小鼠模型 白色念珠菌 和 无乳链球菌 阴道共定植

摘要

本方案详细描述了一种通过阴道途径使小鼠同时定植白色念珠菌（Candida albicans）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的方法。该方法可用于研究多微生物间的相互作用、宿主与微生物之间的相互作用，以及宿主对这些微生物的反应。

摘要

从人类阴道道中可分离出多种微生物，定植于这一微环境中的许多生物体能够在共生和致病生活方式之间转换。包括群落组成和宿主环境在内的多种因素会影响疾病的发生结果；然而，决定这些结果的机制尚不明确。在本文中，我们描述了一种小鼠模型，用于研究跨物种相互作用以及宿主对 白色念珠菌 和 无乳链球菌 （B组 链球菌，GBS），定植于女性生殖道（FGT）的机会致病菌。新兴证据表明 白色念珠菌 定植是GBS携带的风险因素，因其常被共同分离出。妊娠期间，GBS定植可能导致不良结局 包括绒毛膜羊膜炎和死产。GBS 还可传播给胎儿 在子宫内 或在分娩过程中感染新生儿，是新生儿脑膜炎的主要病因。阴道定植是GBS致病的关键前提，该微环境施加了多种选择性压力，其中某些压力可能受到 C. albicans 定植。本方案描述了一种并发模型 白色念珠菌-使用抗生素治疗和单剂量17进行GBS阴道共定植β-雌二醇以建立 C. albicans 定植后，移除抗生素并接种GBS。通过灌洗定量实验过程中阴道腔内的微生物负荷，通过解剖、匀浆及对阴道、宫颈和子宫进行平板培养，定量整个女性生殖道（FGT）的微生物负荷。该方法将有助于研究直接和间接的多微生物相互作用影响这两种生物的生活方式和致病机制的机理，以及女性生殖道内宿主免疫微环境的变化。

引言

无乳链球菌 （B组 链球菌，B族链球菌（GBS）是一种革兰氏阳性细菌性致病共生菌，可定植于多个多微生物共存部位，包括胃肠道和阴道。尽管阴道定植通常无症状，但在妊娠期间，GBS可从阴道上行至子宫，并穿透完整的胎膜，导致羊水和胎盘感染。因此，GBS是不良妊娠结局、胎儿感染及新生儿疾病的主要危险因素^1,2新生儿侵入性感染的主要病因之一，明确影响传播和感染风险的因素至关重要。产时抗生素预防可降低B族链球菌的垂直传播及新生儿早发型疾病的发生。^3,4；然而，这与抗生素耐药率的上升以及产前或生命早期使用抗生素可能带来的长期影响相关^5,6,7,8这些因素 necessitate 更有针对性的预防和治疗干预措施的开发。

越来越多的证据表明，微生物组的组成及多微生物间的相互作用会影响机体稳态及疾病发生的风险⁹. 人类阴道微生物组中GBS的主导地位与以下情况相关：减少 乳酸杆菌 丰度，以及物种和菌株特异性的相互作用已被观察到 对定植可能产生多种影响 体外 和 体内^10,11此前，我们的研究团队已建立了一种用于研究宿主与细菌相关因素对GBS适应性影响的小鼠GBS阴道定植模型。¹²。这包括给予小鼠单剂量的17β-雌二醇，随后在次日进行阴道内GBS接种。该模型已被用于表征GBS表面蛋白、调控信号网络及毒素分泌在维持定植和侵入女性生殖道组织中的重要作用。此外，我们发现GBS与阴道道内其他细菌之间存在复杂的相互作用，包括 Akkermansia muciniphila 和 粪肠球菌^13,14,15，展示了GBS的生活方式和持续性如何受到邻近微生物存在的影响。

尽管现有模型已被用于研究细菌间的相互作用，但要研究其他微生物，还需进行额外的修改。真菌是阴道微生物组中研究尚不充分的一个组成部分，因此本文介绍的模型旨在开发一种工具，用于在体内研究真菌定植以及真菌与细菌之间的相互作用。in vivo。从人类阴道道中最常分离到的真菌是Candida albicans，其定植率可高达70%的个体¹⁶。C. albicans具有多形性，能够通过形态发生过程在出芽酵母和丝状形态之间转换。菌丝形成与特定的基因表达谱相关^17,18。最近有研究报道，其中一些菌丝特异性基因在多微生物共定植环境中可提供适应性优势^19,20,21。

多项研究已报道在人类阴道拭子中共同分离出C. albicans和GBS，我们研究团队最近发现，定植有C. albicans的个体其GBS携带率显著更高²²。我们建立了一种体内系统，用于研究共生真菌、细菌与宿主之间的三方相互作用。在传统小鼠中进行真菌研究通常需要使用抗生素处理，以克服细菌介导的定植抵抗并建立持续定植²³。为了在不干扰GBS定植能力的前提下实现这一目标，我们采用抗生素混合物处理小鼠，随后接种C. albicans，在真菌定植建立后撤除抗生素，从而允许GBS继而定植。该方案已优化至使C. albicans和GBS在阴道组织中的定植负荷和定植时间相近，从而能够在阴道道内发生直接相互作用。本实验方案描述了对小鼠进行抗生素预处理、给予17β-雌二醇、建立真菌与细菌共同定植，并采集灌洗液和组织样本以供后续分析的方法。

方案

本研究中的动物实验已获得科罗拉多大学安舒茨医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并依照方案 #00316 在该委员会监督下进行。在下述时间线中，第 0 天指接种 S. agalactiae 的当天。

1. 接种前给予抗生素。

1. 在小鼠饮用水中分别溶解氨苄青霉素、新霉素和庆大霉素，制成每种抗生素浓度均为 50 mg/mL 的浓缩溶液。使用 0.22 µm 滤膜对上述抗生素溶液进行除菌。
2. 按 1:100 的比例将抗生素溶液加入小鼠饮用水中，即每 99 g 水中加入 1 mL 抗生素溶液。
3. 7 天后，重复步骤 1.1 和 1.2，更换新的含抗生素饮水。
4. 在开始实验前至少维持抗生素处理 7–10 天，但抗生素总处理时间不得超过 14 天。

2. 同步小鼠动情周期（第 -3 天）。

1. 向一个无菌的50 mL锥形管中加入每只小鼠0.5 mg的17β-雌二醇，并额外加入少量以补偿悬浮液在管壁上的黏附。将锥形管盖紧，短暂涡旋以打散团块。
   注意：由于17β-雌二醇可能通过皮肤或黏膜接触进入体内，请小心操作该试剂，并使用适当的个人防护装备。
2. 使用0.45 µm滤器将每0.5 mg 17β-雌二醇对应100 µL的芝麻油直接过滤至含有17β-雌二醇的锥形管中。终浓度为5 mg/mL。盖紧管盖后充分涡旋，使溶液形成均匀的悬浮液。
3. 准备无菌的1 mL注射器（每只小鼠一支），将活塞拉至0.15 mL刻度处，并将注射器竖立放置，使活塞朝下，鲁尔锁接头朝上。
4. 用一支新的无菌10 mL注射器配无菌18G 1.5”针头吸取17β-雌二醇悬浮液，然后将该悬浮液注入已准备好的1 mL注射器中，每支加入100 µL。
5. 用无菌26G 0.5”针头盖紧每支1 mL注射器。
6. 制备含0.5 mg 17β-雌二醇的100 µL芝麻油悬浮液，并在接种C. albicans前一天，通过腹腔注射方式向每只小鼠注射一剂。

3. 用 C. albicans 感染小鼠（第 -2 天）。

1. 接种前一天（与给予17β-雌二醇同一天），在30 °C、250 rpm振荡培养箱中，用5 mL酵母胨葡萄糖肉汤培养基培养过夜的白色念珠菌（C. albicans）培养物。
2. 接种当天，取过夜培养物等分试样转移至无菌微量离心管中，以≤10,000 × g 离心7–8秒，或直至形成沉淀。
3. 吸除上清液，并将沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
4. 使用血细胞计数板计算悬液的浓度。
5. 取部分悬液转移至新的无菌微量离心管中，再次离心形成沉淀，并用新鲜无菌PBS重悬，使最终浓度达到每毫升10⁹ 个 C. albicans 细胞，总体积至少为每只小鼠10 µL。例如，若浓度为2 × 10⁸ 个细胞/mL且共有10只小鼠，则离心500 µL并重悬于100 µL中。
6. 每只小鼠阴道接种10 µL含10⁹ 个细胞/mL（即每只小鼠10⁷ 个细胞）的PBS悬浮液中的 C. albicans。
   1. 用非优势手的拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤以固定小鼠，然后旋转手腕使小鼠背部贴合手掌，用无名指和小指固定尾巴。
   2. 用无菌移液器吸头吸取10 µL C. albicans 悬液，将吸头插入阴道腔约5–10 mm，根据小鼠解剖结构调整插入深度。
   3. 将 C. albicans 接种物排入阴道后撤出移液器吸头。
   4. 松开颈背部皮肤后，抓住小鼠尾巴使其后肢抬高，让小鼠以前肢行走约1分钟，或直至 C. albicans 接种物不可见为止。

4. 更换饮用水（第 -1 天）。

1. 在接种 C. albicans 后一天（即接种 S. agalactiae 的前一天），将小鼠转移至清洁的笼具中。
2. 确保小鼠饮用不含抗生素的新鲜水。

5. 定量阴道腔内的 C. albicans 负荷量（第 -1 天）。

1. 在第 -1 天，为每只小鼠准备一个无菌微量离心管和 100 µL 无菌 PBS。
2. 按照步骤 3.6.1 所述方法固定每只小鼠。
3. 用无菌移液器吸头吸取 50 µL PBS，将吸头插入阴道腔内约 1–5 mm 深度，上下吹打 3–5 次。然后将 PBS 排入无菌微量离心管中。
4. 重复步骤 5.3，共获得 100 µL 灌洗液。
5. 将微量离心管涡旋混匀，然后在无菌 PBS 中进行 10 倍系列稀释，直至 1:10,000 稀释度。
6. 取 10 µL 稀释后的悬液和 25 µL 未稀释的灌洗液，分别接种于 Candida 选择性显色琼脂平板上。
7. 将平板在 30 °C 下培养 48 小时。C. albicans 菌落呈光滑表面，颜色为青绿色或绿色。

6. 用无乳链球菌（S. agalactiae）感染小鼠（第0天）。

1. 接种前一天（即更换饮水的同一天），培养3 mL过夜培养物 S. agalactiae 在静置的37℃ Todd Hewitt肉汤（THB）中 °C 培养箱
2. 接种当天，将过夜培养物用4 mL THB培养基按1:10比例稀释，于37℃静置培养 °C 培养箱中培养至对数生长中期（600 nm 处的光密度 [OD₆₀₀约1.5–2小时内达到0.4–0.5的]值。
3. 将对数中期培养物转移至无菌的15 mL锥形管中，在3,000 ×g下离心 × g 5 分钟或直至形成沉淀。
4. 吸除上清液，然后将沉淀重悬于 300 µ无菌 PBS 溶液 L
5. 用重悬的沉淀物制备至少100 µL of S. agalactiae 每只小鼠的悬浮液，另加500 µL，在无菌 PBS 中，OD₆₀₀ 0.4（约10）⁸ 菌落形成单位 [CFU]/mL；10 只小鼠总量不少于 1.5 mL。
   注意：某些 S. agalactiae 菌株间的OD可能存在差异₆₀₀-与CFU/mL的比值。确定哪个OD₆₀₀ 对应于10⁸ CFU/mL 提前准备。
6. 将悬液转移至一个新的无菌15 mL离心管中，在3,000 × g下离心 × g 5 分钟或直至形成沉淀。
7. 吸弃上清液，并将沉淀重悬于1/10体积的溶液中^th 初始体积的无菌PBS（如果沉淀了1.5 mL悬浮液，则重悬于150） µL）。此悬浮液的浓度将为10⁹ CFU/mL，作为细菌接种物。
8. 连续稀释并涂布50 µ在托德-休伊特琼脂（Todd Hewitt Agar）上接种适量菌液，然后将平板置于37℃培养 °在37°C下培养24小时，以确定确切的接种浓度。
9. 每只小鼠阴道内接种10 µL的 S. agalactiae 悬浮于 PBS 中，浓度为 10⁹ CFU/mL (10⁷ CFU/小鼠），方法同步骤 3.6.1–3.6.4。

7. 定量阴道腔内白色念珠菌（C. albicans）和无乳链球菌（S. agalactiae）的载量（从第+1天开始）。

1. 自 S. agalactiae 接种后一天开始，收集 100 µL 阴道灌洗液，并使用与步骤 5.1–5.5 相同的技术对其进行连续稀释。
2. 取稀释后的悬液各 10 µL 以及未稀释的灌洗液各 25 µL，分别接种于 Candida 选择性显色琼脂平板和 StrepB 选择性显色琼脂平板，每个样本设两个重复。
3. 将 Candida 平板在 30 °C 下培养 48 小时。C. albicans 菌落呈光滑表面，颜色为青绿色或绿色。
4. 将 StrepB 平板在 37 °C 下培养 24 小时。S. agalactiae 菌落呈光滑表面，颜色为粉红色或紫红色。
5. 每日或按适当的时间间隔重复步骤 7.1–7.4，以监测阴道腔内的微生物负荷。

8. 定量分析雌性生殖道组织中白色念珠菌（C. albicans）和无乳链球菌（S. agalactiae）的定植负荷（实验终点）。

1. 准备三个 2 mL 带螺帽的离心管，每管中加入约 0.4–0.5 g 的 1 mm 氧化锆珠和 500 µL 无菌 PBS，用于收集组织（阴道、宫颈和子宫）。另为每只小鼠准备一个无菌微量离心管和 100 µL 无菌 PBS，用于收集灌洗液。记录每个带螺帽离心管的重量，作为后续计算组织重量的参考值。
2. 采用机构批准的方法（如 CO₂ 窒息法联合颈椎脱位）处死小鼠。使用 70% 乙醇对剪刀和镊子进行灭菌。
3. 用手抓住小鼠尾巴将其后肢抬起，按照步骤 5.3–5.4 中所述技术收集阴道灌洗液。
4. 用 70% 乙醇喷洒小鼠腹部，使用灭菌剪刀切开腹腔。用镊子提起皮肤并向后拉开，移开肠道以暴露生殖道组织。
5. 使用灭菌剪刀去除膀胱以及遮挡子宫的内脏脂肪和膜状组织。在子宫体与每侧卵巢之间剪断，将子宫角与卵巢分离。
6. 用灭菌镊子夹住宫颈下方的阴道组织，向上提起直至整个阴道组织可见，使用灭菌剪刀尽可能靠近外阴处做横向剪切，避免剪到皮肤组织。取出整个生殖道组织并置于无菌的 10 cm 培养皿中。
7. 使用无菌剃须刀片在宫颈上下方分别做横向切割，分离阴道、宫颈和子宫。通过额外进行 2–5 次矢状面和横向切割，将各组织切碎。将每种组织分别放入预先准备好的对应螺帽管中。
8. 称量每个螺帽管的重量，通过减去步骤 8.1 中记录的初始重量来计算各组织的净重。盖紧管盖后，在 3,450 rpm 条件下振荡研磨 1 分钟，将管子置于冰上 1 分钟，再以 3,450 rpm 振荡研磨 1 分钟。
9. 按照步骤 5.5–5.6 所述方法，对每种组织匀浆液和灌洗样本进行系列稀释并涂布平板。按照步骤 7.3–7.4 所述条件孵育平板。

结果

为表征 B 族链球菌（GBS）和C. albicans的阴道定植情况，将小鼠经阴道接种C. albicans菌株 SC5314 或 PBS 缓冲液对照，随后接种 GBS 菌株 COH1。该菌株属于高毒力荚膜 III 型、序列型 17 的分离株，最常与新生儿侵袭性疾病和脑膜炎相关¹。接种后一天未成功定植 GBS 的小鼠被排除在分析之外。在为期四天的实验过程中，单独定植 GBS 的小鼠会逐渐清除阴道腔内的 GBS。而大多数与C. albicans共定植的小鼠则持续维持较高的 GBS 负荷（图 1A、B）。C. albicans亦可在小鼠阴道腔内定植约四天，随后被清除（图 1C）。此前利用该模型的研究表明，与单独定植小鼠相比，共定植小鼠的女性生殖道组织（包括阴道、宫颈和子宫）中 GBS 负荷也更高²²。

讨论

GBS 阴道定植对母婴及新生儿健康构成严重威胁。In vivo 模型对于理解定植的决定因素以及开发预防性治疗手段至关重要。在本论文中，我们描述了一种小鼠模型，用于在阴道内共同定植 GBS 和 C. albicans，评估阴道腔及女性生殖道（FGT）中的微生物负荷，并采集相关组织以进行后续分析。该模型的建立旨在研究多微生物阴道定植背景下真菌-细菌以及宿主-微生物之间的相互作用。我们研究团队已利用该模型阐明了 C. albicans 促进 GBS 阴道定植及上行感染的机制²²。

动物模型已成功用于研究宿主与微生物之间的相互作用；然而，将多微生物群落引入这些模型可能会带来若干独特的挑战。本模型开发的主要目标是建立真菌定植，给予足够时间使C. albicans形成菌丝，并接种GBS以监测在任一微生物被宿主清除之前的定植动态。作为一种多形性真菌，C. albicans可响应多种与宿主相关的环境信号，启动菌丝形态发生^17<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 滤膜	Sigma-Aldrich	SLGSR33SB
0.45 µm 滤膜	Sigma-Aldrich	SLHAR33SB
1 mL 鲁尔锁式注射器	McKesson	16-S1C
1.0 mm 氧化锆珠	Research Products International	9835
10 mL 鲁尔锁式注射器	McKesson	16-S10C
17β-雌二醇	Sigma-Aldrich	E8875	警告：17β-雌二醇可通过皮肤和黏膜吸收。使用时请穿戴适当的个人防护装备（PPE），并谨慎操作。
18G 1.5" 针头	BD	305196
2 mL 螺口管	Fisher Scientific	02-681-374
26G 0.5" 针头	McKesson	16-N2605
琼脂	Alpha Biosciences	A01-102
氨苄青霉素	Research Products International	A40040
CHROMagar 白色念珠菌培养基	CHROMagar	CA222
CHROMagar B族链球菌培养基	CHROMagar	SB282
庆大霉素	VWR Life Science	0304
新霉素	Research Products International	N20040
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP2944
芝麻油	Sigma-Aldrich	S3547
Todd Hewitt 液体培养基	Research Products International	T47500
酵母胨葡萄糖液体培养基	BD	242810