MXYS 可发挥类抗抑郁作用，其机制与降低神经元坏死性凋亡相关标志物有关，为将 MXYS 进一步开发为抑郁症潜在治疗策略提供了实验依据。
抑郁症是一种属于心境障碍谱系的严重精神疾病，主要特征为持续性情绪低落，受多种因素影响1。临床上，抑郁症患者常表现为情绪低落、认知迟缓、言语交流及躯体活动减少，严重者可出现自伤行为和自杀意念2。由于其高患病率、高复发率、高致残率和高自杀率，抑郁症已成为全球致残的主要原因，给社会和经济带来沉重负担3。根据世界卫生组织预测，到2030年，抑郁症将成为全球疾病负担的首要因素，超过癌症以及心脑血管疾病3。此外，2019冠状病毒病（COVID-19）大流行导致全球重度抑郁症患病率上升了27.6%4。在中国，抑郁症的年患病率为3.6%，终生患病率为6.8%5。由于病因复杂且影响因素众多，抑郁症的发病机制尚未完全阐明。因此，治疗手段仍有限，约30%–40%的患者因对现有抗抑郁药物疗效不佳而发展为难治性抑郁症6。此外，现有抗抑郁药物起效延迟、残留症状、神经毒性及不良反应等问题，仍构成重大的治疗挑战7。
程序性细胞死亡长期以来一直是生物医学研究的主要焦点。越来越多的证据表明，抑郁症与坏死性凋亡相关
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动物实验经河南中医药大学动物伦理委员会批准（批准编号：DWLLGZR202200023）。所有操作均按照机构和国家关于动物福利的指南进行，并符合ARRIVE指南要求。雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠来自有资质的实验动物供应商。动物饲养环境温度和湿度受控，光照/黑暗周期为12小时，自由摄取标准饲料和水。
脑组织中MXYS成分的鉴定
冻干MXYS粉末的制备：
将MXYS的11味药材用10倍体积的蒸馏水浸泡2小时，然后煮沸40分钟。薄荷在煎煮最后5分钟时加入。用8倍体积的蒸馏水以相同方法进行第二次煎煮。合并两次煎液，经纱布过滤，减压浓缩至1 g/mL（相当于生药浓度），再于真空条件下冻干48小时，得到冻干MXYS粉末。提取率为21.7%（w/w）25,29,31。
动物与 MXYS 给药：
将十二只雄性 SD 大鼠随机分为两组，分别通过口服灌胃每天给药两次 MXYS 或纯化水。每日两次给药时间分别为上午 8:00 和晚上 8:00（间隔 12 小时）。MXYS 粉末溶于纯....
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WGCNA 鉴定出一个在坏死性凋亡通路中富集的抑郁症相关基因模块
采用 RRA 软件包整合 GSE54566、GSE54565 和 GSE54568 数据集中一致上调和下调的差异表达基因，共鉴定出 2,513 个基因。这些基因的热图如图 1A所示。这三个数据集来源于不同的脑区——前扣带皮层、杏仁核和背外侧前额叶皮层——并包含重度抑郁症（MDD）患者与非精神疾病对照者的样本。RRA 方法识别出在多个独立数据集中始终排名靠前的差异表达基因，从而减少了数据集特异性的变异。随后，利用 WGCNA 对整合后的基因表达谱进行分析。
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异常神经元死亡在抑郁症的发病机制中起着关键作用8。坏死性凋亡（necroptosis）是一种程序性细胞死亡形式，近年来已被广泛研究，推动了靶向该通路抑制剂的显著进展39。自2005年发现坏死性凋亡抑制剂Nec-1以来40，针对坏死性凋亡信号通路关键组分的化合物研发已取得显著进展。Nec-1在神经系统疾病、心血管疾病和肾脏疾病的模型中均表现出对坏死性凋亡的保护作用41。此外，靶向中枢神经系统的坏死性凋亡抑制剂SAR443060已进入临床试验阶段42，但因在临床前开发过程中观察到毒性而被中止42。尽管坏死性凋亡抑制剂在神经系统疾病中的研究已较为深入，其在抑郁症中的潜在应用仍基本未被探索。与传统化学药物相比，中药具有多项潜在优势，包括适合长期给药、毒性和不良反应相对较低，以及药物研发成本较低。因此，开发调控坏死性凋亡的中药制剂可能为抗抑郁药物的研发提供一条有前.......
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利益冲突：
作者无任何利益冲突需要披露。
本研究受到中国河南省高等学校重点科研项目（编号：26A360008）、河南省中医药科研项目（编号：2025ZY3152）、国家自然科学基金（编号：82274496）、河南省科技攻关项目（编号：232301420018）以及国家中医药管理局科技司张仲景传承与创新项目（编号：GZY-KJS-2022-044-1）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott；Shi Changpu） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 231001 | 中药成分（12 g） |
| 胶带 | 不适用 | 不适用 | 尾悬吊实验 |
| 当归（Angelica sinensis (Oliv.) Diels；Dang Gui） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | G01230507-16 | 中药成分（10 g） |
| 抗ATF4抗体（免疫荧光） | Servicebio | GB111137 | 一抗 |
| 抗ATF4抗体（Western blot） | MedChemExpress | HY-P80486 | 一抗 |
| 抗BDNF抗体 | MedChemExpress | HY-P80567 | Western blot用一抗 |
| 抗CREB抗体 | Beyotime | AF1018 | Western blot和免疫荧光用一抗 |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | 上样对照 |
| 抗MLKL抗体 | Proteintech | 66675-1-Ig | Western blot和免疫荧光用一抗 |
| 抗NeuN抗体 | Servicebio | GB11138 | 免疫荧光用一抗 |
| 抗磷酸化CREB抗体 | Beyotime | AF5785 | 一抗 |
| 抗磷酸化MLKL抗体 | Bioss | bsm-54104R | 一抗 |
| 抗磷酸化RIPK1抗体 | Biolynx | BX60008 | 一抗 |
| 抗磷酸化RIPK3抗体 | Abcam | ab195117 | 一抗 |
| 抗RIPK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3493S | 一抗 |
| 抗RIPK3抗体 | Proteintech | 17563-1-AP | 一抗 |
| 白术（Atractylodes macrocephala Koidz.；Bai Zhu） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 230801 | 中药成分（10 g） |
| 自动行为追踪软件 | Panlab (Harvard Apparatus) | N/A | 用于旷场实验和尾悬吊实验的SMART 3.0视频追踪软件 |
| BCA蛋白定量检测试剂盒 | CWBIO | CW0014S | 蛋白定量 |
| 行为记录系统 | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | 旷场实验和尾悬吊实验 |
| Bio-Rad化学发光成像系统 | Bio-Rad | 12003154 | ChemiDoc MP成像系统，用于化学发光Western blot检测 |
| CellTiter-Lumi II发光细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | C0056XL | 细胞活力检测 |
| 共聚焦显微镜 | Nikon Eclipse C1 | N/A | 免疫荧光成像 |
| DAPI | Servicebio | G1012 | 细胞核染色 |
| 环保型脱蜡液 | Servicebio | G1128 | 石蜡脱蜡 |
| 胎牛血清（FBS） | BI | C04001-500 | 细胞培养添加剂 |
| 栀子（Gardenia jasminoides J. Ellis；Zhi Zi） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 22102109 | 中药成分（12 g） |
| 甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.；Gan Cao） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 230301 | 中药成分（3 g） |
| CY3标记的山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB21301 | 用于小鼠抗ATF4的荧光二抗（IF，CY3，1:300） |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB25301 | 用于小鼠抗MLKL的荧光二抗（IF，Alexa Fluor 488，1:400） |
| CY3标记的山羊抗兔IgG | Servicebio | GB21303 | 用于兔抗NeuN的荧光二抗（IF，CY3，1:300） |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG | Servicebio | GB25303 | 用于兔抗CREB的荧光二抗（IF，Alexa Fluor 488，1:400） |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Absin | abs20040 | Western blot用二抗 |
| HRP标记的小鼠抗兔IgG轻链二抗 | ABclonal | AS061 | Western blot用二抗 |
| 人TNF-α | Novoprotein | C008 | 坏死性凋亡诱导剂 |
| HT-22细胞 | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| HyClone培养基 | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | 细胞培养基 |
| ImageJ | NIH | 免费软件 | 条带定量分析 |
| 倒置显微镜 | Nikon | Eclipse Ti-SR | 细胞形态观察 |
| 液氮 | 河南吉来新能源科技有限公司 | N/A | 组织保存 |
| Molecular Devices酶标仪 | Molecular Devices | SpectraMax M5 | 发光检测 |
| 牡丹皮（Paeonia suffruticosa Andr.；Mu Danpi） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 22121714 | 中药成分（12 g） |
| Necrostatin-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | RIPK1抑制剂 |
| 多聚甲醛 | Servicebio | G1101-500ML | 组织固定 |
| 盐酸帕罗西汀半水合物 | Aladdin | P129711 | 阳性对照 |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | 洗涤缓冲液 |
| 薄荷（Mentha haplocalyx Briq.；Bo He） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 230101 | 中药成分（6 g） |
| 青霉素–链霉素 | Gibco | 15140-122 | 细胞培养抗生素 |
| 远志（Polygala tenuifolia Willd.；Yuan Zhi） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 20221101 | 中药成分（12 g） |
| 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 | Merck Millipore | ISEQ00010 | Western blot |
| 茯苓（Wolfiporia cocos；Fu Ling） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | D23070601 | 中药成分（15 g） |
| 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液 | CWBIO（江苏科威生物科技有限公司） | CW2333S | 蛋白提取 |
| 柴胡（Bupleurum chinense DC.；Chai Hu） | 北京同仁堂股份有限公司，中国郑州 | 230801 | 中药成分（12 g） |
| SDS-PAGE试剂 | Solarbio；Servicebio；上海源叶生物科技有限公司 | 不适用 | 丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tris、SDS、APS和TEMED均为实验室自配 |
| 戊巴比妥钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 69020181 | 麻醉剂 |
| 超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLC系统 | LC-MS分析 |
| UHPLC HSS-T3色谱柱（100 × 2.1 mm，1.8 μm） | Waters | 186003539 | 色谱分离 |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | 广谱caspase抑制剂 |
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