需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

优化的酵母表面展示工作流程用于蛋白酶的定向进化

331 次观看

⸱

DOI：

10.3791/72559

⸱

2026年8月4日

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

本文内容

摘要

本方案提供了利用基于表面展示的选择系统在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中对病毒蛋白酶进行定向进化的优化工作流程。该流程涵盖了DNA插入片段文库和底物盒的设计、适用于高效转化的电穿孔条件、基于荧光激活细胞分选的蛋白酶切割选择，以及富集突变体的测序分析。

摘要

定向进化在快速且受控的实验室环境中模拟自然进化过程，以获得具有理想功能或特性的蛋白质。通过筛选大量突变体蛋白质编码基因库，可实现对适用于生物技术、医学和合成生物学应用的所需变异体的功能性选择。利用本方案，我们在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中进行定向进化，以改造蛋白酶变体，使其对非天然底物序列具有高特异性。我们将这些蛋白酶变体展示在酵母细胞表面，从而通过多轮富集的荧光激活细胞分选（FACS）实现对目标变体的筛选。底物盒的四个关键元件与蛋白酶文库共同表达：一个融合蛋白，包含（i）酵母黏附受体亚基Aga2，（ii）筛选和（iii）反向筛选底物序列，（iv）表位标签序列，以及一个可选的内质网（ER）回收信号序列。仅切割了筛选底物序列的酵母细胞，可通过多色FACS结合荧光标记（藻红蛋白/异硫氰酸荧光素标记）的抗表位抗体进行分离。本文提供了开展蛋白酶定向进化实验的优化后逐步操作方案，包括DNA插入片段文库设计和底物盒设计、高效转化（每微克DNA可获得高达109个转化子）的酵母细胞电穿孔、基于FACS的筛选与富集，以及进化变体的测序分析。我们以烟草蚀刻病毒核包含体A蛋白酶（TEVp）为例，演示本定向进化方案，将其底物特异性从天然序列ENLYFQ↓S进化为新序列ENLYFE↓S。

引言

Potyviridae 科的半胱氨酸蛋白酶，特别是核包含体A（NIa）蛋白酶，是一类尚未被充分开发的序列特异性内肽酶资源。该科已鉴定的成员超过3800种，NIa蛋白酶可特异性切割一个独特的七氨基酸底物序列。马铃薯Y病毒科为构建可编程蛋白质调控系统、设计正交蛋白酶遗传回路以及开发序列特异性的生物技术工具提供了多样化的蛋白酶资源1,2。尽管自然界中存在丰富的多样性，目前仅有两种NIa蛋白酶——烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEVp）和烟草脉斑花叶病毒蛋白酶（TVMVp）——被系统表征并被广泛改造用于实验室及生物技术应用3,4。这一有限的蛋白酶工具集限制了需要多种正交蛋白酶活性的多组分回路的设计空间5，从而推动了通过定向进化手段进一步拓展和表征NIa蛋白酶的研究工作6,7。

酵母表面展示技术已成为定向进化领域最强大的平台之一，可通过荧光激活细胞分选（FACS）实现高通量蛋白文库筛选6,7。例如，酵母内质网滞留筛选（YESS）系统通过酿酒酵母（S. cerevisiae）的分泌途径将蛋白酶活性与表面展示耦合6,7。 YESS系统已被用于设计新型蛋白酶-底物特异性，并在多轮定向进化实验中展现出良好的应用价值 。在该系统中，蛋白酶变体与包含带有表位标记的可切割底物盒的融合蛋白共表达，同时在EBY100酵母菌株中表达Aga1p表面锚定蛋白。通过使用荧光标记抗体进行差异性标记，可区分细胞表面展示的已切割与未切割底物盒。这种依赖于活性的展示机制可直接与基于FACS的多轮迭代筛选兼容，适用于包含107个或更多变体的文库6,7。

定向进化的基础前提是能够以足够大的规模引入变异文库，从而充分覆盖目标序列空间。对于跨越多个氨基酸位点的饱和突变文库，需要达到每微克DNA产生108至109个独立转化子的转化效率，以确保文库中引入的多样性在筛选后的群体中得到充分代表。目前已有多种将外源DNA导入S. cerevisiae的方法，但各自在通量上存在明显限制。传统的化学转化法使用乙酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇（LiAc/ssDNA/PEG）体系，因其操作简便且易于获取而被广泛采用。然而，该方法通常仅能达到每微克DNA 104–106个菌落形成单位（CFU）的转化效率，难以满足大规模文库构建所需的序列多样性8。相比之下，电穿孔法通过施加高压电场瞬时增加细胞膜通透性，促进DNA的摄入。在现有转化方法中，电穿孔法始终表现出最高的转化效率，经优化的实验方案可实现108–109 CFU的转化产量9。研究发现，S. cerevisiae的电穿孔效率对细胞生长阶段、DNA质量及缓冲液组成高度敏感，这一特性已为文库规模的定向进化研究提供了可广泛借鉴的实验框架9。

本方案中使用的菌株为 S. cerevisiae EBY100，这是一种广泛采用的酵母表面展示宿主菌株。EBY100 由 Boder 和 Wittrup 构建，将一个在半乳糖诱导型 GAL1 启动子控制下的 AGA1 表达盒整合到蛋白酶缺陷型亲本菌株 BJ5465 的染色体 AGA1 位点中10。该菌株可从 ATCC 商业获取（目录号 MYA-4941；保藏人 K.D. Wittrup），其基因型为 MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−)。因此，Aga1p 和 Aga2p-底物表达盒融合蛋白均由同一个半乳糖诱导型启动子驱动表达，确保这两个亚基共诱导并组装成二硫键连接的 Aga1p–Aga2p 复合物，从而将展示的融合蛋白锚定在细胞壁上。

尽管EBY100在酵母展示应用中被广泛使用，但目前尚无已发表的实验方案针对该菌株在文库规模下的电转化过程进行系统优化。与EBY100相关的特定参数，例如收获时的最佳生长阶段、传代培养期间的培养基组成，以及初始600 nm光密度（OD₆₀₀）与电转化效率之间的定量关系，均未被充分阐明。600）和转化效率仍有待系统表征与优化。本文报道了EBY100的转化效率随培养物OD值单调增加600 收获时，处于对数生长后期的细胞转化效率显著高于对数生长早期收获的细胞。我们评估了关键的实验方案参数，包括初始OD600 接种时的数值，使用2 × 酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基进行传代培养，电穿孔缓冲液的配制，以及电穿孔后的扩增培养条件。本文所述方案提供了一种优化的、逐步操作的工作流程图1A–C, 图2, 图3A–D, 图 4A–E用于制备电转感受态EBY100细胞及高效DNA文库电转化，可稳定获得每微克DNA转化子数超过10^7的转化效率9 菌落形成单位。为验证本方案，我们开展了一项全面的定向进化实验，通过四轮基于流式细胞术分选（FACS）的筛选与富集，对TEV蛋白酶（TEVp）的切割特异性进行改造。对富集后的蛋白酶变体进行测序，结果显示蛋白酶底物结合口袋中靶向残基位点发生了显著多样化，证明该方案能够对序列空间实现充分的文库覆盖，从而支持有效的定向进化实验。本方案对于利用EBY100进行酵母表面展示结合定向进化，以及开展与FACS兼容的蛋白酶、抗体高通量筛选的研究人员具有广泛的应用价值。9, 激酶11和受体12以及其他蛋白质。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及重组酿酒酵母（S. cerevisiae）的实验均依照德克萨斯大学达拉斯分校机构生物安全与化学安全委员会的政策和程序进行。重组酵母菌株的操作在生物安全一级（BSL-1）防护条件下进行，并遵循既定的机构微生物操作规范。电穿孔、培养及荧光激活细胞分选（FACS）均按照批准的机构生物安全程序执行。酵母培养物及受污染的一次性耗材均依照机构指南作为生物危害废物进行去污和处理。

1. 载体与插入片段的制备

  1. 通过位点饱和突变构建马铃薯Y病毒属蛋白酶文库
    1. 使用序列设计软件设计长度为30至50个核苷酸、具有重叠区域的正向与反向寡核苷酸，以构建蛋白酶的突变文库。针对需要进行诱变的位点，在相应的寡核苷酸中将野生型密码子替换为NNS简并密码子，其中N代表A、T、G或C，S代表G或C。
    2. 为每对正向和反向寡核苷酸设计3′端重叠区域，其熔解温度（Tm）应为55–60 °C。设计首尾两个寡核苷酸，使其在限制性酶切位点之外与酵母表面展示载体具有50个核苷酸的重叠区域。
    3. 确保插入片段的至少一端与线性化载体的一端精确重叠，以促进同源重组13避免相邻寡核苷酸之间的间隙14.
    4. 将寡核苷酸用去离子水重悬至100 µM2在无菌的1.5 mL离心管中，将每种引物各取0.5 µL混合，加至总体积200 µL（每种引物的终浓度为250 nM）。
    5. 使用下表所列组分设置PCR反应 表1 组装蛋白酶文库，使用以下热循环条件： 表2.
    6. 使用最外侧的正向和反向寡核苷酸建立第二轮PCR反应（表3）以首次组装的PCR产物为模板。按所示条件扩增产物。 表4.
    7. 将第二次PCR产物在含有溴化乙锭（0.5 µg/mL）的1%琼脂糖凝胶中以240 V电泳30分钟。切下与预期DNA长度相对应的条带。
      注意：警告：溴化乙锭为诱变剂，操作时应使用适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、腈类手套和护目镜。避免皮肤接触和吸入。含溴化乙锭的凝胶、缓冲液及耗材应按照机构安全指南作为危险化学废弃物处理。
    8. 使用凝胶回收试剂盒进行纯化，用 50 µL 去离子水洗脱2O.
    9. 使用分光光度计测定DNA浓度。将DNA于−20 °C保存。
      注意：每50 µL的2反应nd PCR 可产生约 0.5–1.0 µg 的总 DNA。由于每次电转化需要 12 µg 蛋白酶文库（即插入片段），请相应放大反应体系。
  2. 底物盒组件组装
    1. 制备LB-琼脂平板和LB-氯霉素液体培养基。参见配方在 表5.
    2. 设计一组在正向和反向用于底物盒组装的30碱基重叠寡核苷酸。使每个反向寡核苷酸的5′端与下一个片段的正向寡核苷酸的5′端在4个核苷酸上互补匹配。
    3. 用去离子水将冻干的寡核苷酸重悬至 100 µM2O.
    4. 混合试剂，步骤同 表6.
    5. 使用循环程序 表7 退火并磷酸化寡核苷酸混合物。
    6. 将退火后的寡核苷酸在去离子H中稀释4倍2O 以达到终浓度 1.25 µM。
    7. 将退火后的寡核苷酸混合物与载体（如 pDD1523）混合，按照 表8.
    8. 进行Golden Gate连接反应，按照以下循环程序操作： 表9.
      注意：例如，pDD1523 质粒在 GAL1/10 启动子下游含有一个 I 型 S 限制性酶切位点（BsmBI）。正确的组装可实现半乳糖对底物表达盒的诱导7.
    9. 将所得质粒转化至 E. coli.
    10. 在含有相应抗生素的LB琼脂平板上接种细胞，于37 °C培养16–18小时。
    11. 挑取单菌落，接种于5 mL LB培养基中，37 °C、220 rpm振荡培养过夜（16–18 h）。
    12. 使用质粒小提试剂盒从过夜培养物中提取质粒。
    13. 使用分光光度计测定质粒浓度，然后送样进行测序。
  3. 酵母展示载体的线性化
    1. 线性化酵母展示质粒，例如用 SphI 和 PstI 限制性内切酶消化 pDD1524，以制备含有底物表达盒的酵母展示载体，用于电穿孔。混合下表所列试剂 表10 并在37 °C孵育1小时。
    2. 在1%琼脂糖凝胶中以240 V电压电泳30分钟，跑完限制性酶切产物。切下对应于预期DNA长度的条带，使用胶回收试剂盒进行纯化。
      注意：每50 µL限制性消化反应可产生约0.5–1.0 µg总DNA。由于每次电转化需要4 µg线性化载体，应相应放大消化反应体系。

2. 电穿孔

注意：处理生物材料和试剂时，应遵循机构的安全操作规程，穿戴适当的个人防护装备，并根据机构指南处置生物和化学废弃物。

  1. 缓冲液、培养板和培养基的准备（电穿孔前2天）
    1. 按照表5中的配方制备培养基（1 × YPD；2 × YPD；合成葡萄糖酪蛋白氨基酸培养基，SDCAA+；以及合成半乳糖酪蛋白氨基酸培养基，SGCAA+）、平板（YPD和SDCAA）、电穿孔缓冲液和无菌水。4 °C保存。
  2. EBY100划线平板的制备
    1. 从甘油保存菌种中将EBY100酵母划线接种至YPD琼脂平板上。30 °C培养2天。
    2. 培养完成后将平板置于4 °C保存。
      注意：划线平板在1个月内仍可使用；请在平板上标记划线日期。
  3. EBY100预培养物的制备（电穿孔前1天）
    1. 在500 mL三角烧瓶中制备125 mL的1 × YPD培养基。
    2. 在50 mL离心管中制备25 mL的1 × YPD培养基。使用移液器吸头从培养2天的平板上取EBY100酵母细胞，然后将吸头中的酵母细胞转移至含有1 × YPD的离心管中。
      注意：细胞划线应形成约1–2 mm长的涂布痕迹。
    3. 移除移液器吸头 ，并涡旋震荡离心管以确保充分混匀。
    4. 将含酵母细胞的25 mL 1 × YPD转移至含125 mL 1 × YPD的500 mL三角烧瓶中，制备150 mL预培养物。轻轻摇动混匀。
    5. 使用分光光度计测量OD600，准备两个光程为1 cm的微量比色皿：一个加入1 mL 1 × YPD作为空白对照，另一个加入1 mL预培养物。
    6. 将150 mL预培养物在30 °C下以270 rpm振荡培养过夜（16–20 h）。
  4. 在目标初始OD600下制备亚培养物（电穿孔当天）
    1. 按照表5中的说明制备诱导缓冲液和复苏培养基。
    2. 测量过夜预培养物的OD600 （预期OD₆₀₀为17–22）。为确保在分光光度计的线性范围内，需对预培养物进行1:20稀释后测量。
    3. 计算接种100 mL亚培养物所需的预培养物体积。建议亚培养物的初始OD600 为3.0–4.0。 
    4. 在500 mL三角烧瓶中，将培养物用100 mL 2 × YPD稀释至目标初始OD600。
    5. 将100 mL亚培养物在30 °C下以270 rpm振荡培养4 h。
  5. 4 h培养期间的培养基准备
    1. 准备好冰冻的电穿孔缓冲液和无菌水（来自步骤2.1.1）。
    2. 按照表5的配方制备诱导缓冲液（100 mL）。每轮转化使用20 mL诱导缓冲液；根据需要按比例放大。室温（20–23 °C）保存。
      注意：警告：诱导缓冲液含有二硫苏糖醇（DTT）和乙酸锂（LiAc），属于化学刺激物，可能引起皮肤和眼睛刺激。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、腈类手套和护目镜，并按照机构的化学品安全规程操作。未使用的溶液和废弃缓冲液应按照机构指南作为化学废物处理。
    3. 制备复苏培养基（50 mL）：将25 mL 2 × YPD与25 mL 1 M山梨醇混合。每轮转化使用8 mL复苏培养基。室温（20–23 °C）保存。
  6. 4 h培养后电转化感受态酵母细胞的制备
    1. 将100 mL亚培养物分装至两个50 mL离心管中。在4 °C、1,500 × g条件下离心3 min收集细胞，弃去上清液。在完成步骤2.6.4前将细胞保持在冰上。
    2. 用25 mL冰冻无菌水轻轻重悬每个细胞沉淀。在4 °C、1,500 × g条件下离心3 min，弃去上清液。
    3. 重复步骤2.6.2。
    4. 用25 mL冰冻电穿孔缓冲液轻轻重悬每个细胞沉淀。在4 °C、1,500 × g条件下离心3 min，弃去上清液。
    5. 将细胞从冰上取出，用10 mL室温（20–23 °C）诱导缓冲液轻轻重悬每个细胞沉淀，然后合并至一个125 mL三角烧瓶中，在30 °C、270 rpm振荡条件下孵育30 min。
    6. 将细胞倒入50 mL离心管中，在4 °C、1,500 × g条件下离心3 min，弃去上清液。
    7. 用50 mL冰冻电穿孔缓冲液轻轻重悬细胞沉淀。在4 °C、1,500 × g条件下离心3 min，弃去上清液。
    8. 通过加入约100–200 µL电穿孔缓冲液将细胞沉淀重悬至终体积1 mL。电穿孔前保持细胞在冰上。
      注意：电转化感受态细胞可冷冻保存（即置于–80 °C冰箱）以备后续使用，电穿孔效率不会显著下降。
  7. 电穿孔、复苏和涂板
    1. 将间隙为0.2 cm的电穿孔杯预先在冰上冷却。
    2. 将380 µL重悬的细胞悬液转移至无菌1.5 mL离心管中。加入4 µg质粒DNA，或4 µg线性化质粒载体和12 µg插入片段。通过移液轻轻混匀。
      注意：为最大化电穿孔细胞数量，载体和插入片段DNA的浓度理想情况下应为700–800 ng/µL。若浓度不足，可使用真空浓缩仪进行浓缩。
    3. 将混合液转移至预冷的电穿孔杯中，冰上静置5 min。
    4. 5 min后，用无尘实验室擦拭纸擦拭电穿孔杯外壁，去除残留水分，以防电穿孔过程中产生电弧。避免气泡或细胞液高于电穿孔杯内的金属电极，否则也可能导致电弧。为保持电穿孔杯低温，切勿触碰电极板。
    5. 在50 mL离心管中准备8 mL复苏培养基。
    6. 使用以下参数进行电穿孔：电压2.5 kV，电容25 µF，电阻200 Ω9。可接受的时间常数范围为2.8–4.5 ms。
      注意：警告：电穿孔涉及高电压电脉冲。确保电穿孔杯正确安装，并遵循制造商的操作说明。使用过的电穿孔杯应按照机构指南作为生物危害废物处理。
    7. 立即向电穿孔杯中加入约200 µL来自离心管的复苏培养基，将电穿孔后的细胞转移至50 mL离心管中。再加入200–350 µL复苏培养基，直至电穿孔杯中无可见液体残留。
    8. 将含电穿孔细胞的50 mL离心管在8 mL复苏培养基中于30 °C静置孵育1 h。每15 min轻轻倒置混匀一次。
    9. 在1,500 × g、25 °C条件下离心3 min收集细胞，弃去上清液。
    10. 将细胞重悬于适当的酵母缺陷培养基中，以维持对转化细胞的选择压力。对于含有TRP1选择标记的质粒，应将细胞重悬于250 mL SDCAA+培养基（不含色氨酸）中，以选择性回收保留质粒的酵母细胞。
    11. 在30 °C下以270 rpm振荡培养过夜（16–20 h）。

3. 酵母细胞的诱导、染色及流式细胞分选

  1. 蛋白酶文库与底物盒的诱导（分选前一天）
    1. 转化子在缺失培养基中过夜培养后，按照步骤 2.4.2 测定 OD600。
    2. 取 12 mL 酵母转化子，于 3,200 × g 离心 5 分钟。
    3. 弃上清，将细胞沉淀重悬于 SGCAA+ 诱导培养基中，调整至 OD600 为 0.5。使用稀释公式 C1V1 = C2V2 计算所需的重悬体积。
    4. 转移至 125 mL 锥形瓶中，于 30 °C、270 rpm 振荡培养 18–24 小时。
  2. 荧光抗体染色（分选当天）
    1. 测定诱导后细胞的 OD600。使用两个比色皿：一个加入 1 mL SGCAA+，另一个加入 950 µL SGCAA+ 与 50 µL 细胞的混合液。将测得的 OD600 值乘以 20，得到诱导后细胞的真实 OD600。
    2. 将每个样品归一化至 3 × 107 个细胞，用于抗体染色和流式细胞分选（FACS）。使用公式 C1V1 = C2V2 计算从诱导瓶中转移的细胞体积。
      注：对于四点 NNS 饱和突变，理论文库大小为 106 个变异体。为充分覆盖文库，需筛选至少 10 倍文库大小的细胞数，即 107 个细胞。示例：若目标 C1V1 = 3 × 107 个细胞，C2 = 诱导后 OD600 为 6（即 6 × 107 个细胞/mL），则取 500 µL 诱导后的细胞（即 V2 = 3 × 107 个细胞 / 6 × 107 个细胞/mL = 500 µL）。
    3. 将计算好的细胞体积转移至 1.5 mL 离心管中，于 5,000 × g 离心 5 分钟。
    4. 弃上清，用 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）+ 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）重悬。
    5. 于 5,000 × g 离心 5 分钟，并重复步骤 3.2.4。
    6. 于 5,000 × g 离心 5 分钟，同时进行步骤 3.2.7。
    7. 在 1.5 mL 离心管中配制抗体染色混合液，包含抗 HA 荧光素异硫氰酸酯（FITC）（0.5 µg/107 个细胞）、抗 FLAG 藻红蛋白（PE）（0.05 µg/107 个细胞）以及 PBS + 0.5% BSA（100 µL/107 个细胞）。 将离心管置于冰上。 
    8. 弃上清，用染色混合液重悬细胞。每 3 × 107 个细胞使用 300 µL 染色混合液。禁止涡旋震荡，仅可轻柔颠倒或弹击混匀。
    9. 重悬后，将细胞置于冰上避光孵育 1 小时。
  3. 染色后洗涤
    1. 将染色后的细胞于 5,000 × g 离心 5 分钟。弃上清，用含 0.5% BSA 的 PBS 重悬沉淀，每 1 × 107 个细胞使用 0.5 mL（例如，1 × 107 个细胞用 500 µL，3 × 107 个细胞用 1.5 mL）。
    2. 于 5,000 × g 离心 5 分钟。弃上清，用 750 µL PBS + 0.5% BSA 重悬。
    3. 另取 750 µL PBS + 0.5% BSA 加入 10 mL 收集管中。
  4. 流式细胞分选（FACS）
    1. 为新实验完成细胞仪必要的启动和准备工作。
    2. 创建三个散点图。在第一个散点图中，X 轴选择前向散射面积（FSC-A）通道，Y 轴选择侧向散射面积（SSC-A）通道。
      注：此图有助于选择活细胞。
    3. 保持 X 轴为 FSC-A 通道，将第二个散点图的 Y 轴通道改为前向散射高度（FSC-H）。
      注：此图有助于选择单细胞。
    4. 在第三个散点图中，X 轴选择 PE 通道，Y 轴选择 FITC 通道。
    5. 使用 530/30 nm（FITC）和 585/42 nm（PE）通道在细胞仪上运行阴性对照。使用 70-µm 喷嘴 在 70 psi 鞘液压力下进行分选。以 4000–5000 事件/秒的速度采集样本。
    6. 在第一个散点图（FSC-A 与 SSC-A）上，围绕完整酵母细胞的主要群体绘制多边形门，排除 FSC-A 和 SSC-A 信号较低的碎片和小颗粒。
    7. 在该门内，通过 FSC-H 与 FSC-A 散点图选择单细胞，选取 FSC-H 与 FSC-A 呈比例关系的线性群体，排除偏离线性分布的事件（对应双联体和细胞聚集体）。
      注：第三个散点图（PE 与 FITC）中，阴性对照（即表达完整底物盒的酵母细胞）将呈现一条对角线状的点簇。
    8. 运行样本，并根据目标 PE/FITC 值对酵母细胞进行分选，收集至收集管中。分析的细胞总数应至少为理论文库大小的 10 倍，以确保所有变异体得到充分代表（例如，对于理论多样性约为 1 × 106 个变异体的文库，应分析约 1 × 107 个细胞）。
    9. 将分选门设置在阴性对照群体 PE/FITC 对角线下方。
      注：更严格的门控可提高目标变异体的富集程度，但会降低细胞回收率。
  5. 分选后处理
    1. 将收集管于 3,200 × g 离心 5 分钟。小心弃去上清，保留 1 mL，然后用 5 mL PBS 重悬。
      注：保留 1 mL 上清，因为离心后底部的细胞沉淀可能不可见。
    2. 再次于 3,200 × g 离心 5 分钟。弃上清，保留 1 mL。用 4 mL SDCAA+ 重悬。
    3. 在 250 mL 锥形瓶中加入 15 mL SDCAA+。将步骤 3.5.2 中重悬的细胞转移至该瓶中。
    4. 于 30 °C、270 rpm 振荡培养 18–24 小时。
    5. 每轮定向进化均重复步骤 3.1、3.2、3.3 和 3.4。

4. 质粒回收及单个克隆的测序

  1. 培养单个菌落
    1. 在步骤3.5.4之后，取500 µL液体培养物与500 µL无菌50%甘油混合，制备成25%甘油保存液。涡旋振荡以充分混匀细胞。
    2. 在 –80 °C 冰箱中过夜保存。如需长期保存，转移至液氮中。
    3. 使用无菌的1000 µL枪头刮取甘油菌种，混入100 µL SDCAA+培养基中。将该混合液涂布于SDCAA平板，于30 °C倒置培养。
    4. 3天后挑取菌落，用1.5 mL SDCAA+培养基在14 mL试管中过夜培养。
  2. 进行酵母小提实验以提取质粒
    1. 通过在 16,000 × g 条件下离心，沉淀过夜培养物 g 孵育1分钟，然后用酵母质粒纯化试剂盒中的溶液1重悬于200 µL中。
    2. 加入5 µL裂解酶溶液（5 U/µL）。
    3. 在37 °C培养箱中于旋转摇床上孵育4小时。
    4. 进行一次冻融循环：在 -80 °C 下冷冻 20 分钟，随后在水浴中 42 °C 下解冻 10 分钟。
    5. 加入酵母质粒纯化试剂盒中的溶液2 200 µL，倒置混匀2–3次，静置5分钟。
    6. 加入400 µL酵母质粒纯化试剂盒中的溶液3，通过倒置混匀2–3次。在16,000 × g 用于 5 分钟
    7. 使用具有高DNA结合容量柱的质粒DNA纯化试剂盒进行纯化。
      注意：由于裂解细胞会产生大量剪切的酵母基因组DNA，因此需要使用DNA结合容量较高的硅胶柱（35 µg），而不是低容量的酵母质粒DNA纯化柱（5 µg）。15.
    8. 使用分光光度计测定DNA浓度。DNA得率为10–30 ng/µL。
  3. 将纯化的质粒转化至化学感受态细胞中 E. coli 细胞
    1. 按照配方制备 SOC 培养基 表5以及含氯霉素的LB平板。同时，将水浴预热至42 °C。
    2. 将每个质粒对应的LB-氯霉素平板在37 °C预热20分钟。
    3. 从–80 °C冰箱中取出一管感受态细胞，在冰上解冻。
    4. 将每种质粒的30 µL感受态细胞分装至冰上的1.5 mL离心管中。
    5. 将3 µL质粒加入感受态细胞中，轻轻振荡混匀，冰上静置5分钟。
    6. 将细胞在42 °C水浴中短暂孵育40 s以进行热激。
    7. 冰上孵育 2 分钟。
    8. 向细胞中加入 300 µL SOC 培养基，于 37 °C、220 rpm 条件下孵育 15 分钟。
    9. 将50–100 µL感受态细胞转化产物接种至预热的培养皿上。
    10. 将培养皿倒置于37 °C培养18小时。
  4. 菌落挑选
    1. 向14 mL圆底培养管中加入5 mL液体LB-氯霉素培养基。
    2. 使用无菌的1000 µL枪头挑取单克隆，放入培养管中。
    3. 将试管置于摇床中（37 °C，220 rpm，倾斜角30°–45°以最大化通气）振荡培养18 h。
  5. 从细菌液体培养物中提取质粒
    1. 将液体培养物在 3,200 × g 4 分钟后，倾去上清液。
    2. 使用质粒纯化试剂盒从过夜培养物中提取质粒。
    3. 使用分光光度计测定纯化质粒的浓度。
  6. 提交质粒进行测序
    注意：可使用全质粒纳米孔测序等服务，或采用在突变区域侧翼设计引物的Sanger测序方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

高效的文库构建对于确保突变空间的充分覆盖至关重要。为避免丢失稀有的功能性变异体，转化子的数量应至少达到理论文库大小的10至100倍。由于酿酒酵母（S. cerevisiae）的转化效率受细胞浓度影响，并在对数生长早期至中期达到最高16，我们在电穿孔前优化了初始细胞密度。酵母培养物以初始OD600 值在1.0–4.0范围内进行传代培养，并孵育4小时（n = 2–4次独立的生物学实验），随后将最终的OD600 值映射到酿酒酵母（S. cerevisiae）的生长曲线上，以确认细胞仍处于对数生长中期（图5A，补充图1）。

用4 µg质粒DNA对这些培养物进行电穿孔（n = 2次独立的生物学实验）显示，不同初始OD600条件下转化效率存在显著差异（单因素方差分析，p = 8.92 × 10−7）。与起始OD

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

定向进化是一种高通量方法，通过多样化和筛选的迭代循环，识别具有增强或新型生化功能的蛋白质17。在本实验方案中，我们详细描述了一种优化的工作流程，利用酿酒酵母（S. cerevisiae）的细胞表面展示系统来进化蛋白酶与底物之间的识别能力。该表面展示系统将蛋白酶活性转化为可检测的基于荧光的表型，从而实现基于流式细胞分选（FACS）的目标克隆富集。我们提供了蛋白酶文库和底物盒构建、高效电穿孔、FACS设门与分选，以及最终蛋白酶变异体测序的详细步骤。

定向进化中最关键的步骤之一是确保文库具有足够的多样性，并能充分覆盖潜在的突变谱17。我们的电穿孔效率实验表明，初始亚培养物在 OD600 为 3.0 时可获得最高的转化效率，超过 109 CFU。通过优化的酵母电穿孔技术实现的这一转化规模，显著高于传统的化学转化方法，从而能够充分覆盖大规模组合文库8,<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无竞争利益。支持本方案的原始数据，包括Nanopore测序FASTQ文件、流式细胞术（FCS）文件、用于生成图表和表格的源数据，以及质粒pDD1523和pDD1524，均已存入Zenodo，可公开获取，网址为10.5281/zenodo.20746804

致谢

感谢丁实验室所有成员提供的建议、专业知识和讨论。同时感谢德克萨斯大学达拉斯分校（UTD）流式细胞术核心设施提供的基础设施和技术支持。M.B.L. 受德克萨斯大学达拉斯分校尤金·麦克德莫特研究生奖学金资助。本研究得到了德克萨斯大学达拉斯分校启动基金以及美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH-NIGMS）对P.C.D.P.D.实验室的资助（项目编号：R35GM150967）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
10 mM dNTP混合液NEBN0447SPCR 反应（表 1，表 3）
10倍浓度 PBS，pH 7.4FisherBP3994染色缓冲液基础（步骤 3.2–3.3)
5X Q5反应缓冲液NEBB9027S单独出售；也可与 Q5 聚合酶一同提供
琼脂，BactoBD Difco281230-500gSDCAA 琼脂平板（表5）；15 g/L
琼脂糖（低电渗/多用途/分子生物学级）Fisher BioReagentsBP160-500凝胶电泳
抗FLAG PE抗体BioLegend637309FACS 染色；PE 标记的抗 FLAG 抗体
抗HA标签抗体 [FITC]GenScriptA01621FACS 染色；FITC 标记的抗 HA 抗体
Bacto 胨䏡氨基酸BD Difco223120SDCAA+、SGCAA+、SCAA 培养基（表5）；5 g/L
胰蛋白胨 / 胰酪蛋白胨RPIT60060-10000.0LB/SOB 培养基制备；在 YPD 中配制成 20 g/L（表 5）
BSA，牛血清白蛋白，第五组分Sigma-Aldrich126575-10GM0.5% PBS；染色缓冲液（步骤 3.2–3.3)
BsmBI-v2（200 U）NEBR0739S底物盒的Golden Gate组装（表8）
氯化钙溶液（1 M）Sigma-Aldrich21115-100mL电穿孔缓冲液：终浓度 1 mM（表 5）
ColiRollers® 包被珠子Sigma-Aldrich71013-3通过将试剂瓶放入高压灭菌器中，在121℃下灭菌ºC，15 psi，15 分钟。
D-半乳糖赛默飞世尔科技A12813.30250 g；用于SGCAA+诱导的20% w/v 储液（表5）
D-山梨醇赛默飞世尔科技1327300.10电穿孔缓冲液（1 M）和扩增培养基（表5）
无水葡萄糖（D-葡萄糖）Sigma-AldrichG8270-1KGYPD、SDCAA+、20% w/v 葡萄糖储备液（表5）
Difco 酵母氮源基础培养基（不含氨基酸）SigmaY0626-250G6.7 g/L（SDCAA/SGCAA，表5）
Difco YPD 肉汤（预混型）BD242820-500g预混YPD替代培养基；500 g
DL-二硫苏糖醇（DTT）Sigma-AldrichD0632-1G平衡缓冲液：终浓度 10 mM；分装 250 μL，储存 −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR 纯化试剂盒Omega Bio-tekD6492-02PCR产物纯化
E.Z.N.A. 胶回收试剂盒Omega Bio-tekD2500-01PCR后及限制性酶切后的凝胶纯化（步骤1.1.8、1.3.2）
E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 IOmega Bio-tekD6942-02质粒纯化（步骤 4.2）
甘油（Glycerol）≥99%)FisherBP229-450% v/v 甘油保存液原液（步骤 4.1.1）
硫酸卡那霉素 FisherBP906-5SDCAA+ 和 SGCAA+：50 μg/mL 终浓度；替代 Sigma K0879-5G
KLD 酶混合液NEBM0554S激酶-连接酶-DpnI；定点诱变
KLD反应缓冲液NEBB0554A与 KLD 酶混合物一起使用
LB培养基（Lennox）Sigma-AldrichL3022-1KG大肠杆菌液体培养
乙酸锂二水合物（LiOAc·2H2O赛默飞世尔科技A17921.30预处理缓冲液：终浓度 0.1 M；在加入 DTT 前添加（表 5）
Luria 琼脂（Luria-Bertani 琼脂）RPIL24020-2000.0大肠杆菌涂布平板；替代 Sigma LB 琼脂 Lennox L2897-1KG
OmniPur 酪蛋白氨基酸Sigma2240-500GM替代性酪蛋白氨基酸来源
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo.20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI；Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo.20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液康宁30-002-CISDCAA+、SGCAA+：终浓度1X
PstI-HF（5000 U）NEBR3140S载体线性化（表10）；使用HF版本
Q5 HF DNA聚合酶NEBM0492S高保真聚合酶；Q5热启动的替代选择
Q5 高GC增强剂NEBB9028A高GC含量PCR反应
Q5热启动DNA聚合酶NEBM0491LPCR 组装与扩增（表1，表3）
rCutSmart 缓冲液 (10X)NEBB6004S随 PstI-HF 和 SphI-HF 一起提供（表 10）
SalI-HFNEBR3138L额外的限制性内切酶
SOC培养基NEBB9020S转化后恢复
氯化钠（NaCl）FisherS271-1LB/SOB 培养基制备
氢氧化钠（NaOH）FisherS318-500培养基 pH 调节
磷酸氢二钠（Na2HPO4)Sigma-AldrichS9763-500GSDCAA 平板，SCAA 培养基：38 mM（表 5）
磷酸二氢钠，无水物VWR (BDH)BDH4542-1KGPSDCAA 培养基，SCAA 培养基：62 mM；替代 NaH2PO4·H2O 一水合物
SphI-HF（1000 U）NEBR3182SPstI-HF（表10）介导的载体线性化
链霉素Life Technologies / SigmaS6501-5g抗生素
T4 DNA连接酶缓冲液（10X）NEBB0202S表6
T4 多核苷酸激酶（500 U）NEBM0201S表6
T7 DNA连接酶（3000 U/mL）NEBM0318S表8
酵母提取物RPIY20020-5000.0YPD（10 g/L）和LB/SOB培养基
Zymolyase（1000 U）Zymo ResearchE1004-A酵母细胞壁消化以提取质粒（步骤 4.2.2）
Zymoprep 酵母质粒小提 IIZymo ResearchD2004酵母质粒提取；包括溶液1、2、3（步骤4.2）
ZymoPURE II 质粒中量提取试剂盒Zymo ResearchD4201-B中等规模质粒制备；适用于大体积样品的制备
<强>仪器与耗材
一次性比色皿，1.5 mLFisher14-955-127用于测量液体培养物的OD600
锥形瓶，125 mLVWR10536-912预培养与诱导培养
锥形瓶，250 mLVWR10536-914酵母菌继代培养
锥形瓶，250 mLVWR75809-646宽口变体
500 mL 锥形瓶VWR10536-926主预培养烧瓶（步骤 2.3.1、2.4.3）
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Falcon352070细胞洗涤，整个实验过程中均需离心
流式细胞分选仪：BD FusionBD 生物科学FACSAria Fusion 流式细胞仪（目录编号不适用）用于荧光激活细胞分选（FACS）
Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙伯乐（Bio-Rad）1652086EBY100电转感受态细胞的电穿孔
GenePulser Xcell 电穿孔系统伯乐（Bio-Rad）1652660仪器；2.5 kV，25 μF, 200 Ω （步骤 2.7.6）
新不伦瑞克 Innova 40R - 台式轨道摇床EppendorfM12990084酵母液体培养孵育
培养皿，100 mmFisherFB0875712YPD 和 SDCAA 琼脂平板
SpectraMax QuickDrop 紫外-可见分光光度计Molecular DevicesSpectraMax QuickDrop用于测量液体培养物的OD600和DNA浓度
Vacufuge plusEppendorf2231001204用于浓缩 DNA
<强>软件
BD FACSDiva（版本：8.0）BD 生物科学https://www.bdbiosciences.com/zh-cn/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software用于流式细胞仪及应用设置、数据采集和数据分析的工具集合
Benchling（版本：基于网络的平台，持续更新）Benchling, Inc.https://www.benchling.com/序列设计软件
SnapGene（版本：8.0.1）SnapGene, Inc.https://www.snapgene.com/序列设计软件

参考文献

  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

234 234 Y

本文已发表

视频即将推出

联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。