优化酵母表面显示工作流程，用于蛋白酶定向进化

摘要

该方案为酿 酒 酵母病毒蛋白酶的定向进化提供了优化工作流程，采用基于表面显示的选择系统。报告概述了DNA插入文库和底物盒的设计、优化以实现高转化效率的电穿孔、基于荧光激活的细胞分选以实现蛋白酶切割，以及富集变异的测序。

摘要

定向进化模拟了在快速、受控的实验室环境中自然的进化过程，进化出具有理想功能或性状的蛋白质。筛选大量突变蛋白编码基因，使得功能性地选择目标变异，应用于生物技术、医学和合成生物学。利用该方案，我们在 酿酒 酵母中进行定向进化，工程化具有非原生底物序列高特异性的蛋白酶变异。我们将这些蛋白酶变体展示在酵母细胞表面，以便通过荧光激活细胞分选（FACS）在多轮富集中筛选出所需变体。底物盒的四个关键元素与蛋白酶文库共表达：融合蛋白，由（i）酵母粘附受体亚基Aga2、（ii）选择性和（iii）反选择底物序列、（iv）表位标签序列，以及可选的内质网（ER）提取信号序列组成。仅切割选择底物序列的酵母细胞，通过多色FACS（荧光（荧基红素/荧光素异硫氰酸标记）抗表位抗体分离。本文详细介绍了进行蛋白酶进化活动的优化分步骤方案，包括DNA插入图库设计和底物盒设计、高转化效率的酵母细胞电穿孔（每微克DNA可达10⁹ 个转化体）、基于FACS的选择、富集及进化变异的测序。我们通过将烟草刻蚀病毒核包裹物A蛋白酶（TEVp）从切割其天然底物序列ENLYFQ↓S演化为切割新序列ENLYFE↓S，展示了我们的定向进化方案。

引言

叶病毒科的半糖蛋白酶，特别是核内含物A（NIa）蛋白酶，是序列特异性内肽酶的尚未充分开发来源。NIa蛋白酶拥有3800多个被鉴定的家族成员，切割出独特的七氨基酸底物序列。钾病毒家族提供了多样化的蛋白酶，用于工程可编程蛋白控制系统、构建基于蛋白酶的正交遗传回路，以及开发序列特异性生物^{技术工具1,2}。尽管存在这种自然多样性，只有两种NIa蛋白酶——TEVp和烟草静脉斑驳病毒蛋白酶（TVMVp）——被彻底鉴定和工程化，适用于广泛的实验室和生物^{技术用途3,4}。该有限蛋白酶工具包限制了需要正交^{蛋白酶活性}的多组分回路的设计空间5，从而激励通过定向进化进一步扩展和表征NIa蛋白酶的努力 ^6,7。

酵母表面显示已成为定向进化最强大的平台之一，使得通过荧光激活细胞分选（FACS）^6,7实现高通量蛋白文库筛选成为可能。例如，酵母内质网隔离筛查（YESS）系统通过酿酒酵母^6,7的分泌途径将蛋白酶活性与表面显示耦合。YESS系统已被应用于设计新的蛋白酶-底物特异性，并已证明其在多轮定向进化战役中的实用性。在该系统中，蛋白酶变体与含有带有表位标记的切割底物盒的融合蛋白共表达，Aga1p表面锚点在EBY100酵母菌株中表达。使用荧光抗体的差别标记可区分切割底物盒与显示在细胞表面的未切割底物盒。这种依赖活动的显示机制与基于FACS的迭代选择直接兼容，适用于10个、⁷个或更多变^体的库6,7。

定向进化的基本前提是能够在足够规模上引入变异文库，以实现对目标序列空间的充分覆盖。对于跨越多个氨基酸位点的位点饱和诱变文库，转化产率需达到10⁸到10⁹个独特转化体，以确保引入文库的多样性在分选后种群中得到良好代表。引入酿酒酵母外源DNA的方法有多种，每种方法都有不同的通量上限。由于简单且易用，传统的化学转化方法使用醋酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇（LiAc/ssDNA/PEG）。然而，它通常每微克DNA仅实现10个⁴–¹⁰个6个菌落形成单位（CFU）的转化效率，未能达到大型文库活动所需的序列变^异8。相比之下，电穿孔法通过高压电场暂时渗透细胞膜，促进DNA的吸收。电穿孔在现有转化方法中始终实现最高的转化效率，优化方案报告产率为10⁸–10⁹ CFU⁹。研究发现，酿酒酵母的电穿孔效率对细胞生长阶段、DNA质量和缓冲液组成极为敏感，这一框架现已被广泛应用于文库级定向进^化9。

本文描述的方案使用酿 酒 酵母菌株EBY100，这是一种广泛采用的酵母表面展示宿主菌株。EBY100由Boder和Wittrup通过将半乳糖诱导的GAL1启动子控制的AGA1表达盒整合到蛋白酶缺乏母株BJ5465¹⁰的染色体AGA1位点中工程。该品种可通过ATCC商业购买（目录号MYA-4941;沉积者K.D. Wittrup），携带基因型 MATa AGA1：：GAL1-AGA1：：URA3 ura3-52 trp1 leu2-δ1 his3-δ200 pep4：：HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL（URA+， leu−， trp−）。因此，Aga1p和Aga2p底物盒融合均由同一半乳糖诱导启动子表达，确保两个亚基共诱导并组装成二硫键连接的Aga1p–Aga2p复合物，将显示的融合锚定在细胞壁上。

尽管EBY100在酵母展示应用中被广泛应用，但尚无已发表的协议系统性优化以图书馆级电孔化该菌株。EBY100特有参数，如收获时的最佳生长阶段、亚培养基组成，以及初始光学密度600纳米（OD₆₀₀）与转化效率之间的定量关系，仍需严格表征和优化。本文报告指出，EBY100的转化效率随着培养物OD₆₀₀ 在收获时单调提升，晚对数阶段的细胞转化速率明显高于早期对数阶段的细胞。我们评估了关键的方案参数，包括接种时初始OD₆₀₀ 值、亚培养中使用2×酵母提取物蛋白葡萄糖（YPD）培养基、电穿孔缓冲液制剂及电穿孔后生长条件。此处展示的协议提供了优化的分步流程（图1A–C， 图2， 图3A–D， 图4A–E），用于制备具电能力的 EBY100 细胞并执行高效的DNA文库电穿孔，转化速率始终高于 10⁹ CFU。为验证该方案，我们进行了全面的定向进化活动，通过四轮基于FACS的选择和富集，工程化TEVp具有改变切割特异性的特征。对富集蛋白酶变异的测序确认了蛋白酶底物结合口袋中靶向残基的显著多样性，表明该方案提供了足够的序列空间文库覆盖，支持有效的进化活动。该方案对使用EBY100进行酵母表面显示定向进化及FACS兼容的高通量蛋白酶、抗体⁹、激酶¹¹和受体¹²等蛋白质筛查的研究人员具有广泛价值。

方案

所有涉及重组 酿酒 酵母的实验均按照德克萨斯大学达拉斯分校机构生物安全与化学安全委员会的政策和程序进行。重组酵母菌株按照既定的微生物学规范，在生物安全等级1（BSL-1）隔离下进行处理。电穿孔、培养和荧光激活细胞分选（FACS）均按照批准的机构生物安全程序进行。酵母培养物和受污染的消耗品被按照机构指南进行除污并作为生物危害废弃物处置。

1. 载体与插入件的制备

1. 通过位点饱和诱变生成poty病毒蛋白酶文库
   1. 使用序列设计软件，结合30至50个mer、正向和反向寡核苷酸，生成蛋白酶突变文库。将对应寡核苷酸中的野生型密码子替换为NNS退化密码子，其中N代表A、T、G或C，S代表G或C，用于诱变目标位置。
   2. 设计每对正向和反向寡核苷酸之间的3′重叠点，熔点（Tm）为55–60°C。 设计第一个和最后一个寡核苷酸，使其在限制性位点之外与酵母表面显示载体有50-n重叠。
   3. 确保插入片段的至少一端与线性化载量的一端完全重叠，以促进同源重组¹³。避免相邻寡核苷酸之间的空隙¹⁴.
   4. 用去离子的_H2O将寡核苷酸重新悬浮至100微米。在无菌的1.5毫升管中，将每个寡核苷酸的0.5微升与最终体积200微升（每个寡核的最终浓度为250 nM）。
   5. 利用 表1 中列出的组分设置PCR反应，利用 表2中的热循环条件组装蛋白酶文库。
   6. 以第一个组装好的PCR产物为模板，设置第二个PCR反应，使用最外层的正向和反向寡果（见表3）。如 表4所示，放大产物。
   7. 在240伏电下，将第二个PCR产物置于1%琼脂糖胶和溴化乙键（0.5 μg/mL）上，持续30分钟。切除与预期DNA长度对应的带状结构。
      注意：注意：溴化乙蓷是一种诱变剂，应使用适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、丁腈手套和安全眼镜。避免皮肤接触和吸入。根据机构安全指南，将含溴化乙键的凝胶、缓冲剂和消耗品作为有害化学废弃物处置。
   8. 用凝胶萃取套装进行纯化。在50微升去离子氢_2O中洗脱。
   9. 使用分光光度计测量DNA浓度。DNA储存在−20°C。
      注意：^第二次PCR 每次50微升反应约产生0.5–1.0微克的DNA。由于每次电穿孔需要12微克蛋白酶文库（即插入物），因此应相应增加反应规模。
2. 基材盒装配
   1. 准备LB-琼脂平板和LB-氯霉素液体培养基。详见 表5中的食谱。
   2. 设计一组正反方向重叠的30聚寡核苷酸，用于底片盒组组装。将每个反向寡核苷酸的5′端和下一个片段的正向寡核苷酸设计为4个核苷酸。
   3. 使用去离子H₂O将冻干寡核苷酸重新浮至100微米。
   4. 按照 表6混合试剂。
   5. 使用表7 中的循环程序对寡核苷酸混合物进行退火和磷酸化。
   6. 稀释退火寡核在去离子H₂O中4倍，达到最终浓度1.25微米。
   7. 将退火寡果混合物与载体（例如pDD1523）结合，按照 表8进行。
   8. 按照 表9中的骑行计划进行金门组装。
      注：例如，pDD1523质粒在GAL1/10启动子下游有一个IIS型限制性位点（BsmBI）。成功组装后，可以对底物盒进行半乳糖诱^导。
   9. 将所得质粒转化为 大肠杆菌。
   10. 在LB琼脂上用相应的抗生素做平板。在37°C下孵育16–18小时。
   11. 挑选分离的菌落，并用5毫升LB培养基接种。在37°C下孵育一夜（16–18小时），并摇晃（220转/分钟）。
   12. 使用质粒迷你制备套件从隔夜培养中提取质粒。
   13. 用分光光度计测量质粒浓度，然后送去测序。
3. 酵母显示载体的线性化
   1. 线性化酵母展示质粒，例如用SphI和PstI限制酶消化pDD1524，制备含有底物盒的酵母展示载体用于电穿孔。混合 表10 中列出的试剂，在37°C下孵育1小时。
   2. 将限制酶消化产物在1%琼脂糖凝胶上、电压240伏30分钟。切除与预期DNA长度相符的带状物，并用凝胶提取套件进行纯化。
      注意：每50微升限制性酶切可产生约0.5–1.0微克的DNA。由于每次电穿孔需要4微克线性化载体，因此应相应放大消化反应。

2. 电穿孔

注意：遵循机构安全程序处理生物材料和试剂，佩戴适当的个人防护装备，并依机构指南处理生物和化学废物。

1. 缓冲液、板材和培养基的制备（电穿孔前2天）
   1. 制备培养基（1× YPD;2 × YPD;合成葡萄糖酪胺酸，SDCAA+;以及合成半乳糖氨基酸SGCAA+）、板（YPD和SDCAA）、电穿孔缓冲液和无菌水，均遵循 表5中的配方。保存温度为4°C。
2. 准备一块带有条纹的EBY100板。
   1. 用EBY100酵母从甘油高压的YPD琼脂上划线。在30°C下种植两天。
   2. 生长后，将培养板保存在4°C。
      注意：条纹板可使用最长1个月;在盘子上标记连胜日期。
3. 电穿孔前一天准备EBY100前培养液
   1. 在500毫升的Erlenmeyer瓶中准备125毫升1日16×6日的液体。
   2. 准备25毫升1×YPD液，置于50毫升锥形管中。使用微量移液器尖端，从培养2天的平板中采集EBY100细胞。然后，将酵母细胞从移液器尖端转移到含有1 × YPD的锥形管中。
      注意：细胞条纹应形成约1–2毫米长的涂抹。
   3. 取下微量移液器尖端，并对锥形管进行漩涡处理以确保充分混合。
   4. 通过将25毫升含酵母细胞的1 × YPD的25毫升液转移到装有125毫升 1 YPD 的500毫升瓶中，制备150毫升的预培养液，该瓶含有1× YPD。搅拌搅拌。
   5. 利用分光光度计，通过制备两个路径长度为1厘米的微小凸球体来测量OD₆₀₀ ：一个为1 mL、1 × YPD的空白对照，另一个为1 mL的预培养物
   6. 在30°C下，以270转/分钟的轨道振动，培养150毫升预培养液，隔夜（16–20小时）。
4. 在预期初始OD₆₀₀ （电穿孔当天）准备亚培养
   1. 准备调节缓冲液和生长培养基，如 表5所述。
   2. 测量隔夜培养前的OD₆₀₀ （预期OD₆₀₀为17–22）。要在分光光度计的线性范围内，测量预培养液的1：20稀释比例。
   3. 计算接种100毫升亚培养所需的预培养体积。建议初始亚培养OD₆₀₀为3.0–4.0。
   4. 将培养液稀释至目标初始OD₆₀₀ ，用100毫升、2 × YPD的500毫升 Erlenmeyer 瓶中。
   5. 在30°C下培养100毫升亚培养，轨道振动270转/分钟，孵育4小时。
5. 培养基在4小时孵育期间的制备
   1. 保持冰冷的电穿孔缓冲液和无菌水（步骤2.1.1）随时准备。
   2. 按照 表5的食谱准备100毫升的调质缓冲液。每次转化使用20毫升调节缓冲液;相应地扩大规模。在室温（20–23°C）下保存。
      注意：注意：护肤缓冲液含有二硫糖醇（DTT）和醋酸锂（LiAc），这两种化学刺激物可能引起皮肤和眼睛刺激。请佩戴适当的个人防护装备，包括实验服、丁腈手套和安全眼镜，并按照机构化学品安全程序处理这些试剂。未使用的溶液和用过的缓冲液应按照机构指南作为化学废弃物处理。
   3. 制备生长培养基（50毫升）：将25毫升2×YPD和25毫升1M山梨醇混合。每次转化使用8毫升生长培养基。在室温（20–23°C）下保存。
6. 培养4小时后制备具电能力的酵母细胞。
   1. 将100毫升亚培养分成两根50毫升锥形管。通过离心法在4°C和1500 g的1500 × 下收集细胞，浸泡3分钟，然后倾析培养基。在完成步骤2.6.4之前，保持细胞冷藏。
   2. 用25毫升冰冷无菌水轻轻重新悬浮每个细胞沉淀。在4°C和1500 g ×离心机3分钟后，倒入培养基。
   3. 重复步骤2.6.2。
   4. 用25毫升冰冷电穿孔缓冲液轻轻重新悬浮每个细胞沉淀。在4°C和1500 × g 离心3分钟后，将培养基倒出。
   5. 将细胞从冰中取出，并用10毫升室温（20–23°C）调质缓冲液轻柔地重新悬浮每个细胞沉淀液。然后，将液态汇集成一个125毫升的Erlenmeyer瓶中，在30°C下孵育，轨道振动频率为270转/分钟，持续30分钟。
   6. 将细胞倒入50毫升的管子中。离心机温度为4°C，1500× 克 ，循环3分钟。倒出介质。
   7. 用50毫升冰冷电穿孔缓冲液轻轻重新悬浮细胞沉淀。在4°C和1500 克 ×离心机3分钟后，将培养基倒出。
   8. 通过加入约100–200微升电穿孔缓冲液，将细胞沉淀重新悬浮至最终体积为1毫升。将细胞冰藏保存，直到电切穿孔。
      注意：电适能电池可以冷冻（即放入-80°C的冷冻室），之后再使用，不会显著降低电穿孔效率。
7. 电穿孔、生长与镀层
   1. 冰上预冷却的电穿孔舱，间隙为0.2厘米。
   2. 将380微升的再悬浮沉淀转移到无菌的1.5毫升管中。与4微克质粒DNA或4微克线性质粒载体和12微克插入片段混合。用移液器轻轻搅拌。
      注意：为最大化电穿孔细胞数量，载体和插入DNA浓度理想应为700–800 ng/μL。如果浓度低于这个，使用真空浓缩器。
   3. 将悬浮液转移到预冷却的电穿孔舱中。冰敷5分钟。
   4. 5分钟后用无绒的实验室擦拭布擦拭瓶身侧面，去除残留水分，避免电孔时产生电弧。避免在卡维特金属板上方出现气泡或电池，因为它们也可能导致电弧。为了保持杯体的冷温，请勿触碰板电极。
   5. 在50毫升锥形管中准备8毫升生长培养基。
   6. 电孔化电池时设置如下：电压为2.5 kV，电容为25 μF，电阻为200 Ω^9。可接受的时间常数范围为2.8–4.5毫秒。
      注意：注意：电穿孔涉及高压电脉冲。确保餐具正确安置，并遵循制造商的操作说明。根据机构指南，应将用过的电穿孔杯子作为生物危害废弃物处置。
   7. 立即向小麦卷球注入约200微升锥形管的生长培养基，并将电穿孔细胞转移到50毫升锥形管中。再加入200–350微升的生长培养基，直到卡维特内无可见液体。
   8. 将50毫升的锥形电穿孔细胞管置于8毫升生长培养基中，30°C下无摇晃1小时。每15分钟倒转管子搅拌一次。
   9. 在1500× 克、25摄氏度离心3分钟下采集细胞。然后把培养基倒出。
   10. 将细胞重新置于适当的酵母滴落培养基中，以保持对转化细胞的选择。对于含有TRP1选择标记的质粒，将细胞重新悬浮在250毫升不含色氨酸的SDCAA+中，以选择性回收保留质粒的酵母。
   11. 在30°C下潜伏过夜（16–20小时），轨道震动为每分钟270。

3. 酵母细胞的诱导、染色和流式细胞分选

1. 蛋白酶库和底物盒的诱导（分选前一天）
   1. 在转变物在脱落培养基中一夜生长后，测量OD₆₀₀ ，步骤2.4.2。
   2. 放入12毫升酵母转化剂，离心机在3200×克下离心5分钟。
   3. 去除上清液，将细胞沉淀重新悬浮于SGCAA+诱导培养基中，至OD₆₀₀ 为0.5。利用稀释方程计算所需的悬浮体积，C₁V₁ = C₂V₂。
   4. 转移到125毫升的埃伦迈耶瓶中，在30°C下培养18–24小时，轨道振动为270转/分钟。
2. 分拣当天进行的荧光抗体染色
   1. 测量诱导后细胞的OD₆₀₀ 。使用两种冬鎪：一种是1毫升SGCAA+，另一种是950微升SGCAA+与50微升细胞混合。将测得的OD₆₀₀ 值乘以20，得到诱导后细胞的真实OD₆₀₀ 。
   2. 将每个样本归一化为3×10至⁷ 个细胞，用于抗体染色和FACS分选。使用 C₁V₁ = C₂V₂ 计算从感应瓶转移的细胞体积。
      注意：对于四位点NNS饱和诱变，理论文库大小为10⁶ 个变体。为了充分采样库，应筛查库大小至少10倍，即10个⁷ 单元格。例如：如果需要C₁V₁ = 3 ×10⁷ 细胞，C₂ = 诱导后OD₆₀₀ / 6（即6 × 10⁷ 细胞/mL），则可分配500微升诱导细胞（即V₂ = 3 × 10⁷ 细胞 / 6 × 10⁷ 细胞/mL = 500 μL）。
   3. 将计算出的细胞体积转移到1.5毫升管子上，并置于5,000× 克 离心机中，离心5分钟。
   4. 去除上清液，并重新悬浮于500微升含磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）+ 0.5%牛血清白蛋白（BSA）中。
   5. 离心机在5000克×克 下离心 5分钟，重复步骤3.2.4。
   6. 在5000克×克下离心5分钟，同时完成步骤3.2.7。
   7. 在1.5毫升管内制备抗体染色混合物，内含抗HA荧光素异硫氰酸酯（FITC）（0.5 μg/10⁷ 细胞）、抗FLAG光霉素（PE）（0.05 μg/10⁷ 细胞）和PBS + 0.5% BSA（100 μL/10⁷ 细胞）。把管子冰着。
   8. 去除上清液，并用染色液重新注入。每3个×10个⁷ 个细胞使用300微升染色混合物。不要使管子产生漩涡;只能做倒转或弹跳。
   9. 休眠后将细胞冰放在黑暗中冰冻1小时。
3. 染色后洗涤
   1. 离心机在5000克×下染色细胞5分钟。 去除上清液，将沉淀重新悬浮于含0.5% BSA的PBS中，使用每1×10个⁷细胞使用0.5毫升（例如，1×10个⁷细胞用500微升，3个×10个⁷细胞用1.5毫升）。
   2. 离心机5000× 克，5分钟。去除上清液，重新悬浮于750微升PBS+0.5% BSA中。
   3. 再输注750微升PBS + 0.5% BSA至10毫升收集管。
4. FACS（联邦航空服务系统）
   1. 为新实验启动并准备必要的细胞仪。
   2. 创建三个点阵图。在第一个点阵图中，选择X轴名称以显示前向散射区（FSC-A）通道，选择Y轴名称以显示侧散射区（SSC-A）通道。
      注意：这将有助于选择活细胞。
   3. 在第二个点图中，保持X轴名称以显示FSC-A通道，同时将Y轴通道改为显示前向散射高度（FSC-H）。
      注意：这将有助于选择背心。
   4. 在第三点图中选择X轴名称以显示PE信道，选择Y轴名称以显示FITC信道。
   5. 使用530/30纳米（FITC）和585/42纳米（PE）通道对细胞仪进行负对照。使用70微米喷嘴 ， 鞘压70 psi进行分拣。以4000–5000事件/秒的速度采集样本。
   6. 在主要完整酵母细胞群体周围绘制多边形门，以排除第一个点图（FSC-A与SSC-A）中FSC-A和SSC-A信号较低的碎屑和小颗粒。
   7. 在该门内，FSC-H与FSC-A图中的门单重态，通过选择FSC-H与FSC-A之间呈比例关系的线性总体。排除偏离线性分布且对应于双重态和单元聚合的事件。
      注意：PE与FITC的第三个点图将显示阴性对照组（即表达完整底物盒的酵母细胞）的对角点簇。
   8. 将样本并根据所需的PE/FITC值将酵母细胞分选到收集管中。分析对应理论文库大小至少10倍的单元格总数，以确保所有变体的充分代表（例如，分析一个理论多样性为~1 ×10⁶个变体的文库，分析~1×10⁷个单元格）。
   9. 将分选门置于负对照群体的PE/FITC对角线下方。
      注意：更严格的门能提高目标变异的富集，但会减少细胞恢复。
5. FACS解散后
   1. 离心收集管在3200克× 下循环5 分钟。小心去除上清液，留下1毫升，并重新悬浮于5毫升PBS中。
      注意：保留1毫升上清液，因为离心后底部的细胞颗粒将不可见。
   2. 离心电池再次在3200克× 下浸泡5 分钟。取出上清液，留下1毫升。再用4毫升SDCAA+再悬浮。
   3. 在一个250毫升的Erlenmeyer瓶中加入15毫升SDCAA+。将3.5.2步中悬浮的细胞转移到这个瓶子中。
   4. 在30°C下潜伏18至24小时，轨道震动频率为270转/分钟。
   5. 每轮定向演化重复步骤3.1、3.2、3.3和3.4。

4. 质粒回收与单个克隆测序

1. 种植单个菌落
   1. 通过在步骤3.5.4后混合500微升液体培养液和500微升无菌50%甘油液，制成甘油高汤，得到25%甘油高汤溶液。漩涡让细胞彻底混合。
   2. 在-80°C的冷冻室中保存一夜。长期储存时，转入液氮。
   3. 用无菌的1000微升吸头刮除甘油高汤，并将其混合到100微升的SDCAA+中。将混合物置于SDCAA平板上，倒置于30°C下孵育。
   4. 3天后采摘菌落，并在14毫升管内用1.5毫升SDCAA+过夜培养。
2. 进行酵母迷你制备以提取质粒
   1. 通过在16,000× 克 离心1分钟沉淀培养，然后再用酵母质粒纯化套件中的200微升溶液1重新沉淀。
   2. 加入5微升溶酶溶液（5 U/μL）。
   3. 在37°C的培养箱中端到端混合器上孵育4小时。
   4. 进行冻融循环，先在-80°C冷冻20分钟，再在42°C水浴中解冻10分钟。
   5. 加入200微升酵母质粒纯化套件中的溶液2，倒置2–3次，静置5分钟。
   6. 加入400微升酵母质粒纯化套装中的溶液3，倒置2–3次混合。离心机温度为16,000×克，持续5分钟。
   7. 使用具有高DNA结合能力柱的纯化试剂盒纯化质粒DNA。
      注意：由于切割细胞中大量剪切的基因组酵母DNA来源，需使用具有更高DNA结合能力（35微克）的硅基柱，而非容量较低的酵母质粒DNA纯化柱（5微克）¹⁵。
   8. 用分光光度计测量DNA浓度。DNA产率为10–30 ng/μL。
3. 将纯化质粒转化为化学能力强的大 肠杆菌 细胞
   1. 按照 表5的配方制备SOC培养基，并配用LB-氯氨基素平板。另外，预热水浴至42°C。
   2. 将每个质粒的LB-氯霉素板加热20分钟，温度为37°C。
   3. 从-80°C的冷冻室取出一管化学反应良好的细胞，在冰上解冻。
   4. 将每个质粒30微升的合格细胞放入冰上1.5毫升的管子中。
   5. 将3微升质粒移液器移入有能力的细胞中。拨动搅拌，然后在冰上静置5分钟。
   6. 通过在42°C的水浴中短暂孵育细胞40秒进行热休克。
   7. 在冰上孵育2分钟。
   8. 向细胞中加入300微升SOC培养基，在37°C、220转/分钟下培养15分钟。
   9. 将50–100微升转化的合格细胞板上板，置于预热板上。
   10. 将平板倒置在37°C下孵育18小时。
4. 群落采摘
   1. 将5毫升液态LB-氯霉素培养基加入14毫升圆底培养管。
   2. 用无菌的1000微升吸头选取一个菌落，放入培养管中。
   3. 将管子放入振动器（220转/分钟，30°–45°角度以最大化通气），在37°C下浸泡18小时。
5. 从细菌液体培养中提取质粒
   1. 将液体培养物以3200× 克 离心4分钟。倒出上清液。
   2. 使用质粒纯化套件从隔夜培养中提取质粒。
   3. 使用分光光度计测量纯化质粒的浓度。
6. 提交质粒进行测序
   注意：使用诸如全质粒纳米孔测序，或在突变原区域两侧加引物的桑格测序等服务。

结果

高效的库构建对于确保对突变空间的充分覆盖至关重要。为避免稀有功能变异丢失，变换体数量应至少达到理论库大小的10×至100个×。由于 酿酒酵母 的转化效率受细胞浓度影响，且在对数早期至对数^相细胞中最高，因此我们在电穿孔前优化了初始细胞密度。酵母培养物在初始OD₆₀₀ 值范围为1.0–4.0时进行亚培养，孵育4小时（n = 2–4个独立生物实验），之后将最终OD₆₀₀ 值映射到 酿酒酵母 生长曲线上，以确认细胞仍处于中期对数生长阶段（图5A， 补充图1）。

用4 μg质粒DNA电穿孔这些培养物（n = 2个独立生物实验）显示，转化效率在初始OD₆₀₀ 条件下显著差异（单向方差分析， p = 8.92 × 10^⁻⁻7）。与OD₆₀₀ = 1.0开始的培养相比，所有较高的起始细胞密度带来了显著更高的转化效率（Dunnett多重比较检验;OD₆₀₀ = 1.5，调整后 p = 0.0020;OD₆₀₀ ≥ 2.0，调整后 p < 0.0001），在初始 OD₆₀₀ 为 4.0 时观察到的最高转化效率。为了利用酵母细胞天生进行同源重组的能力，我们还电穿出4微克线性质粒载体和12微克插入片段（即蛋白酶文库），并进行了n=2个独立生物实验。在测试的初始OD₆₀₀ 条件下（单向方差分析， p = 0.0023）间转化效率存在显著差异。与OD₆₀₀ = 1.0开始的培养相比，转化效率显著更高，分别为OD₆₀₀ = 3.0 （调整p = 0.0018）、3.5（ 调整p = 0.0062）和4.0（ 调整p = 0.0024）（Dunnett多重比较检验）。我们观察到在适度初始亚培养密度（OD₆₀₀ = 3.0）下转化效率最高，表明在这些条件下细胞能力与重组效率之间达到最佳平衡（见图5B）。与仅质粒转化相比，线性化载体和蛋白酶文库插入物（n = 2个独立生物复制）的共电穿孔在测试的初始OD₆₀₀ 条件下显著提高了转化效率（log10转化转化效率的双因子方差分析， p = 9.40 × 10^⁻¹²).平均而言，共电穿孔相比仅质粒转化，转化效率平均提高了121倍（95%置信区间，63–233倍）（见图5B）。

在FACS运行包含突变蛋白酶文库和底物选择盒的酵母细胞（见图6A）时，细胞会显示截断盒或仍切割反选择底物的蛋白酶（Q1）、表达非功能蛋白酶变体（Q2），或表达仅成功切割选择底物的蛋白酶变体（Q3）。表达非功能变异的酵母细胞在PE图与FITC图中呈对角线分布的显性群体，反映了两种信号的共存（图6A，Q2）。相比之下，切割选择底物而保留原生（反选择）底物的功能变异则形成了明显的非对角族群，特征为高PE和中低FITC信号强度（图6A，Q3）。采用严格的门控策略分离这一非对角种群，导致功能变异在连续的第¹⁰轮筛选中逐步富集。这种富集在视觉上表现为一个越来越清晰的细胞簇，从对角簇中分离出来（图6B，从左到右）。如果没有明显的非对角分布，可能表明文库质量低、表达不足或染色条件不理想。作为阴性对照，图6C，D显示了电孔化、诱导、未染色的酵母细胞及其对应的FITC和PE荧光直方图。

在富集的非对角种群中，可以根据FITC强度进一步解析亚种群。表现出中等FITC信号的单元可以与FITC信号较低的单元分开分类。对这些不同群体的测序揭示了独特的突变谱（见表11），表明不同蛋白酶变异体的切割效率差异。

图1：载体与插入件的制备。 （A）通过位点饱和诱变生成poty病毒蛋白酶文库。（B）底物盒组组装并集成到酵母显示载体（pDD1523）。（C）通过限制性消化对酵母展示载体（pDD1524）线性化。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：将底物盒和PCR扩增的突变蛋白酶文库电穿孔到功能正常的EBY100细胞中。 （虚线框）体内循环化含有蛋白酶和底物盒的质粒。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：酵母细胞的诱导、染色及流式细胞分选。 （A）蛋白酶文库和底物盒的诱导。（B）荧光抗体染色：使用抗HA荧光素异硫氰酸酯（FITC）和抗FLAG去氧胧氨酸（PE）抗体染色。（C）染色细胞采用荧光激活细胞分选（FACS）进行分选。（D）选择培养基中FACS分选细胞的回收。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：分离酵母细胞的质粒恢复与测序。 （A）分选后的酵母细胞的装甲。（B） 从单个酵母菌落中提取质粒。（C） 提取质粒的大肠杆菌转化。（D）从单个大肠杆菌群体中提取质粒。（E）提取质粒的纳米孔测序。Flask和管状图标分别改编自DBCLS和Helicase 11，通过Bioicons（https://bioicons.com 年）并根据知识共享署名4.0国际许可协议（CC BY 4.0）进行调整。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：不同培养基下的酵母生长曲线及亚培养600 nm（OD₆₀₀）初始光学密度对酵母电穿孔效率的影响。 （A） 1 个×酵母提取物蛋白葡萄糖（YPD）、2× YPD、无抗生素合成葡萄糖酪胺酸琼脂（SDCAA-）和含抗生素合成葡萄糖酪胺酸琼天（SDCAA+）中酵母的生长曲线。（B） 在不同亚培养初始OD₆₀₀下，使用4 μg质粒载体电穿酵母的转化效率，以及使用线性化载体（4 μg）和蛋白酶文库插入物（12 μg）在相同初始OD₆₀₀ 值下的转化效率。（A）中的数据以OD₆₀₀ ±SD显示，来自两个独立的生物实验（n = 2）。（B）中的数据以每次电穿孔平均转化体数（对数纵轴）表示，单个生物复制体以圆圈表示（n = 2）。质粒和载体加插入物电穿孔优化实验的统计显著性通过对log10转化电穿孔效率的单向方差分析确定，随后使用OD₆₀₀ = 1.0作为对照的Dunnett多重比较检验。ns，不显著; p < 0.01 （**）; p < 0.0001 （****）。利用对log10转化转化效率的双因子方位差分析，确定了仅质粒与载体加插入物转化效率差异的统计显著性。 p < 0.0001 （****）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：基于 荧光激活细胞分选 （FACS）的酵母克隆富集。 （A） 门控策略的示意表示。细胞被分为三个区域：Q1，藻类红素（PE）低细胞;Q2，PE高/荧光素异硫氰酸酯（FITC）高细胞;以及Q3，PE高细胞，FITC荧光从低至中等。采集Q3内的细胞进行富集。（B）一个独立进化活动的代表性FACS图，显示排序轮次且FITC门控严格度递增。分别采集中低FITC细胞进行测序。百分比表示门控群体中活的单一酵母细胞比例。（C）代表性FACS图，显示电穿孔、未染色的酵母细胞作为负对照。 （D） FITC-A（左）和PE-A（右）荧光强度的直方图，对应于（C）中所示的数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：蛋白酶文库第一轮PCR扩增反应混合物。 用于蛋白酶文库第一轮扩增的PCR反应组成，包括50微升反应中每个试剂的最终浓度和含量。 请点击此处下载此表格。

表2：蛋白酶文库第一轮PCR扩增的循环条件。 热循环程序用于蛋白酶文库的首次PCR扩增。 请点击此处下载此表格。

表3：蛋白酶文库第二轮PCR扩增反应混合物。 用于蛋白酶文库第二轮扩增的PCR反应组成，包括50微升反应中每种试剂的最终浓度和剂量。 请点击此处下载此表格。

表4：蛋白酶文库第二轮PCR扩增的循环条件。 热循环程序用于蛋白酶文库的第二轮PCR扩增。 请点击此处下载此表格。

表5：酵母电穿孔和生长的培养基和试剂。 表格描述每种化学成分为制备特定量的1个×和×2个酵母提取物蛋白葡萄糖（YPD）、电穿孔缓冲液、调节缓冲液、生长培养基、含抗生素的合成葡萄糖卡胺酸（SDCAA+）、含抗生素的合成半乳糖卡胺酸（SGCAA+）、溶原性肉汁（LB）、LB-氯霉素培养基、超优肉汁（SOB）培养基及含分解物抑制（SOC）的超优汤质。还包括制备库存溶液的说明，如2M山梨醇、1M二硫糖醇（DTT）和2M醋酸锂（LiAc）。还提供了关于制备SDCAA、LB和YPD琼脂平板的额外说明。 请点击此处下载此表格。

表6：用于退火和磷酸化的反应混合物。 用于同时退火和磷酸化寡核苷酸的反应混合物组成，用于底物盒装组装。 请点击此处下载此表格。

表7：寡核苷酸退火和磷酸化的循环条件。 用于底物盒装组装的寡核苷酸退火和磷酸化的温度程序。 请点击此处下载此表格。

表8：底物盒与载体质粒金门组装反应混合物。 用于将底物盒连接到载体质粒的金门组装反应的组成。 请点击此处下载此表格。

表9：基底盒和载体质粒金门组装的循环条件。 用于金门组装的热循环程序。 请点击此处下载此表格。

表10：载体质粒线性化反应混合物。 用于线性化载体质粒的限制性消化反应组成，先于文库构建。 请点击此处下载此表格。

表11：TEVp变体切割ENLYFES的纳米孔测序结果。 在第四次也是最后一次FACS治疗后，从酵母细胞中提取质粒。每个克隆中的突变相对于野生型序列进行了展示。 请点击此处下载此表格。

补充图1：亚文化期间EBY100初始与最终培养密度的关系。在不同初始OD₆₀₀值下对EBY100培养，最终OD 600在相同生长条件下（30°C，220 rpm）在培养后测量最终OD₆₀₀。最终培养密度随着初始OD₆₀₀的增加线性增加（R² = 0.969，p = 5.77 × 10^⁻⁻5）。 数据点表示（n = 2–4）个独立生物复制品的 ± SD 均值。请点击这里下载此文件。

补充图2：TEVp诱变文库的合理设计。TEVp（PDB ID：1LVB）的卡通表现，四个残基（金色）<5Å）远离P1残基（紫色），用于位点饱和诱变。请点击这里下载此文件。

讨论

定向进化是一种高通量方法，通过迭代的多样化和选择循环来识别具有增强或新颖生化功能的蛋白质¹⁷。在本协议中，我们详细介绍了一种优化工作流程，用于利用 酿酒酵母细胞表面显示系统进化蛋白酶-底物识别能力。该表面显示系统将蛋白酶活性映射到可检测的荧光表型，从而实现基于FACS的目标克隆富集。我们提供蛋白酶库和底物盒组装、高效电穿孔、FACS门控与分选以及蛋白酶变异体最终测序的详细步骤。

定向进化中最重要的步骤之一是确保文库的多样性和潜在突变的覆盖度¹⁷.我们的电穿孔效率实验显示，初始亚培养OD₆₀₀（3.0）转化效率最高，超过10⁹ CFU。这一规模通过优化的酵母电穿孔实现，远超传统化学转化方法，能够充分覆盖大型组合文库^8,9。准确的FACS门控和分选对于区分表现出所需切割特性的细胞与表现出非特异性切割特性的细胞至关重要。在多轮基于FACS的选择过程中，门控策略变得越来越严格，以选择性富集目标蛋白酶变异。如果门控过于宽泛，则可以对不需要的细胞和所需的变异进行排序。严格的门控（例如，FITC信号在各轮次中逐渐降低阈值）使细胞群体能够富集到具有更高特异性和活性的蛋白酶变异，针对新的目标底物序列¹⁰。与以往的^7,18研究一致，我们对TEVp底物结合口袋中与底物P1残基Q相互作用的四个残基进行了NNS-密码子诱变（T146， D148， H167， S170）（补充图2）。图6B中显示的FACS图代表了一个代表性的分类实验，展示了门控策略和富集工作流程。有趣的是，我们的研究结果产生了具有不同氨基酸突变组的TEVp变体（见表11）。这些结果支持蛋白酶进化的一个关键特征：多条进化路径可以达成同一目标。

在进行实验时，可能需要修改和排查策略。例如，在电穿孔过程中，按指示在冰上工作，并在每个步骤小心地重新休眠细胞颗粒，确保细胞在电穿孔前保持活力和健康。酵母细胞在电穿孔阶段直到生长恢复阶段都很脆弱。此外，可能需要修改FACS鞘液以防止酵母细胞絮凝。护套液常用于FACS机器，可能含有抑制细菌和真菌生长的防腐剂。因此，鞘液可以被纯PBS替代，以防止分选过程中细胞死亡。

酵母表面显示系统需要适当折叠的蛋白质才能成功穿越分泌通路。某些蛋白酶变体可能因折叠错误而失去活性，导致FACS选择过程中因非特异性切割或背景荧光而出现假阳性。对于像这样的质粒基研习，值得注意的是经过明确特征的假阳性来源。由于切割被解读为C端表位标签的丧失，任何破坏该标签的突变都会产生与真实切割事件相同的低FITC表型;此类标签突变发生在大规模同源重组过程中，并可能在连续的分选轮间富集。最近研究表明，染色体整合恒定底物盒可以缓解这一问题¹⁹。该协议依赖于使用插入库，同时保持向量（包含基板盒式磁带）不变。因此，该方案不适合想要同时进化蛋白酶和底物文库的人。

YESS平台开创了蛋白酶-底物特异性¹⁸的重编程路径。近期改进包括：在YESS2.0⁷中加入可滴定酶/底物调控，结合下一代测序，实现高分辨率特异性剖析²⁰，以及染色体整合报告以减少表达噪声和假阳性¹⁹。其他正交策略，如噬菌体辅助连续进化，也被应用于治疗靶点的蛋白酶特异性工程²¹。这些工具已在TEV蛋白酶工程之外找到应用，例如对SARS-CoV-2主蛋白酶进行高分辨率剖析，指导抑制剂设计²²。任何此类活动的关键决定因素是产生足够的变换体以覆盖大型组合文库（>10⁹），而这些在 EBY100 酿酒 酵母菌株中尚未系统性优化。通过定义驱动EBY100转化超过10⁹ CFU的生长阶段和电穿孔条件，该方案消除了瓶颈，实现了基于FACS的全面筛查数百万个变异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software