本方案提供了利用基于表面展示的选择系统在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中对病毒蛋白酶进行定向进化的优化工作流程。该流程涵盖了DNA插入片段文库和底物盒的设计、适用于高效转化的电穿孔条件、基于荧光激活细胞分选的蛋白酶切割选择，以及富集突变体的测序分析。
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本方案提供了利用基于表面展示的选择系统在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中对病毒蛋白酶进行定向进化的优化工作流程。该流程涵盖了DNA插入片段文库和底物盒的设计、适用于高效转化的电穿孔条件、基于荧光激活细胞分选的蛋白酶切割选择，以及富集突变体的测序分析。
定向进化在快速且受控的实验室环境中模拟自然进化过程，以获得具有理想功能或特性的蛋白质。通过筛选大量突变体蛋白质编码基因库，可实现对适用于生物技术、医学和合成生物学应用的所需变异体的功能性选择。利用本方案，我们在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中进行定向进化，以改造蛋白酶变体，使其对非天然底物序列具有高特异性。我们将这些蛋白酶变体展示在酵母细胞表面，从而通过多轮富集的荧光激活细胞分选（FACS）实现对目标变体的筛选。底物盒的四个关键元件与蛋白酶文库共同表达：一个融合蛋白，包含（i）酵母黏附受体亚基Aga2，（ii）筛选和（iii）反向筛选底物序列，（iv）表位标签序列，以及一个可选的内质网（ER）回收信号序列。仅切割了筛选底物序列的酵母细胞，可通过多色FACS结合荧光标记（藻红蛋白/异硫氰酸荧光素标记）的抗表位抗体进行分离。本文提供了开展蛋白酶定向进化实验的优化后逐步操作方案，包括DNA插入片段文库设计和底物盒设计、高效转化（每微克DNA可获得高达109个转化子）的酵母细胞电穿孔、基于FACS的筛选与富集，以及进化变体的测序分析。我们以烟草蚀刻病毒核包含体A蛋白酶（TEVp）为例，演示本定向进化方案，将其底物特异性从天然序列ENLYFQ↓S进化为新序列ENLYFE↓S。
Potyviridae 科的半胱氨酸蛋白酶，特别是核包含体A（NIa）蛋白酶，是一类尚未被充分开发的序列特异性内肽酶资源。该科已鉴定的成员超过3800种，NIa蛋白酶可特异性切割一个独特的七氨基酸底物序列。马铃薯Y病毒科为构建可编程蛋白质调控系统、设计正交蛋白酶遗传回路以及开发序列特异性的生物技术工具提供了多样化的蛋白酶资源1,2。尽管自然界中存在丰富的多样性，目前仅有两种NIa蛋白酶——烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEVp）和烟草脉斑花叶病毒蛋白酶（TVMVp）——被系统表征并被广泛改造用于实验室及生物技术应用3,4。这一有限的蛋白酶工具集限制了需要多种正交蛋白酶活性的多组分回路的设计空间5，从而推动了通过定向进化手段进一步拓展和表征NIa蛋白酶的研究工作6,7。
酵母表面展示技术已成为定向进化领域最强大的平台之一，可通过荧光激活细胞分选（FACS）实现高通量蛋白文库筛选6,
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所有涉及重组酿酒酵母（S. cerevisiae）的实验均依照德克萨斯大学达拉斯分校机构生物安全与化学安全委员会的政策和程序进行。重组酵母菌株的操作在生物安全一级（BSL-1）防护条件下进行，并遵循既定的机构微生物操作规范。电穿孔、培养及荧光激活细胞分选（FACS）均按照批准的机构生物安全程序执行。酵母培养物及受污染的一次性耗材均依照机构指南作为生物危害废物进行去污和处理。
1. 载体与插入片段的制备
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高效的文库构建对于确保突变空间的充分覆盖至关重要。为避免丢失稀有的功能性变异体，转化子的数量应至少达到理论文库大小的10至100倍。由于酿酒酵母（S. cerevisiae）的转化效率受细胞浓度影响，并在对数生长早期至中期达到最高16，我们在电穿孔前优化了初始细胞密度。酵母培养物以初始OD600 值在1.0–4.0范围内进行传代培养，并孵育4小时（n = 2–4次独立的生物学实验），随后将最终的OD600 值映射到酿酒酵母（S. cerevisiae）的生长曲线上，以确认细胞仍处于对数生长中期（图5A，补充图1）。
用4 µg质粒DNA对这些培养物进行电穿孔（n = 2次独立的生物学实验）显示，不同初始OD600条件下转化效率存在显著差异（单因素方差分析，p = 8.92 × 10−7）。与起始OD
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定向进化是一种高通量方法，通过多样化和筛选的迭代循环，识别具有增强或新型生化功能的蛋白质17。在本实验方案中，我们详细描述了一种优化的工作流程，利用酿酒酵母（S. cerevisiae）的细胞表面展示系统来进化蛋白酶与底物之间的识别能力。该表面展示系统将蛋白酶活性转化为可检测的基于荧光的表型，从而实现基于流式细胞分选（FACS）的目标克隆富集。我们提供了蛋白酶文库和底物盒构建、高效电穿孔、FACS设门与分选，以及最终蛋白酶变异体测序的详细步骤。
定向进化中最关键的步骤之一是确保文库具有足够的多样性，并能充分覆盖潜在的突变谱17。我们的电穿孔效率实验表明，初始亚培养物在 OD600 为 3.0 时可获得最高的转化效率，超过 109 CFU。通过优化的酵母电穿孔技术实现的这一转化规模，显著高于传统的化学转化方法，从而能够充分覆盖大规模组合文库8,<.......
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作者声明无竞争利益。支持本方案的原始数据，包括Nanopore测序FASTQ文件、流式细胞术（FCS）文件、用于生成图表和表格的源数据，以及质粒pDD1523和pDD1524，均已存入Zenodo，可公开获取，网址为10.5281/zenodo.20746804
感谢丁实验室所有成员提供的建议、专业知识和讨论。同时感谢德克萨斯大学达拉斯分校（UTD）流式细胞术核心设施提供的基础设施和技术支持。M.B.L. 受德克萨斯大学达拉斯分校尤金·麦克德莫特研究生奖学金资助。本研究得到了德克萨斯大学达拉斯分校启动基金以及美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH-NIGMS）对P.C.D.P.D.实验室的资助（项目编号：R35GM150967）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| 10 mM dNTP混合液 | NEB | N0447S | PCR 反应（表 1，表 3） |
| 10倍浓度 PBS，pH 7.4 | Fisher | BP3994 | 染色缓冲液基础（步骤 3.2–3.3) |
| 5X Q5反应缓冲液 | NEB | B9027S | 单独出售；也可与 Q5 聚合酶一同提供 |
| 琼脂，Bacto | BD Difco | 281230-500g | SDCAA 琼脂平板（表5）；15 g/L |
| 琼脂糖（低电渗/多用途/分子生物学级） | Fisher BioReagents | BP160-500 | 凝胶电泳 |
| 抗FLAG PE抗体 | BioLegend | 637309 | FACS 染色；PE 标记的抗 FLAG 抗体 |
| 抗HA标签抗体 [FITC] | GenScript | A01621 | FACS 染色；FITC 标记的抗 HA 抗体 |
| Bacto 胨䏡氨基酸 | BD Difco | 223120 | SDCAA+、SGCAA+、SCAA 培养基（表5）；5 g/L |
| 胰蛋白胨 / 胰酪蛋白胨 | RPI | T60060-10000.0 | LB/SOB 培养基制备；在 YPD 中配制成 20 g/L（表 5） |
| BSA，牛血清白蛋白，第五组分 | Sigma-Aldrich | 126575-10GM | 0.5% PBS；染色缓冲液（步骤 3.2–3.3) |
| BsmBI-v2（200 U） | NEB | R0739S | 底物盒的Golden Gate组装（表8） |
| 氯化钙溶液（1 M） | Sigma-Aldrich | 21115-100mL | 电穿孔缓冲液：终浓度 1 mM（表 5） |
| ColiRollers® 包被珠子 | Sigma-Aldrich | 71013-3 | 通过将试剂瓶放入高压灭菌器中，在121℃下灭菌ºC，15 psi，15 分钟。 |
| D-半乳糖 | 赛默飞世尔科技 | A12813.30 | 250 g；用于SGCAA+诱导的20% w/v 储液（表5） |
| D-山梨醇 | 赛默飞世尔科技 | 1327300.10 | 电穿孔缓冲液（1 M）和扩增培养基（表5） |
| 无水葡萄糖（D-葡萄糖） | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | YPD、SDCAA+、20% w/v 葡萄糖储备液（表5） |
| Difco 酵母氮源基础培养基（不含氨基酸） | Sigma | Y0626-250G | 6.7 g/L（SDCAA/SGCAA，表5） |
| Difco YPD 肉汤（预混型） | BD | 242820-500g | 预混YPD替代培养基；500 g |
| DL-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | D0632-1G | 平衡缓冲液：终浓度 10 mM；分装 250 μL，储存 −20°C |
| E.Z.N.A. CyclePure PCR 纯化试剂盒 | Omega Bio-tek | D6492-02 | PCR产物纯化 |
| E.Z.N.A. 胶回收试剂盒 | Omega Bio-tek | D2500-01 | PCR后及限制性酶切后的凝胶纯化（步骤1.1.8、1.3.2） |
| E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 I | Omega Bio-tek | D6942-02 | 质粒纯化（步骤 4.2） |
| 甘油（Glycerol）≥99%) | Fisher | BP229-4 | 50% v/v 甘油保存液原液（步骤 4.1.1） |
| 硫酸卡那霉素 | Fisher | BP906-5 | SDCAA+ 和 SGCAA+：50 μg/mL 终浓度；替代 Sigma K0879-5G |
| KLD 酶混合液 | NEB | M0554S | 激酶-连接酶-DpnI；定点诱变 |
| KLD反应缓冲液 | NEB | B0554A | 与 KLD 酶混合物一起使用 |
| LB培养基（Lennox） | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | 大肠杆菌液体培养 |
| 乙酸锂二水合物（LiOAc·2H2O | 赛默飞世尔科技 | A17921.30 | 预处理缓冲液：终浓度 0.1 M；在加入 DTT 前添加（表 5） |
| Luria 琼脂（Luria-Bertani 琼脂） | RPI | L24020-2000.0 | 大肠杆菌涂布平板；替代 Sigma LB 琼脂 Lennox L2897-1KG |
| OmniPur 酪蛋白氨基酸 | Sigma | 2240-500GM | 替代性酪蛋白氨基酸来源 |
| pDD1523 | Zenodo | 10.5281/zenodo.20746804 | pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI；Gal1-Aga2-sfGFP |
| pDD1524 | Zenodo | 10.5281/zenodo.20746804 | pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS |
| 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液 | 康宁 | 30-002-CI | SDCAA+、SGCAA+：终浓度1X |
| PstI-HF（5000 U） | NEB | R3140S | 载体线性化（表10）；使用HF版本 |
| Q5 HF DNA聚合酶 | NEB | M0492S | 高保真聚合酶；Q5热启动的替代选择 |
| Q5 高GC增强剂 | NEB | B9028A | 高GC含量PCR反应 |
| Q5热启动DNA聚合酶 | NEB | M0491L | PCR 组装与扩增（表1，表3） |
| rCutSmart 缓冲液 (10X) | NEB | B6004S | 随 PstI-HF 和 SphI-HF 一起提供（表 10） |
| SalI-HF | NEB | R3138L | 额外的限制性内切酶 |
| SOC培养基 | NEB | B9020S | 转化后恢复 |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher | S271-1 | LB/SOB 培养基制备 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Fisher | S318-500 | 培养基 pH 调节 |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S9763-500G | SDCAA 平板，SCAA 培养基：38 mM（表 5） |
| 磷酸二氢钠，无水物 | VWR (BDH) | BDH4542-1KGP | SDCAA 培养基，SCAA 培养基：62 mM；替代 NaH2PO4·H2O 一水合物 |
| SphI-HF（1000 U） | NEB | R3182S | PstI-HF（表10）介导的载体线性化 |
| 链霉素 | Life Technologies / Sigma | S6501-5g | 抗生素 |
| T4 DNA连接酶缓冲液（10X） | NEB | B0202S | 表6 |
| T4 多核苷酸激酶（500 U） | NEB | M0201S | 表6 |
| T7 DNA连接酶（3000 U/mL） | NEB | M0318S | 表8 |
| 酵母提取物 | RPI | Y20020-5000.0 | YPD（10 g/L）和LB/SOB培养基 |
| Zymolyase（1000 U） | Zymo Research | E1004-A | 酵母细胞壁消化以提取质粒（步骤 4.2.2） |
| Zymoprep 酵母质粒小提 II | Zymo Research | D2004 | 酵母质粒提取；包括溶液1、2、3（步骤4.2） |
| ZymoPURE II 质粒中量提取试剂盒 | Zymo Research | D4201-B | 中等规模质粒制备；适用于大体积样品的制备 |
| <强>仪器与耗材 | |||
| 一次性比色皿，1.5 mL | Fisher | 14-955-127 | 用于测量液体培养物的OD600 |
| 锥形瓶，125 mL | VWR | 10536-912 | 预培养与诱导培养 |
| 锥形瓶，250 mL | VWR | 10536-914 | 酵母菌继代培养 |
| 锥形瓶，250 mL | VWR | 75809-646 | 宽口变体 |
| 500 mL 锥形瓶 | VWR | 10536-926 | 主预培养烧瓶（步骤 2.3.1、2.4.3） |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | Falcon | 352070 | 细胞洗涤，整个实验过程中均需离心 |
| 流式细胞分选仪：BD Fusion | BD 生物科学 | FACSAria Fusion 流式细胞仪（目录编号不适用） | 用于荧光激活细胞分选（FACS） |
| Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙 | 伯乐（Bio-Rad） | 1652086 | EBY100电转感受态细胞的电穿孔 |
| GenePulser Xcell 电穿孔系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 1652660 | 仪器；2.5 kV，25 μF, 200 Ω （步骤 2.7.6） |
| 新不伦瑞克 Innova 40R - 台式轨道摇床 | Eppendorf | M12990084 | 酵母液体培养孵育 |
| 培养皿，100 mm | Fisher | FB0875712 | YPD 和 SDCAA 琼脂平板 |
| SpectraMax QuickDrop 紫外-可见分光光度计 | Molecular Devices | SpectraMax QuickDrop | 用于测量液体培养物的OD600和DNA浓度 |
| Vacufuge plus | Eppendorf | 2231001204 | 用于浓缩 DNA |
| <强>软件 | |||
| BD FACSDiva（版本：8.0） | BD 生物科学 | https://www.bdbiosciences.com/zh-cn/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software | 用于流式细胞仪及应用设置、数据采集和数据分析的工具集合 |
| Benchling（版本：基于网络的平台，持续更新） | Benchling, Inc. | https://www.benchling.com/ | 序列设计软件 |
| SnapGene（版本：8.0.1） | SnapGene, Inc. | https://www.snapgene.com/ | 序列设计软件 |
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