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一种无需标记、基于实时阻抗的高通量抗病毒筛选方法

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DOI：

10.3791/72539

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2026年9月3日

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1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

基于阻抗的实时细胞分析（RTCA）方法能够实时、无标记地定量病毒诱导的细胞病变效应，通过集成的软件驱动检测流程，为评估抗病毒化合物和单克隆抗体提供了一种快速的方法。

摘要

基于阻抗的技术为定量检测细胞培养单层中的细胞病变效应（CPE）提供了可靠且客观的方法，克服了传统终点法或视觉主观检测方法的局限性。溶细胞病毒通常在感染的细胞培养物中引发显著的形态学变化和细胞死亡，因此能够反映细胞黏附性、形态和活力变化的阻抗测量，成为检测病毒感染及其进展的敏感且动态的指标。因此，基于阻抗的检测方法为评估抗病毒干预措施的保护效果提供了一种强大而高效的手段。本研究介绍了一种实时、无标记的筛选平台，该平台利用先进的阻抗测量系统对病毒诱导的CPE进行连续监测。该方法无需额外的标记或染色步骤，即可快速、定量地评估小分子药物和单克隆抗体的抗病毒功效。本方案详细描述了完整的检测流程，从细胞接种、病毒感染到数据采集与分析。此外，专为病毒学应用定制的系统集成软件可简化数据处理与解读过程，有助于确定单克隆抗体的中和效力以及抗病毒化合物的活性。

引言

当面临病毒暴发威胁时，疫苗和抗病毒治疗药物是限制病毒传播和治疗感染患者的首要策略1。疫苗通过激活免疫系统以识别病原体，从而预防感染，并提供主动且长期的保护。抗病毒治疗药物的用途则因药物的作用机制和设计而异。与疫苗类似，单克隆抗体可提供主动且持续的保护（数周至数月），也可作为暴露后控制的工具。单克隆抗体和抗病毒小分子治疗药物均可用于治疗已建立的感染，通过直接靶向或抑制病毒组分，减轻疾病严重程度，起到反应性、短期干预的作用。

评估生物系统中抗病毒活性的传统方法是病毒减量中和试验（VRNT），该方法通过噬斑减少中和试验（PRNT）中噬斑形成减少的程度进行定量，或通过焦点 通过 免疫染色在焦点减少中和试验（FRNT）中的应用，或基于细胞活力检测方法观察细胞病变效应（CPE）。空斑减少中和试验（PRNT）被认为是测定抗病毒药物对多种病毒感染抑制活性的金标准表型方法。2然而，PRNT 费时且劳动密集，结果判读可能具有主观性，尤其是在长时间孵育过程中出现蚀斑过度生长或融合时。通过使用 FRNT 可提高检测读数的客观性，该方法依赖于病毒特异性抗原或报告基因表达的检测。但此方法可能受限于高质量抗体或检测用酶的可获得性及性能表现。目前已有多种试剂和检测方案被广泛确立并用于细胞活力评估，以测量细胞病变效应（CPE）的某些方面。活细胞中线粒体脱氢酶可催化单四唑盐 MTT 比色试剂（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物）还原，生成有色的甲臜产物，从而产生可定量的比色信号。细胞活力检测试剂（可裂解细胞并释放胞内 ATP，驱动荧光素酶催化的反应，将底物荧光素转化为氧化荧光素）是一种均相发光检测法。此类细胞活力检测可用于在抗病毒药物筛选过程中定量评估 CPE 的减少程度3然而，这些方法同样需要多个洗涤和染色步骤，并且与PRNT和FRNT检测一样，属于终点检测。因此，如果抗病毒检测在非最佳时间点终止，那些对病毒感染具有延迟效应的部分有效抗病毒药物可能会被遗漏。因此，迫切需要一种能够实时监测细胞对病毒感染反应的自动化中高通量检测方法。

实时细胞分析（RTCA）系统通过无标记、非侵入性的阻抗检测方法，能够在易感细胞模型中持续监测细胞病变效应（CPE）的发展及抗病毒反应。病毒诱导的细胞病变效应不仅包括细胞死亡，还涉及细胞形态和黏附性的改变，这些变化均可通过电学阻抗的改变被灵敏地检测到4,5。这些阻抗测量是利用嵌入特制96孔细胞培养板中的金微电极传感器实现的，可在无需标记物或报告基因表达的情况下，对细胞动态反应进行定量评估。RTCA技术已广泛应用于多种病毒家族感染的不同细胞模型中检测细胞病变效应，并用于评估抗体的中和活性6–10。

此处是这种实时、无标记阻抗检测方法的关键步骤 体外 抗病毒检测的方案已确定。该方法参考了既往研究，包括在腺病毒5型感染的HEK293A细胞中筛选抗病毒化合物，以及在Vero CCL-81细胞中利用表达拉沙病毒糖蛋白的复制型重组水泡性口炎病毒（rVSV-LASV(Lin IV)）评估中和抗体。11所有这些实验均在 RTCA MP 系统上进行，该系统支持同时运行最多 6 个× 96孔板同时进行。本研究旨在为基于阻抗的抗病毒筛选建立基础。一旦使用本文所述方案确定了最佳检测条件，该方法便可轻松扩展至多种病毒-细胞模型。

方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. 允许性细胞培养与传代

注意：本实验方案中，Vero CCL-81 细胞用于抗体中和实验，而 HEK293A 细胞用于抗病毒化合物筛选。为减少实验间的差异，强烈建议在相同传代次数下制备易感细胞的细胞库。

  1. 使用前将细胞培养基——含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）——置于37°C水浴中预热。
  2. 将一管冻存的易感细胞在37°C水浴中解冻，直至仅剩少量冰晶；水浴时切勿将管盖浸入水中。 
  3. 用70%乙醇擦拭管外壁后，将含有复苏细胞的冻存管放入生物安全柜（BSC）中。
  4. 轻柔地将细胞转移至一个新的50 mL锥形管中，并逐滴加入9 mL预热的培养基。轻轻混匀。
  5. 在室温（RT）下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
  6. 将重悬的细胞用5 mL预热的培养基转移至一个新的T-25培养瓶中。
  7. 将细胞置于37°C、5% CO2的培养箱中培养至80%–90%汇合度，再进行下一次传代培养。 
  8. 进行细胞传代。
    1. 吸除培养基，并用3 mL 1×不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞单层两次，以去除残留的培养基。
    2. 向培养瓶中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖细胞。
    3. 在37°C孵育2–5分钟后，加入5倍体积的预热培养基以中和胰蛋白酶活性。
    4. 通过移液器轻轻吹打细胞悬液，使其沿瓶壁上下重悬细胞。
    5. 用新鲜培养基按所需接种密度或传代比例接种细胞。 
      注：所需细胞接种密度需根据细胞生长速率、传代频率以及传代时的目标汇合度通过实验确定。例如，Vero CCL-81细胞的接种密度至少为0.4 × 104 个细胞/cm2，可使其每3天传代一次，且在传代前达到90%汇合度。

2. 抗病毒药物筛选

注意： 图1 展示了基于阻抗的抗病毒筛选实验的工作流程。简而言之，将易感细胞接种至集成微电极的96孔微孔板中，并在实验开始前持续监测细胞状态约24小时。在抗体中和试验中，将固定感染复数（MOI）的病毒与抗体混合，预先孵育1小时后加入细胞。而在抗病毒化合物筛选中，则是将固定MOI的病毒与化合物同时加入细胞。通过基于阻抗的检测方法持续监测病毒诱导的细胞病变效应（CPE），数据分析可在实验过程中或实验结束后进行。

  1. 第0天：测量培养板背景值并接种容许细胞
    1. 开始实验时，打开仪器软件（RTCA Pro）并为实验选择所需的托架。接下来，选择 病毒学 在开始实验之前，请先检查模块。
    2. 在相应位置输入任何相关备注 实验注意事项 标签（例如， 实验名称, 设备序列号, 设备类型，或其他相关细节）。这些字段为可选，若不适用可留空。
    3. 导航至 布局 标签并定义实验中使用的孔。如果某些孔不使用，请选中这些未使用的孔，在板布局界面中右键单击，然后选择 关闭孔板 从下拉菜单中选择以将其从检测中排除。
    4. 微电极集成式96孔微孔板背景值的测量
      1. 分配 50 µL 使用多通道移液器以反向移液模式向板的每孔加入检测培养基，以尽量减少气泡形成。
        注意：在开展筛选前，应优化检测培养基的选择，以尽量减少对检测灵敏度的干扰，并确保准确评估治疗效果。例如，抗体中和实验采用含2%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，而抗病毒化合物筛选实验则使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的细胞生长培养基。
      2. 将培养板放入仪器内部的支架中 37 °C 5% CO₂ 培养箱2确保将酶标板正确朝向，使A1孔位于所示位置。接着，检查消息选项卡中是否有任何错误提示。
        注意：每次将酶标板放入支架时，需确认显示信息“Plate scanned. Connections okay”。若出现错误，取出酶标板并重新放置于支架中。
      3. 导航至 时间安排 标签；步骤1默认显示，因为它是用于测量板背景的必要步骤。单击 开始 点击按钮以启动对各孔的记录。在完成一次背景阻抗测量后，该步骤将自动结束。
        注意：此背景步骤必须在每次实验前执行。实验中使用的所有孔中应仅含有检测培养基（即，在接种细胞前）。
    5. 允许性细胞接种至集成微电极的96孔板
      1. 按照容许细胞传代部分所述步骤，对T25培养瓶中的容许细胞进行胰蛋白酶消化。
      2. 计数重悬于检测培养基中的细胞，并进行以下计算：
        1. 使用活细胞密度计算悬液中的总活细胞数：总活细胞数 = 活细胞密度 × 悬浮体积
        2. 将细胞悬液调整至最终密度（例如，0.30–0.35） × 106 细胞/mL，相当于每 Vero CCL-81 约 15,000–18,000 个细胞 50 µL，或 0.12 × 106 个细胞/mL（HEK293A），相当于每 50 µL).
          注意：上述接种密度已在此前的研究中被确定为每种病毒-细胞模型的最佳密度。适当的细胞接种密度至关重要，因为细胞数量过多或过少都可能影响检测的灵敏度。
      3. 移除含有微孔板的 50 µL 从仪器中取出检测培养基，并转移至生物安全柜中进行细胞接种。
      4. 分配 50 µL 使用多通道移液器以反向移液模式将细胞悬液加入板的每孔中，以尽量减少气泡产生，使每孔终体积达到 100 µL.
    6. 加入细胞后，将培养板置于生物安全柜中室温下静置30分钟，以使细胞均匀分布在每孔底部。
    7. 将培养板放回仪器内部的托架中 37 °C 5% CO₂ 培养箱2.
      注意：若使用多个培养板，需清晰标记每一块板，并确保其放回背景测量时所用的同一支架中。
    8. 导航至 布局 标签并打开 细胞 子标签。选择适当的孔，并输入许可性细胞 名称 和 数量，然后点击 应用 以保存信息。在实验过程中的任何阶段，均可输入或更新细胞信息。
    9. 添加第二步到 时间安排 使用默认记录设置（100次扫描，间隔15分钟）进行标签设置，然后点击 开始 以启动对细胞贴附和增殖的连续过夜监测。
      注意：此步骤用于病毒接种前的细胞质量控制（QC）。由于细胞指数（Cell Index, CI）反映细胞的贴壁和增殖状态，因此接种后18–24小时获得的CI值被用作关键的质量控制指标。实验间细胞行为的可重复性对于实现最佳检测重复性至关重要。值得注意的是，CI的振幅和动力学曲线具有细胞类型特异性。例如，过夜培养后，以18,000个细胞/孔接种的健康Vero CCL-81细胞通常表现出6–8的细胞指数，而以6,000个细胞/孔接种的健康HEK293A细胞的细胞指数通常为0.8–1.2。
  2. 第1天：基于阻抗的抗病毒药物筛选
    注意：在进行筛选实验之前，应对病毒进行适当的滴定，以确定最佳工作稀释度。该步骤旨在确定一种能够支持实验强健性与可重复性的病毒浓度，同时满足用户自定义的要求，例如期望的实验持续时间。例如，在抗体中和实验方案中11选择感染复数（MOI）为0.01进行中和试验，因为该条件下接种后40小时内可产生完全（100%）的细胞病变效应（CPE）。在基于阻抗的检测中，细胞指数或归一化细胞指数降至零表示CPE完全发生。在抗病毒化合物筛选过程中，采用MOI为1，接种后70小时内观察到100%的CPE。病毒滴定实验方案遵循先前报道中描述的既定程序。12若实验中使用传染性病毒，须遵循所有适用的安全防护措施。请参阅传染性病毒操作安全指南部分。
    1. 按照预定浓度制备病毒，并在检测培养基中对抗体或抗病毒化合物进行系列稀释。
    2. 对于单克隆抗体中和实验，混合 60 µL 4℃下的病毒× 最终检测浓度为 60 µL 4℃下抗体的× 最终检测浓度，并在 37 °C 在加入许可性细胞前孵育1小时。混合后，病毒与抗体的浓度为2× 其最终检测浓度。相比之下，抗病毒化合物筛选检测无需进行病毒-化合物预孵育。
    3. 导航至 布局 标签并选择 治疗 输入抗病毒药物治疗信息至相应孔中。
    4. 选择相同处理的孔，然后输入 名称 的试剂并输入起始点 稀释 或 浓度例如，如果起始浓度为 10 µg/mL，输入 10 并选择 µg/mL 作为“单位输入” 3 作为 稀释倍数 并指定 方向 稀释顺序（例如，从上到下）。
      注意：单击后 应用，将根据输入的板布局自动计算并保存抗病毒试剂的浓度或稀释度，并在相应的孔中显示。计算所得的数值也会被保存，用于后续数据分析。输入病毒信息（例如， 名称 和 稀释）是可选的，因为该检测对所有病毒处理孔使用单一固定的感染复数（MOI）。
    5. 将仅用病毒处理的孔指定为阳性对照，方法是选择相应的孔并进行选择 阳性对照 在……下方 孔类型.
    6. 将未感染的孔指定为阴性对照，方法是按照上述步骤操作并进行检查 阴性对照 在……下方 孔板类型.
      注意：需正确指定仅含病毒孔和未感染孔 阳性对照 和 阴性对照分别使用 孔板类型 设置至关重要，因为这些孔的CI值将用于所有与中和相关的计算（如%中和）。对于与细胞病变效应（CPE）相关的计算（如%CPE），必须明确指定阴性对照孔。在抗体中和实验中，强烈建议在同一块板上同时设置阳性和阴性对照抗体，以确保数据解读的准确性。然而，这些对照抗体应被指定为 样本 在……下方 孔板类型.
    7. 当检测准备就绪可添加抗病毒剂时，按下 中止当前步骤 单击按钮以跳过步骤2中剩余的扫描，进入下一步。
    8. 点击 解锁板 按钮，然后将培养板从支架中取出并放入生物安全柜中。
    9. 轻柔地分配 100 µL 使用多通道移液器将病毒-抗体混合物或病毒-抗病毒化合物混合物加入各孔中，使每孔终体积为 200 µL接种物包含病毒以及抗体或抗病毒化合物，浓度为2× 其最终检测浓度，在加入细胞后稀释至最终工作浓度。
    10. 将酶标板放回孵育架后，导航至 时间安排 标签并添加步骤3。指定数量 扫描 以及 间隔l 次扫描之间。确保总扫描持续时间（扫描次数 × 间隔）超过预期治疗时间。点击 开始 继续数据采集并完成检测。
      注意：在添加抗病毒试剂后指定一个独立的步骤（例如，步骤3），有助于清晰识别处理后的监测阶段。除步骤1外，每个步骤的设定运行时间应始终长于预期的实验持续时间。如果达到设定的运行时间，仪器将停止采集数据，导致部分数据点缺失。
  3. 第1天及之后：数据分析
    1. 要查看数据采集期间细胞反应的实时记录和/或分析，请导航至 数据分析 选择标签，选定特定时间点或时间区间，然后选择并添加需纳入分析的孔，以在图表中显示。
    2. 从以下选择参数 Y轴 下拉菜单。当 归一化细胞指数 （NCI）被选中时，需注明 归一化时间从下拉列表中选择治疗前的立即时间点。 %CPE 或 中和率% 也可以通过从 Y 轴下拉菜单中选择相应的选项来显示。
      注意：该仪器采用无量纲参数细胞指数（Cell Index, CI）来表示阻抗。推荐使用归一化细胞指数（Normalized Cell Index, NCI）评估处理差异，以尽量减少孔间固有变异的影响。
    3. 导航至 参数 部分关于 数据分析 切换至计算并生成不同类型的图表，例如在特定时间点（如检测的中点或终点）的柱状图以及四参数逻辑（4PL，可变斜率）回归剂量-反应曲线。或者，该 IC₅₀ 由处理后细胞指数（Cell Index）或归一化细胞指数（Normalized Cell Index）曲线下面积（AUC）计算得出的结果，可反映抗病毒药物在整个处理期间的整体剂量-反应关系。
    4. 测试结束时，单击 暂停，然后按下 解锁板 按钮。将酶标板从支架中取出并电子化 释放 它 通过 的 培养皿 菜单

3. 传染性病毒操作的安全指南

  1. 穿戴适当的个人防护装备，包括双层手套、面罩和实验服。处理病毒时强烈建议采取此类防护措施。
  2. 所有含病毒材料的操作及加样步骤必须在运行中的生物安全柜内进行。
  3. 运输病毒冻存管及任何含有病毒的培养板时，必须将其置于密封的生物安全转运容器中，在生物安全柜之间往返移动。
  4. 在生物安全柜内操作含病毒材料前后，需用消毒剂彻底喷洒柜内所有表面，并保持5分钟接触时间，以确保病毒完全灭活。随后用纸巾擦拭表面，并使用70%乙醇再次消毒，以去除残留的消毒剂。
  5. 完成基于阻抗的抗病毒筛选实验后，将所有培养板从仪器中取出，并使用密封的生物安全转运容器直接转移至洁净的生物安全柜内。
  6. 配制新鲜的20%次氯酸钠溶液，加入实验板的每个孔中。静置10分钟后吸去液体，并按规范处置培养板。
  7. 所有可能接触过病毒的实验板、血清移液管、移液器吸头、离心管及其他一次性塑料制品，均需用次氯酸钠溶液去污后，投入指定的生物危害废物袋中处理。
  8. 对不可丢弃的塑料器具（如试管架和移液器）喷洒消毒剂，并进行擦拭处理。

结果

无标记、实时阻抗检测揭示病毒诱导的细胞病变效应及抗病毒保护作用
如图2A所示，将HEK293A宿主细胞以每孔6,000个细胞的密度接种至集成微电极的96孔板中13。经过24小时培养后，在存在或不存在抗病毒化合物的条件下，加入5型腺病毒（MOI为1）。通过实时、无标记的阻抗检测持续监测细胞对病毒感染和抗病毒处理的反应。在未感染病毒的情况下，细胞在80小时的监测期内持续增殖，阻抗值稳步上升并最终达到平台期，表明细胞已汇合。腺病毒感染初期允许细胞生长约20小时，随后出现明显的细胞病变效应（CPE），导致感染后约65小时阻抗信号迅速下降至基线水平。使用司他夫定（50 µM）或利巴韦林（20 µM）处理对病毒诱导的细胞病变效应影响甚微，其阻抗曲线与仅感染病毒的细胞相近。更昔洛韦（50 µM）表现出适度的抗病毒活性，表现为归一化细胞指数的部分恢复。相比之下，西多福韦（50 µM）和布林西多福韦（1 µM）显著减轻了细胞病变效应，其阻抗曲线与未感染的阴性对照细胞相似。值得注意的是，在初步研究中，这些化合物在测试浓度下与载体处理对照组相比，对细胞指数均无显著影响（数据未显示）。

在基于阻抗的抗体中和实验中，将 Vero CCL-81 细胞以每孔 18,000 个细胞的密度接种于集成微电极的 96 孔板中，培养 24 小时后进行感染。实验当天，单克隆抗体与 rVSV–LASV 在 MOI 为 0.01 的条件下预孵育 1 小时，随后加入细胞中。在所测试的单克隆抗体（mAbs）中观察到不同的中和特征。为便于说明，图 2B 展示了具有强效、部分或无中和活性的抗体的代表性结果。非中和性抗体诱导完全的细胞病变效应（CPE），其阻抗曲线与仅含病毒的对照组重叠。具有中等中和活性的抗体部分减轻了病毒诱导的细胞毒性，导致细胞病变效应减弱但仍可检测到。相比之下，完全中和性抗体彻底抑制了细胞病变效应，其阻抗信号与未感染细胞的对照组相当。综上，这些阻抗特征可清晰区分非中和性、部分中和性及完全中和性的单克隆抗体。

抗病毒活性的定量与表征
在证明了基于阻抗的RTCA检测方法能够从药物和单克隆抗体文库中鉴定出“阳性结果”后，本研究进一步对优选化合物和抗体的效力进行了表征。将抗病毒药物布林西多福韦（brincidofovir）的浓度从15.6 nM逐步增加至1,000 nM，可导致阻抗信号呈阶梯式上升；药物浓度越高，细胞行为越接近未感染对照组（图3A）。此外，单独使用布林西多福韦处理仅在最高测试浓度（1100 nM）时使归一化细胞指数（NCI）出现轻微上升。然而，在低于1100 nM的浓度下，NCI略有下降，尽管该效应不具有剂量依赖性。该结果表明，细胞指数的恢复完全归因于药物的抗病毒活性，而非对细胞增殖或贴附能力的直接促进作用（图3B）。将归一化细胞指数曲线下面积（AUC）作为布林西多福韦浓度的函数作图，可得到剂量-反应曲线，其拟合效果良好（R2 = 0.99），并显示IC50为265 nM（图3C）。在抗体中和实验中，在实验结束时（处理后约50小时），系统软件自动计算了每个单克隆抗体浓度下的中和百分比，并据此推导出IC50值。如图3D所示，与阴性对照抗体rANDV-5相比，其余三种单克隆抗体r37.2D、r25.1C和r12.1F表现出较强的抗病毒效力，其IC₅₀值分别为4,315 ng/mL、83 ng/mL和232 ng/mL14,15。

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图1基于阻抗的抗病毒筛选实验流程示意图 第0天， 步骤1：将容许性细胞接种至微孔板中，并在位于培养箱内的仪器支架中监测细胞生长情况 37 °C 5% CO₂ 培养箱2 约24小时。第1天，步骤2：将病毒以固定的MOI制备，并进行抗病毒剂的系列稀释。对于抗体中和实验，病毒预先与抗体孵育 37 °C 孵育1小时后，将混合物加入细胞中。第3步：将病毒-抗病毒剂混合物加入细胞。第1天及之后，第4步：通过基于阻抗的检测方法连续数天监测病毒诱导的细胞病变效应（CPE）。第5步：实时或在实验结束后分析数据。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图2：基于阻抗的细胞指数实时监测抗病毒活性。（A）通过阻抗分析评估抗病毒药物筛选。除利巴韦林（20 µM）和布林西多福韦（1 µM）外，所有化合物均在50 µM浓度下进行测试，同时加入腺病毒5型，感染复数（MOI）为1。数据来自三个重复孔，以均值±标准差表示。该图改编自Zhang等人的研究13。（B）基于阻抗的单克隆抗体中和实验。图中显示了表现出无中和作用（完全细胞病变效应，红色）、部分中和作用（部分细胞病变效应，橙色）或强效中和作用（无可检测的细胞病变效应，黑色）的单克隆抗体的代表性细胞指数曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：利用阻抗法对抗病毒活性进行定量分析。（A）在感染复数（MOI）为1的5型腺病毒感染条件下，经不同浓度布林西多福韦处理后，实时归一化细胞指数的动态变化。（B）单独使用不同浓度布林西多福韦处理后，实时归一化细胞指数的动态变化。（C）将阻抗曲线下的面积作为布林西多福韦浓度的函数绘制，得到剂量-反应曲线。（A）和（C）改编自Zhang等人的研究13。（D）代表性rVSV–LASV IV谱系（Josiah株）中和曲线，包含单克隆抗体r37.2D、r25.1C、r12.1F以及作为阴性对照的rANDV-5。单克隆抗体37.2D、25.1C、12.1F和ANDV-5根据已有文献通过重组方式制备（见结果部分）。所示数据来自两次独立实验的代表性曲线，结果以三个重复孔的均值±标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

与所有基于细胞的检测方法一样，RTCA抗病毒筛选实验需要针对每种病毒-细胞系统进行优化。由于该实验通过阻抗变化来检测病毒诱导的细胞病变效应（CPE），因此依赖于能够支持病毒复制并产生可测量CPE的容许性细胞模型。那些不能产生可通过阻抗检测到的CPE的病毒可能不适用于此方法；在这种情况下，若存在病毒特异性抗体，可采用空斑减少中和试验（FRNT）等替代方法。另一个重要考虑因素是，细胞指数（Cell Index）的变化并不仅仅由病毒诱导的细胞裂解引起。细胞形态、黏附性、增殖和贴附状态的改变同样会影响阻抗信号，从而可能干扰对抗病毒活性的评估。因此，应在预实验或通过相应的仅含抗病毒药物的对照组中评估抗病毒药物对细胞指数的影响。在本研究中，为了最大化每块板上可检测的药物数量，我们在正式筛选实验之前预先测试了仅含抗病毒药物的对照组，以确定各候选药物在无病毒感染情况下的基线效应。实验性能还受到细胞接种密度、病毒感染时间以及培养基条件等因素的影响，这些因素可能影响细胞生长、病毒复制、CPE的发展以及实验的可重复性7,10,16。因此，系统性的优化对于实现稳健且可靠的基于RTCA的抗病毒筛选至关重要。

在确定最佳检测条件后，成功实施基于阻抗的实时抗病毒检测需要稳定的细胞接种、健康的细胞状态以及稳定的检测条件。孔间变异度过高通常是由于细胞分布不均或移液不准确所致；因此，在接种前应充分混匀细胞悬液，接种后将培养板在室温下静置30分钟，以促进细胞均匀沉降并减少边缘效应。建议每种处理至少设置三个重复，同时强烈推荐为阴性对照（未感染）和阳性对照（仅病毒）设置额外的重复，因为这些数值将作为所有处理条件下%CPE和%中和率计算的参考基准。如果病毒诱导的细胞病变效应（CPE）较弱或不一致，应验证病毒储备液的质量以及易感细胞系的健康状态。为保持病毒的感染活性，应避免反复冻融，建议为每次实验制备单次使用的病毒分装液。最后，强烈建议使用传代次数一致的易感细胞库，以最大限度减少实验变异并提高检测的可重复性。如果在感染前立即测得的细胞指数（通常约为接种后24小时）低于该易感细胞系的既定基准值，表明细胞健康状况或生长状态不理想，则应终止实验。在此情况下，应重新复苏一支冻存细胞，并重复抗病毒筛选检测。

当抗病毒筛选实验在严格控制且经过优化的条件下进行时（如此处展示的筛选数据所示），基于阻抗的检测方法能够准确量化抗病毒药物对细胞病变效应（CPE）的实时抑制作用。与依赖费力的终点检测的传统方法相比，连续且非侵入性的阻抗读数可实现对病毒诱导的全范围细胞损伤以及抗病毒反应动力学特征的长期动态监测。这种实时检测能力有助于识别最佳的时间窗口，不仅可检测早期起效的抗病毒作用，还可发现常规终点检测方法可能遗漏的延迟性抗病毒效应。

此外，本文所述的RTCA方案与传统方法相比，为抗病毒筛选提供了更快且显著简化的操作流程。该检测仅需初始的细胞接种步骤，随后在有或无抗病毒试剂的条件下加入病毒，无需额外的操作或检测后处理。实验设置和数据分析还受益于系统定制的病毒学软件模块，该模块可自动计算病毒中和试验（VRNT）中常用的参数，包括细胞病变效应百分比（%CPE）、中和率（%neutralization），以及达到用户预设中和水平所需的抗病毒试剂的最高稀释倍数或最低浓度。综合这些优势，相较于传统方法，能够更快速地并行筛选更多实验条件（如药物比较、系列稀释等）。

尽管此处所述的检测方法是在96孔板中建立的，但在采用上述适当检测条件的情况下，也可将其调整用于384孔板。为了支持这种高通量的基于阻抗的检测，可使用自动化的基于阻抗的RTCA系统，该系统可同时处理多达四块384孔板。

除了抗病毒筛选外，该RTCA方法还可应用于联合治疗研究、血清学检测以及病毒免疫逃逸机制的研究。通过检测治疗性抗体或免疫血清阻止病毒诱导的细胞病变效应（CPE）的能力，该检测方法可在无需标记的情况下实时评估中和活性以及感染或疫苗接种后的保护性免疫反应。此外，比较不同病毒变异株的中和特征可揭示与免疫逃逸相关的敏感性变化。当结合基因组测序时，该方法有助于识别抗体耐药性变异株，并推动下一代疫苗、抗体治疗药物及抗病毒策略的研发。

披露

J.E.C. 曾为 Moderna 和 Merck 提供咨询服务，是 IDBiologics 的创始人，并从 UpToDate 获得版税收入。在本研究进行期间，J.E.C. 的实验室收到了 IDBiologics 提供的无关的赞助研究协议经费。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，项目编号为 U19 AI181979 和 U19AI181930。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺病毒-GFPVector Biolabs 1060
布林西多福韦（CMX001）AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024消毒剂 
西多福韦Selleck S1516
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）ATCC30-2002
E-Plate 96Agilent5232368001集成微电极的96孔板
胎牛血清Avantor97068-085
更昔洛韦钠 Selleck S5065
HEK293A 细胞Thermo Fisher Scientific  R70507
多通道 ViafloINTEGRAVIAFLO 96
青霉素-链霉素溶液Gibco10378016
磷酸盐缓冲液（1x）HyCloneSH30256.01
重组单克隆抗体Crowe LabN/A
利巴韦林Selleck S2504
rVSV-LASV（Lin IV）Crowe LabN/A
司他夫定 Selleck S1398
0.25% 胰蛋白酶 0.53 mM EDTA  (1x )ATCC30-2101
12通道试剂储液槽VistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
病毒学模块AgilentS2807-90089
xCELLigence RTCA MP 系统Agilent380601040

参考文献

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