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方法文章

用于区分小鼠短期与长期关系的社会识别范式

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DOI：

10.3791/72558

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2026年8月25日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Florida

本文内容

摘要

本文概述了一种利用四杯行为实验范式来测量新建立的短期关系和长期关系之间社会识别能力的完整实验流程。 我们阐述了该实验范式的优点和潜在应用，并提供了准确解读实验结果所需的重要信息。       

摘要

社会记忆是指记住和识别他人 同种个体。这是哺乳动物行为的一个基本方面，在社会性较强的哺乳动物（如小鼠和人类）中已证明具有生存优势。 啮齿类动物，尤其是小鼠，是研究社会记忆及其潜在机制的成熟动物模型。 大多数现有的 社会记忆 范式主要评估短期社会识别能力，其中关系持续时间和熟悉程度 受试者与施动者之间 为5–15分钟。因此，现有的范式 以及以往的研究 不捕捉长期关系中的社交记忆，而是关注新奇性与短期熟悉性之间的二分法， 留下一个 我们在社会记忆的机制理解方面仍存在巨大空白。为填补这一空白，我们设计了一种简单的行为检测方法，用以捕捉小鼠对不同程度熟悉性的反应，将复杂的社会记忆提取过程置于可观察和可量化的实验框架中。在四杯实验范式中，一只受试小鼠 自由探索 一个 竞技场 含有 四个带孔的杯子分别置于四个角落，这些杯子容纳三个 试剂 不同熟悉程度的小鼠（社会刺激）：长期熟悉的同笼小鼠（共同饲养1个月）、短期熟悉的小鼠（先前接触10分钟）、陌生同种小鼠，以及作为空白对照的空杯子。CD-1雄性小鼠表现出更倾向于探究陌生小鼠和长期熟悉的同笼小鼠 在此范式中，相较于短期熟悉的实验小鼠，更侧重于研究长期熟悉的实验小鼠。该任务 演示 熟悉度识别水平的提升，同时减少攻击性行为，但仍 控制 暴露史。该新型检测方法提供了一个可直接比较的平台 社会行为的神经机制 长期、短期和新奇记忆 个体。四杯范式作为一种新颖的方法 测量 用于 长期熟悉性识别，以补充现有的短期识别检测方法。 

引言

社会记忆是哺乳动物社会行为的核心特征，在小鼠和人类等高度社会化的物种中尤为发达。在啮齿类动物中， 对他人的识别 构成家庭及同种群体内生存所依赖的关键行为动态，包括群体凝聚力、优势等级、交配行为和亲代抚育1,2. 除了在动物生存中具有进化上的优势作用外，人类社交记忆的受损是多种神经精神疾病和神经系统疾病中普遍存在的标志性特征，包括自闭症谱系障碍、精神分裂症和阿尔茨海默病3,4,5,6由于社会识别对社会性物种的日常功能至关重要，且具有明确的临床意义，因此开发能够准确反映其多维度特征及神经基础的行为检测方法至关重要。尽管现有的实验范式可测量小鼠社会识别的某些方面，但大多数检测方法旨在 通过比较新奇关系与短期关系来评估新奇偏好 在数分钟或数小时内形成，而非定量分析 识别 长期社会关系   

现有的方法，例如三室实验范式或习惯化-去习惯化范式，仅在短暂的先前暴露后评估新奇偏好，暴露时间通常限于5–15分钟7,8,9,10,11这些方法 已提供 对……有深入的了解 神经机制 的 这些 短期社交 小鼠的记忆12,13. 然而， 自然主义的社会记忆与社会功能必须纳入长期关系中发挥作用的独特机制， 通过共同生活建立，长期 社会等级或交配伙伴。 尽管一些研究确实采用三室范式并使用同窝幼鼠14 或与受试小鼠同笼饲养长达72小时的熟悉小鼠15,16，该范式的主要应用仍局限于简单的“新异与熟悉”二分法。这限制了在多个不同熟悉小鼠之间进行比较的可能性。现有的社会识别范式倾向于 研究 短期关系方面，我们对长期关系社会识别背后的神经机制仍存在明确的知识空白。   

为了解决这一局限性， 我们开发了四杯范式：一种简单且灵活的检测方法 用于区分 识别 在单次测试过程中评估多个社交熟悉程度。在此范式中，实验小鼠探索开放旷场的四个角落， 每个 含有 a 穿孔的 杯 持握 a 同种的 或一个对照用的空杯。 杯中包含长期熟悉的同种个体（笼伴）、一个 短期熟悉 同种的 先前接触有限 （10 分钟），a 新颖的 小鼠，和一个 空 对照。探究时间可作为社会识别和社会偏好的定量指标。该设置可在最小化直接身体接触和潜在攻击性互动的同时，实现不同熟悉程度水平的同步比较。 

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方案

所有涉及动物的操作均须执行 根据 机构指南，并经佛罗里达大学机构 动物护理与使用委员会（IACUC） 

1. 动物准备与饲养  

  1. 使用成年个体 同性 群养小鼠 所有实验。  实验测试前至少 handling 小鼠 2 天，以使其适应操作并降低焦虑。
  2. 将小鼠饲养在 在反向光暗循环条件下，使用标准实验室笼具饲养，食物和水随意供应。 
    注意：代表性实验使用了3–4月龄的成年CD-1和C57BL/6小鼠。小鼠以每笼3–4只进行群养。代表性数据集包括10只雄性CD-1小鼠、12只雌性CD-1小鼠和31只雄性C57BL/6小鼠。行为学实验应在动物的活跃期（暗期）进行。本研究中的小鼠在上午9点至下午6点之间进行实验，并维持在反转的光暗循环条件下（暗期为上午8点至晚上8点）。
  3. 将长期熟悉的个体定义为 同品系同性别同笼饲养个体 与实验小鼠在同一笼中共同饲养至少 测试前3–4周。 
  4. 选择短期熟悉的和新异的同种个体 试剂 与实验小鼠相同品系和性别的小鼠 
  5. 确保新引入的小鼠之前未与目标小鼠发生任何身体或嗅觉接触。 
  6. 从不同的家庭笼中选择一种新异个体和一种短期熟悉个体，以避免这两个个体之间产生相似的嗅觉线索。
    注意： 记录所用所有动物的近似年龄，并尽量避免在同一天内多次重复使用相同的新型短效试剂。若需重复使用这些试剂，请提供 >两次测试之间在饲养笼中休息 2 小时，以避免应激因素。

2. 实验区域设置 

  1. 放置一个 洁净 方形开放场区域（49.5 cm × 49.5 cm × 49.5 cm； 材料清单在安静的行为测试室内。
  2. 使用一盏较高的或顶置的灯照亮该区域，并调节至 约 8–20 勒克斯。  
  3. 在实验区域的每个角落放置四个重量相同的带孔塑料杯（图1A).
    1. 尽可能使用外观相同的杯子。若使用不同颜色的杯子，应在各次试验中对杯子的分配和位置进行平衡。
    2. 按压每个杯子的两侧 冲洗 紧贴竞技场壁以限制活动范围，减少躲藏行为，并标准化探究角度。 
    3. 使用足够重且足够高的杯子，以防止逃逸和攀爬。
      注意：在本研究中，通过在被试间顺时针旋转彩色塑料杯的位置，同时逆时针轮换施动者类型，对代表性数据杯和施动者位置进行伪随机化。
  4. 放置 相机 足够高，以至于 整个检测 盒子应置于画面内，以避免行为编码时出现盲区。保持盒底光照均匀，尽量减少反光。图1A).
  5. 在每次试验之间，使用彻底清洁竞技场地板和杯子 一种合适的消毒剂， 随后用清水冲洗以去除残留气味。 
  6. 在重新引入之前，让实验区域完全干燥 动物 

3. 第0天在实验区域进行适应性训练

  1. 将实验小鼠及其同笼伙伴放入含有四个带孔空杯的实验区域，允许其自由探索20分钟。
    注意：对于需要固定记录的实验，应单独对小鼠进行适应性训练。根据需要可增加适应次数。若小鼠在一天适应后仍未充分探索整个实验区域，建议进行多天适应。
  2. 将所有小鼠从实验区域中移出，并放回原笼。
  3. 将所有社交刺激小鼠分别置于杯下10分钟，使其适应受限状态。来自同一笼子的刺激小鼠可同时进行适应，每杯放置一只（图1B）。
  4. 在引入新笼小鼠前，清洁实验区域和杯子。
    注意：小鼠转运至实验房间后，应在开始实验前至少静置15分钟。

4. 基线 

  1. 根据第2节设置实验区域 。在所有实验日中保持相同的实验区域配置。 
  2. 将受试对象放入含有  四个空杯子的实验区域中，允许其自由探索10分钟。
    注意： 在当前试验的所有阶段， recording 不得暂停，应持续进行记录。    

5. 短期获取 

  1. 使用带配重的穿孔杯固定受试对象，同时放置指定 "短期熟悉" 试剂 或者，将受试对象置于洁净的笼子中，暴露于短期作用的试剂。
  2. 若选择进行场所暴露实验，需将指定的短期熟悉的 试剂 在实验区域的一个带孔杯下方放置，其余三个杯保持空置 空。 
  3. 释放 受试者 和 允许自由探索 10 分钟（图1B).
    注意：若采用在实验区域内暴露于短期作用因子的方法，应在不同受试对象间交替使用短期熟悉因子所在的角落，以避免空间偏差。 

6. 试验间间隔（ITI） 

  1. 取出 短期熟悉 试剂 并将其放回其居住笼中。让实验小鼠独自停留在实验区域内 自由活动10分钟。 
  2. 收集 新颖的 长期熟悉 用于测试的实验小鼠 相  
    注意：将短期熟悉剂放回短期获取阶段（第5节）中使用的同一杯子中。如果在实验 arena 中进行短期获取，建议这样做以避免空间位置的新异性。

7. 社会识别阶段 

  1. 在实验小鼠身上放置一个额外的带孔加重杯。
  2. 将一只小鼠分别置于三个带重物的穿孔杯下方： 长期熟悉的同笼伙伴、短期熟悉的个体以及陌生的同种个体 留出一个指定的第四只杯子作为空白对照。  
    注意：在进行行为学评分时，标记杯盖以识别试剂位置。
  3. 从实验小鼠身上取下穿孔杯 在 arena 中央放置并允许自由探索 10 分钟（图1A).
  4. 在实验结束时移除所有小鼠 10 min 间隔并停止记录。
  5. 将所有小鼠放回其原代饲养笼中。 
  6. 在下一次试验前，彻底清洁实验区域和杯子。  
    注意：请准备备用杯，以防损坏。

8. 行为学评分

  1. 将所有录制的视频导入能够进行人工注释的行为分析软件中，例如行为观察研究交互式软件（Behavioral Observation Research Interactive Software, BORIS）。
    注意：由于每个杯子上方贴有标注实验动物编号的标签且在视频中可见，笼位信息也可被推断，因此行为评分无法对笼伴位置设盲。评分人员并未主动关注这些可见标签，且对新个体和短期同伴的身份信息设盲。所有评分人员均遵循预先定义的探究行为操作定义和标准化评分标准。
  2. 在开始评分前确定行为矩阵。
  3. 将一次探究行为定义为：实验小鼠将鼻尖置于距离杯子 1 cm 范围内，同时 表现出 持续的探究姿态。 
    注意： 将针对杯子的咀嚼和啃咬行为纳入探究行为事件中。
  4. 在10分钟的社会识别测试阶段，人工标注每只杯子对应的总探究持续时间。 可根据需要对基线期和学习获得阶段进行评分。
    注意：可使用自动化姿态追踪技术，以每个杯子周围1 cm的半圆形区域作为兴趣区。
  5. 导出已标注的数据，用于 后续 统计分析。

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结果

根据四杯实验范式方案，CD-1雄性小鼠在长期熟悉的同笼伙伴、短期熟悉以及陌生同种个体之间表现出差异性的社交探究行为（图2）。针对每个社交对象，计算其辨别指数（DI），该指数基于小鼠探究该对象的时间与探究空杯时间的比值，公式为（对象时间 − 空杯时间）/（对象时间 + 空杯时间），计算时段为10分钟的社交识别阶段。Shapiro-Wilk检验显示该指数呈正态分布；因此，我们采用基于数据正态性假设的统计检验方法。小鼠对陌生同种个体的辨别显著高于对短期熟悉同种个体的辨别（图2；陌生 vs. 短期熟悉，t(9) = 3.70，经Bonferroni-Holm校正后 p = 0.01）。该实验范式还显示，小鼠对长期熟悉的同笼伙伴的辨别显著高于对短期熟悉同种个体的辨别（图2；同笼伙伴 vs. 短期熟悉，t(9) = 2.87，经Bonferroni-Holm校正后 p = 0.04）。在对陌生同种个体...

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讨论

将四杯实验范式应用于其他实验室环境以有效且可靠地测量这些社会动态时，需考虑若干关键因素。第0天的适应性训练可减少由非社会性新奇刺激引发的对实验区域和杯子的探索行为，否则这种探索可能掩盖测试期间的社会性探究7,8,9。短期熟悉时间的精确控制同样至关重要，因为暴露时间的微小差异可能显著改变后续的偏好模式8,9,10。选择10分钟的熟悉期旨在建立稳定的短期社会记忆，同时与先前描述的社会识别范式保持一致，这些范式采用短暂暴露以区分熟悉与陌生的同种个体7,8,10。此外，选择3至4周的共同饲养...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了 McKnight 神经科学奖和 Klingenstein 神经科学奖对 NPC 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
行为评分软件行为观察研究交互式软件Version 9.12.7用于手动事件标注的软件
旷场实验箱Rafferty Machine and ToolCustom made结构型FRP玻璃钢板材，方形实验箱（49.5 cm x 49.5 cm x 49.5 cm）；非透明壁，若实验箱透明，需用纸张覆盖外壁以减少对动物的干扰 
顶部摄像机LogitechLogitech C920x HD Pro PC Webcam可连续视频录制的摄像机；安装于实验箱正上方
带孔杯Chinco Store ONG-Chinco-0279杯体尺寸：4.01"L x 4.01"W x 4.52"H；带孔的塑料或金属杯，可为方形或圆柱形
PrismGraph PadVersion 10.6.0数据分析软件；也可使用其他软件完成

参考文献

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