本方案旨在评估鲁斯可皂苷元在鼻咽癌细胞中的抗肿瘤功效。文中详细介绍了包括细胞活力、迁移、凋亡和铁死亡检测在内的全面方法学，以系统阐明该化合物通过靶向并下调KDM1A诱导双重细胞死亡的作用机制。
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本方案旨在评估鲁斯可皂苷元在鼻咽癌细胞中的抗肿瘤功效。文中详细介绍了包括细胞活力、迁移、凋亡和铁死亡检测在内的全面方法学，以系统阐明该化合物通过靶向并下调KDM1A诱导双重细胞死亡的作用机制。
鼻咽癌（NPC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤。天然化合物鲁斯可根素（Rus）具有抗肿瘤潜力。本研究通过探讨鲁斯可根素对鼻咽癌细胞的作用及其潜在的分子通路，阐明其在鼻咽癌中的具体作用机制。采用不同浓度的鲁斯可根素处理人鼻咽癌（NPC）细胞系C666-1。进行一系列 体外 通过细胞活力、增殖、迁移、侵袭、凋亡和铁死亡等检测方法评估细胞功能。采用蛋白质印迹法和分子对接技术研究赖氨酸特异性去甲基化酶1A（KDM1A）的作用，并通过过表达挽救实验验证其介导作用。竹节参皂苷剂量依赖性地抑制C666-1细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。机制上，竹节参皂苷处理诱导了细胞凋亡，表现为效应caspase-3活化以及Bax/Bcl-2平衡向促凋亡信号偏移；同时诱导铁死亡，特征为脂质过氧化水平升高和细胞内铁含量增加。这些抗肿瘤效应与KDM1A的下调显著相关。关键的是，强制过表达KDM1A显著减弱竹节参皂苷诱导的凋亡和铁死亡，并逆转恶性表型的抑制作用，从而证实KDM1A在其中的关键介导作用。竹节参皂苷通过下调KDM1A抑制鼻咽癌的恶性进展，进而促进细胞凋亡和铁死亡。该研究结果揭示了Rus-KDM1A轴是鼻咽癌治疗中一个具有前景的治疗靶点。
鼻咽癌（NPC）是一种由遗传因素和环境因素共同作用引起的癌症1。尽管放射治疗在临床治疗中已取得显著进展，但鼻咽癌患者的总体生存率仍不理想。这可能是因为鼻咽癌细胞增殖迅速，且极易向区域淋巴结和远端器官转移2。因此，深入探究促进鼻咽癌进展的分子机制至关重要。近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种新型的细胞死亡方式，其发生依赖于Fe2+和脂质过氧化物的铁依赖性调控，已被发现与鼻咽癌的发生发展密切相关3。现有证据表明，铁死亡在鼻咽癌中发挥着重要作用，诱导铁死亡可增强肿瘤的放射治疗效果4,5。
由于毒副作用小、不良反应较少，中药方剂已被广泛用于癌症治疗达数千年之久6,7。作为一类多组分、多靶点且具有协同作用的药物，中医处方已被用作预防和治疗癌症（包括鼻咽癌）的有效辅助疗法8,9,10。麦冬（RO）是百合科多年生草本植物 Ophiopogon japonicus 的根，据报道可作为辅助治疗手段有效缓解鼻咽癌11,12。麦冬中的主要活性成分鲁斯可皂苷元（Rus）已被报道具有显著的抗肿瘤作用13。在结直肠癌小鼠模型中，Rus 可改善紧密连接损伤并抑制肿瘤迁移14。更重要的是，Rus 还可通过诱导铁死亡降低胰腺癌细胞的存活率。然而，Rus 对鼻咽癌的作用尚不明确。
表观遗传学是癌症发病机制研究的主要领域，并提供了多种有效的治疗方法15。组蛋白甲基化是研究较为深入的表观遗传修饰之一，参与癌症的发生发展，同时也是药物设计的重要靶点16。组蛋白甲基化的动态调控由甲基转移酶和去甲基化酶共同介导17。KDM1A 是一种组蛋白赖氨酸去甲基化酶，因其参与表观遗传调控，被发现与肿瘤发生密切相关18。此外，KDM1A 被发现是一种在多种癌症（如肺癌和胰腺癌）中高表达的癌蛋白19。Guo 等报道，KDM1A 水平升高可抑制磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的表达，促进鼻咽癌细胞增殖和迁移，同时抑制细胞凋亡20。同时，研究还发现 KDM1A 的上调可抑制肺癌中的铁死亡21。Super-PRED 数据库分析表明，KDM1A 是 Rus 的潜在作用靶点。
尽管木犀草素（Rus）在其他癌症中已显示出公认的抗肿瘤潜力，但其在鼻咽癌中的具体作用及分子机制仍完全未被阐明，这构成了一个重要的研究空白。此外，尽管先前的研究分别将KDM1A与肿瘤增殖和铁死亡抵抗联系起来，但尚无研究探讨靶向KDM1A是否能够在鼻咽癌（NPC）中同时触发多种细胞死亡通路。因此，本研究为提出以下假设提供了有力依据：木犀草素可能通过直接下调KDM1A来抑制NPC细胞的恶性进展。
本研究旨在通过系统评估Rus对NPC细胞增殖、迁移和侵袭的影响，填补这一研究空白。本研究的主要创新之处在于揭示了一种双重作用机制策略，重点在于Rus能够同时诱导经典的细胞凋亡和铁依赖性的铁死亡。通过验证新型的Rus-KDM1A信号轴，本研究显著推进了当前认知，阐明了一种天然化合物如何通过同时阻断多条通路来克服肿瘤耐药性，为靶向NPC治疗提供了有前景的临床前理论依据。
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细胞培养、处理与转染
人鼻咽癌（NPC）细胞系 C666-1（RRID: CVCL_M597）和非恶性人鼻咽上皮细胞系 NP69（RRID: CVCL_F755）购自商业供应商。两种细胞系均通过短串联重复序列（STR）分型进行鉴定，并在使用前确认无支原体污染。常规培养时，C666-1 细胞在 RPMI 1640 培养基中培养，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素。NP69 细胞则在角质形成细胞无血清培养基中培养，添加 10% FBS、10 ng/mL 重组表皮生长因子以及 1% 青霉素-链霉素。鲁斯可皂苷元（Rus；纯度 ≥ 98%）购自商业供应商。两种细胞系均在 37 °C、5% CO₂ 的加湿培养箱中培养。处理实验中，细胞在不同浓度（10、20、50 µM）的鲁斯可皂苷元（Rus）中处理 24 h22。转染实验中，当细胞融合度达到 70–80% 时，将购自商业供应商的编码赖氨酸特异性去甲基化酶 1A 的过表达质粒（oe-KDM1A）及相应的阴性对照空载体（oe-NC）转染至 C666-1 细胞。具体操作为：将 2.5 µg 质粒 DNA 和 5 µL 脂质转染试剂分别用 150 µL 低血清培养基稀释，轻轻混匀，室温孵育 20 分钟后，按照生产商说明书加入 6 孔板的每孔中。细胞在 37 °C 培养 48 小时后，检测转染效率。
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测
采用CCK-8法检测Rus处理后细胞的存活率。实验中，首先将细胞接种于96孔板中，过夜培养。随后每孔加入10 µL CCK-8溶液启动检测，经2 h孵育后，使用酶标仪在450 nm波长处测定反应产生的比色变化，以光密度（OD）值表示。
集落形成实验
为评估克隆形成存活率，将 C666-1 细胞接种至 6 孔板中，培养 14 天。孵育结束后，用 100% 甲醇固定形成的克隆 10 分钟，随后用 0.5% 结晶紫染色 30 分钟以显色。通过显微成像并计数染色的克隆数量进行定量分析。
蛋白质印迹
进行蛋白质印迹分析时，首先使用 RIPA 缓冲液从细胞中提取总蛋白，将所得裂解物离心（12,000 × g）以收集上清液。采用 BCA 法测定蛋白浓度。将等量的总蛋白（每泳道 30 µg）上样，并通过 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离。分离后，在冰上以恒定电压 100 V 转移蛋白至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续 90 分钟。随后将膜置于含 0.1% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）中配制的 5% 牛血清白蛋白（BSA）封闭液中，室温封闭 2 小时。然后，将膜在 4°C 下与以下用封闭缓冲液稀释的一抗（均为 1:1000）孵育过夜：Ki67、PCNA、MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax、KDM1A、SLC7A11、GPX4、ACSL4、TFR1 和 β-actin。最后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育 2 小时后，使用增强型化学发光（ECL）检测试剂显影免疫反应条带，并采用图像分析软件进行密度测定分析。
伤口划痕实验
在伤口愈合实验中，将 C666-1 细胞在 6 孔板中培养至 80% 汇合度。使用 200 µL 移液枪头刮划单层细胞，形成均一的伤口。用 PBS 洗涤去除脱落的细胞后，更换为无血清培养基，继续培养 24 小时。在 0 小时和 24 小时使用光学显微镜拍摄伤口区域的图像，以评估细胞迁移能力。
Transwell 实验
采用预先包被50 µL基底膜基质的Transwell小室（8-µm孔径）评估细胞侵袭能力。使用Transwell小室检测C666-1细胞的侵袭能力。将悬浮于无血清培养基中的细胞接种至上方插入式小室中，下室则加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。经24小时孵育后，小心去除膜上表面未侵袭的细胞。为进行定量分析，对穿过膜至基底侧表面的细胞用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，随后通过光学显微镜拍摄图像并计数。
流式细胞术
采用流式细胞术定量细胞凋亡。样品制备时，收集 C666-1 细胞，用预冷的 PBS 洗涤，随后重悬于 100 µL 结合缓冲液中。细胞随后用 Annexin-V-FITC（20 µg/mL）和碘化丙啶（PI）进行共染色。染色过程在冰上避光孵育 15 分钟完成。立即使用流式细胞仪采集数据，以确定凋亡细胞的百分比。
检测caspase-3活性
根据制造商说明书，使用商用检测试剂盒检测 Caspase-3 活性。简言之，裂解 C666-1 细胞，14,000 × g 离心后收集上清液。加入试剂孵育 2 小时后，在 405 nm 处测定各上清液的吸光度。
RT-qPCR
使用商业化的RNA提取试剂从C666-1细胞中纯化总RNA。根据生产商说明书，使用商业化试剂盒将获得的RNA逆转录为第一链cDNA。随后在实时荧光定量PCR系统中，采用基于SYBR Green的预混液进行定量PCR（qPCR）分析基因表达。相对转录水平通过比较Ct值法（2⁻△△Ct）进行计算。扩增所用引物序列如下：β-actin（正向：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'；反向：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'）和KDM1A（正向：5'-TGACCGGATGACTTCTCAAGA-3'；反向：5'-GTTGGAGAGTAGCCTCAAATGTC-3'）。
硫代巴比妥酸反应性物质（TBARS）检测
为检测脂质过氧化，首先通过沉淀法（15% 三氯乙酸，500 mM 抗坏血酸）和在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟，从 C666-1 细胞中制备上清液。随后，上清液与 0.375% 硫代巴比妥酸反应，并在 100 °C 加热 10 分钟以生成丙二醛-硫代巴比妥酸（MDA-TBA）加合物。通过酶标仪在 532 nm 处测定该加合物的吸光度，以评估脂质过氧化水平23。
脂质活性氧（ROS）的检测
采用脂质过氧化荧光探针检测脂质过氧化反应。将C666-1细胞接种于6孔板中，培养过夜后加入荧光探针（2 µM）。该探针在氧化后荧光由红色转变为绿色。使用激光扫描共聚焦显微镜和图像分析软件分析绿色/红色荧光比值。所绘制的绿色/红色荧光比值清晰明确，被用作脂质过氧化水平的定量指标24。
Fe2+ 的检测
使用细胞内铁荧光探针检测细胞内亚铁离子（Fe2⁺）水平。将 C666-1 细胞与 10 µM 荧光探针共同孵育 10 分钟。用 PBS 洗涤以去除未结合的探针后，通过荧光显微镜分析细胞。
分子对接分析
分子对接是一种关键的计算方法，通过评估配体与其靶标蛋白之间的结合模式，预测其结合亲和力及相互作用，从而促进新药设计25。从 RCSB PDB 网站（https://www.rcsb.org/）获取了 KDM1A 的三维结构（PDB ID: 6NQU）。在准备 KDM1A 蛋白结构时，去除了水分子以及无关的小分子配体。采用拉马克遗传算法，通过分子对接软件进行分子对接模拟，并利用分子可视化软件进行结果的可视化分析26。
统计学分析
所有实验均使用至少三个独立的生物学重复进行，结果以均值 ± 标准差（SD）表示。采用统计分析软件进行统计分析。多个组之间的差异通过单因素方差分析（ANOVA）进行评估，随后进行Tukey多重比较事后检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性差异。
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鲁斯可皂苷元选择性抑制鼻咽癌细胞的活力和增殖
本研究首先探讨了鲁斯可皂苷元（Rus）对正常鼻咽上皮细胞（NP69）和鼻咽癌（NPC）细胞（C666-1）活力的影响。CCK-8实验结果显示，在10、20和50 µM浓度下，Rus对正常NP69细胞无明显细胞毒性。相反，鲁斯可皂苷元（Rus）以浓度和孵育时间依赖的方式显著抑制C666-1癌细胞的存活。在50 µM时观察到最显著的细胞毒性作用（p < 0.001）（图1B-C）。接下来，通过克隆形成实验评估Rus处理后C666-1细胞的克隆形成能力，结果表明，Rus以高度显著的剂量依赖方式显著抑制C666-1细胞的克隆形成能力（图1D）。为在分子水平上验证这些结果，通过Western blot分析了增殖相关蛋白Ki67和PCNA的表达水平（图1E）。这些结果表明，与正常鼻...
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鼻咽癌（NPC）是一种严重的恶性肿瘤，具有较高的转移发生率，因此迫切需要更有效的干预措施27。本文研究表明，麦冬皂苷元（Rus）是一种源自麦冬根（Radix ophiopogonis）的天然产物，对NPC细胞具有显著的抗肿瘤作用。研究还发现，Rus通过抑制组蛋白去甲基化酶KDM1A，从而阻断NPC的进展，并进一步诱导两种不同类型的程序性细胞死亡，即细胞凋亡和铁死亡。本文阐述了NPC中一条 previously unknown 的Rus-KDM1A信号轴，揭示了一种双重作用机制，有助于提升其治疗潜力。
癌细胞的侵袭与迁移能力是决定肿瘤转移的关键因素。癌细胞的迁移和侵袭能力是导致转移的主要原因之一，且与不良临床预后密切相关。在大多数情况下，这一过程由基质金属蛋白酶等蛋白水解酶介导，如基质金属蛋白酶2（MMP 2）和MMP 9，这些酶在此类情况下高表达28。这些发现有力地支持并拓展了既往关于鲁斯可皂苷元抗肿瘤特性的研究。结果与先前报道中其在肝细胞癌中表现出的抗转移作用一致22...
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作者声明不存在竞争性财务利益。作者声明，在本研究的构思、数据收集、数据分析或图像生成过程中，未使用任何生成式人工智能工具。人工智能辅助技术仅在本稿件撰写过程中用于轻微的语言编辑和语法校正。作者对已发表作品的内容和完整性承担全部责任。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统 | 应用生物系统公司 | 4351106 | RT-qPCR 分析 |
| Annexin-V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒 | BD 生物科学 | 556547 | 流式细胞术凋亡检测 |
| 抗ACSL4抗体 | Abcam | ab155282 | Western blot 一抗 |
| 抗Bax抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | 5023 | Western blot 一抗 |
| 抗Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | 15071 | Western blot 一抗 |
| 抗体 | |||
| 抗GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | Western blot 一抗 |
| 抗KDM1A（LSD1）抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | 2139 | Western blot 一抗 |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | Western blot 一抗 |
| 抗MMP2抗体 | Abcam | ab92536 | Western blot 一抗 |
| 抗MMP9抗体 | Abcam | ab76003 | Western blot 一抗 |
| 抗PCNA抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | 13110 | Western blot 一抗 |
| 抗兔 IgG，HRP 标记 | Cell Signaling Technology (CST) | 7074 | 二抗 |
| 抗SLC7A11（xCT）抗体 | Abcam | ab175186 | Western blot 一抗 |
| 抗TFR1抗体 | Abcam | ab84036 | Western blot 一抗 |
| 抗-β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | 4970 | 内参蛋白一抗 |
| 检测试剂盒 | |||
| Autodock 4.2 | 斯克里普斯研究所 | N/A | 分子对接模拟 |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | 碧云天生物技术 | P0012 | 蛋白质定量 |
| BODIPY 581/591 C11 探针 | Invitrogen（Thermo Fisher Scientific） | D3861 | 脂质活性氧检测（2 μM) |
| C666-1 细胞系 | iCell Bioscience Inc. | iCell-h378 | 人鼻咽癌细胞系 |
| Caspase-3 活性检测试剂盒 | 碧云天生物技术 | C1115 | 细胞凋亡评估 |
| CCK-8 检测试剂盒 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | 细胞活力测定 |
| 化学品 & 试剂 | |||
| CytoFLEX 流式细胞仪 | 贝克曼库尔特 | CytoFLEX | 细胞凋亡分析 |
| ECL 检测试剂 | MilliporeSigma | WBKLS0500 | Western blot 显色（Immobilon） |
| 仪器设备 | |||
| 胎牛血清（FBS） | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10099141 | 细胞培养添加剂 |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | N/A | 统计分析与作图 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | N/A | 图像密度测定分析 |
| 无血清角质形成细胞培养基 | iCell Bioscience Inc. | iCell-019 | 用于NP69细胞培养 |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | 卡尔·蔡司 | LSM 880 | BODIPY C11 荧光成像 |
| 光学/荧光显微镜 | Olympus | IX73 | 划痕实验，Transwell & Fe2+成像 |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | 罗氏诊断 | 4887352001 | 定量实时聚合酶链式反应 |
| Lipofectamine 2000 试剂 | Invitrogen（Thermo Fisher Scientific） | 11668019 | 细胞转染试剂 |
| Matrigel | Corning | 356234 | 用于侵袭实验的基底膜基质 |
| 酶标仪 | Molecular Devices | SpectraMax M5 | 吸光度测量（405、450、532 nm） |
| NP69细胞系 | iCell Bioscience Inc. | iCell-h431 | 正常人鼻咽上皮细胞系 |
| oe-KDM1A & oe-NC 质粒 | 上海吉凯基因化学有限公司 | 定制合成 | 用于KDM1A过表达的质粒 |
| Phen Green SK（PGSK）探针 | Invitrogen（Thermo Fisher Scientific） | P14312 | 细胞内 Fe2+ 检测（10 μM) |
| Pymol 3.0 | 施ödinger | N/A | 分子对接可视化 |
| 逆转录试剂盒 | 罗氏诊断 | 4379012001 | Transcriptor 第一链 cDNA 合成试剂盒 |
| RIPA 裂解缓冲液 | Solarbio（北京，中国） | R0010 | 总蛋白提取 |
| RPMI 1640 培养基 | iCell Bioscience Inc. | iCell-0002 | 用于C666-1细胞培养 |
| 鲁斯可皂苷元（Rus） | MedChemExpress (MCE) | HY-N0193 | 药物处理，纯度 ≥ 98% |
| 软件 | |||
| TBARS 检测试剂盒 | Cayman Chemical | 10009055 | 脂质过氧化测定 |
| TRizol 试剂 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)* | 15596026 | 总RNA提取 |
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