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测量果蝇（Drosophila melanogaster）中DNA双链断裂修复的DR-white检测方法

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DOI：

10.3791/72635

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2026年8月14日

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

本文内容

摘要

DR-white 检测是一种多功能的遗传报告基因检测方法，用于检测多细胞生物黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中DNA双链断裂修复的结果。

摘要

传统的DNA双链断裂（DSB）修复研究通常局限于生化分析或单细胞系统（如细胞、酵母）。为了促进在多细胞生物体中开展DSB修复的研究，我们采用DR-白色 检测在 黑腹果蝇. DR-白色 该检测是一种简单且多功能的DSB修复报告检测，含有一段单一的I-SceI识别序列，可通过表达I-SceI酶进行切割 I-SceI 巨核酸酶。表达 I-SceI 可通过组成型表达、热激或其它启动子诱导，从而实现对组织特异性或发育阶段特异性修复的研究。该检测方法的主要优势在于能够区分同源重组（HR）、非同源末端连接（NHEJ）和单链退火（SSA）等不同修复结果。本文提供了已建立的DR-白色 检测，包括在减数分裂前生殖系中诱导DNA双链断裂（DSBs）并通过对后代进行表型评分来分析修复事件的逐步操作流程。此外，还描述了通过聚合酶链式反应（PCR）、测序以及使用TIDE（Tracking of Indels by DEcomposition）R脚本对修复事件进行分子分析的方法。本方案为在模式生物中研究DNA修复的遗传与分子机制提供了有力工具。

引言

基因组完整性经常受到DNA损伤的威胁，其中双链断裂（DSBs）尤其具有毒性。若未得到修复，这些断裂可导致遗传物质丢失、染色体重排以及细胞死亡1因此，细胞进化出了多种修复双链断裂（DSBs）的途径。非同源末端连接（NHEJ）可直接连接DSB的两个末端，但可能在断裂位点引入插入或缺失（indels）；单链 单链退火（SSA）利用断裂位点侧翼的互补序列进行修复，导致断裂位点处发生缺失；而同源重组（HR）则利用同源序列作为修复模板2,3.

传统上，对DNA双链断裂（DSB）修复的研究局限于生化检测4或单细胞系统，例如细菌5,6、酵母7,8以及哺乳动物细胞培养9,10。尽管这些模型在鉴定核心修复蛋白及其作用机制方面发挥了关键作用，但它们缺乏多细胞生物所具有的生物学复杂性。Drosophila melanogaster 已成为研究DNA修复的一种常用多细胞模型系统。然而，目前许多检测方法仅针对特定的修复通路11；依赖于较大的染色体畸变，例如P因子切除12；或需要耗时的分子分析13。DR-white 检测通过提供一种简单且基于遗传报告的系统，用于在 Drosophila 中检测DNA修复，从而克服了上述挑战14。本研究提供了一套完整、实用且详细的逐步操作流程，用于开展遗传学和分子生物学实验，以利用已建立的DR-white 检测方法定量分析DNA双链断裂修复能力。

该实验利用了两个直接重复的Drosophila white（w）基因，该基因赋予野生型红眼表型（图1）。这两个拷贝均无功能：第一个为Sce.white，其在野生型SacI位点处插入了一段包含I-SceI归巢核酸内切酶识别序列的片段，并引入了一个提前终止密码子；第二个为iwhite，在5’和3’端均被截短，作为同源重组（HR）修复的模板。两个white重复序列之间包含一个Drosophila yellow转基因（y+），该基因赋予野生型棕体表型。由于DR-white表达盒被整合到y w突变体背景下，DR-white果蝇在表型上表现为野生型棕体和突变型白眼。

通过将DR-white果蝇与携带I-SceI转基因的果蝇杂交，可在Sce.white位点诱导产生双链断裂（DSBs）。通过检测测试杂交后代的表现型，可测量减数分裂前生殖细胞中DSB的修复情况。若通过NHEJ方式进行修复，则后代表现为亲本型的棕体白眼表型（图1A）；而若通过HR方式进行修复，则white基因的野生型序列得以恢复，产生棕体红眼的后代（图1B）。若DSB通过SSA方式修复或发生有丝分裂交换，则中间的yellow转基因会丢失，从而产生黄体白眼果蝇（图1C）。为了分析体细胞中的修复结果，我们改进了基于分解追踪插入缺失（Tracking Indels by DEcomposition, TIDE）算法，专门用于在DR-white检测体系中识别伴随加工的NHEJ修复及HR修复事件15,16。

DR-white 检测法相较于先前建立的果蝇（Drosophila）DNA修复检测方法具有多项优势。由于DNA断裂在生殖系中产生并被修复，因此可通过表型分析简便地检测修复结果。同时，该检测方法具有极高的灵活性。尽管该检测主要用于测量同源重组（HR）修复，但它能够检测全部三种DNA修复通路。我们还开发了另外两种具有功能的修复模板（图2）。iwhite.mu 模板包含28个沉默的单核苷酸多态性（SNPs），并产生红眼后代（图2A），有助于研究基因转换轨迹（GCT）长度以及在差异序列之间的同源重组修复14。 iwhiteΔ9 模板在野生型 SacI 位点处含有一个9个碱基对的缺失，产生橙眼后代（图2B）。这一特性使研究人员能够追踪来自不同模板的同源重组修复，是DR-white 检测法独有的特征15。

方案

1. DR-white 检测

  1. 遗传杂交（图3A）
    注意：有关标准的 Drosophila 培养和遗传学实验方案，请参阅 Ralph J. Greenspan 所著的"Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics"17。品系基因型信息见于材料表。
    1. 将果蝇维持在25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下，使用标准 Drosophila 食物培养，并撒上活性酵母。
    2. 设置五个热激管，每管将8–10只DR-white virgin雌蝇与3–5只携带I-SceI 转基因的雄蝇杂交（杂交1，图3A）。
      注意：可根据实验目的使用不同的I-SceI 转基因。本实验方案中采用hsp70-I-SceI 转基因以实现热激诱导11。为防止早期世代中出现I-SceI 的渗漏表达，必须确保DR-white 和I-SceI 转基因仅在本世代才组合到同一只果蝇中。
    3. 同一天，设置y w 品系的扩繁瓶作为测试蝇。三个扩繁瓶足以支持约60–80个测试杂交。
    4. 将热激管和y w 扩繁瓶在25 °C下培养3天。
    5. 第三天，将热激管和y w 扩繁瓶转移至新鲜食物中，作为备用组。
  2. 热激/双链断裂（DSB）诱导
    注意：若未使用热激可诱导的I-SceI 转基因，请跳至步骤1.2.5，该步骤通常在步骤1.1.5后3天进行。
    1. 将热激管在25 °C下继续培养3小时，以确保所有后代均已通过母源-合子转换阶段。
    2. 将原始管置于38 °C水浴中热激1小时。确保水位至少与棉塞底部齐平，以防幼虫爬出水面。
    3. 每15分钟监测一次水浴温度，保持在38 ± 0.5 °C范围内，因为诱导效率和修复结果依赖于热激的持续时间和温度。
    4. 将管子放回25 °C培养。
    5. 次日，在培养基中加入1/3片折叠的实验室擦拭纸以吸收多余水分。若培养基较干，可向擦拭纸上添加约100 µL水。向y w 扩繁瓶中加入棉塞。
    6. 将热激处理的管子在25 °C下继续培养6天，或直至果蝇开始羽化。
    7. 在翻转后3天清除备用管和扩繁瓶。在清除后约4天，向备用的y w 扩繁瓶中加入棉塞。
      注意：如有需要，备用管可按照步骤1.2.1至1.2.6进行热激处理，并按以下方法进行后续分析。
  3. 测试杂交
    1. 从羽化开始后第4–5天起收集携带DR-white 和I-SceI 转基因的热激果蝇，以减少发育阶段偏差。
      注意：成功经历热激并携带DR-white 和I-SceI 转基因的果蝇会表现出花斑眼表型，这是由于胚胎期和幼虫期发生的修复事件发育为成体组织所致。花斑程度并不总与生殖系修复事件相关，因此在选择用于测试杂交（步骤1.3.3）的实验果蝇时，不应将其作为决定性因素。
    2. 收集y w virgin雌蝇，持续5天。按预期样本数每份收集5只virgin雌蝇。一旦备用扩繁瓶中的果蝇开始羽化，即可从中收集。
    3. 设置测试管，每管将一只热激雄蝇与4–5只y w virgin雌蝇杂交（杂交2；图3A）。从步骤1.3.1汇总的果蝇中随机选取雄蝇，以减少发育阶段偏差。测试杂交在25 °C下培养。
      注意：为避免DR-white 与I-SceI 发生交换，通常分析雄性生殖系；但也可分析雌性后代。若分析雌性后代，则测试管中设置雌蝇:y w 雄蝇比例为2:5，并培养5–6天（下一步），以确保产卵量充足。
    4. 设置测试管4天后检查产卵情况，以评估何时应清除亲本。
      注意：需确认已产下足够卵以保证至少获得20只可评分的后代，但避免培养过度，否则果蝇易陷入培养基中。
    5. 当测试管准备就绪（测试杂交建立后最多4–5天），弃去亲本果蝇，并在培养基中加入1/3片折叠的实验室擦拭纸以吸收多余水分。
      注意：若需进一步分析（如分子基因分型），可在此时收集雄蝇。
    6. 将测试管在25 °C下继续培养5–6天。
  4. 表型评分
    注意：每个遗传实验条件（例如纯合突变体和杂合对照）通常设置约25个测试管。每个遗传实验重复2–3次，各管数据合并分析。
    1. 从首批果蝇开始羽化后约9天内，对杂交2的后代进行评分（图3A）。
    2. 使用CO2麻醉果蝇，或将其转移至无食物空管中，在-20 °C冷冻至少30分钟。
      注意：若果蝇已被冷冻，可在数天内完成评分。
    3. 将果蝇置于果蝇板上，观察并记录相应表型（图3A）。仅将包含至少20只可评分果蝇的管纳入数据集。
      1. 评分时，首先根据红色荧光蛋白阳性（RFP+）标记筛选携带DR-white 盒的果蝇，然后观察眼色和体色。
      2. 与DR-white 盒连锁的y+ 转基因导致体色呈中等棕色，非完全野生型。为区分无DSB/NHEJ（棕色体色； y+ w-）与SSA（黄色体色； y- w-），应将待测果蝇与不携带DR-white 染色体（RFP-）的y w 后代进行比较。SSA事件果蝇的黄色体色应与这些对照果蝇一致。体色更深（更偏棕色）的果蝇记为无DSB/NHEJ。
        注意：图3A 中描述的表型若出现偏差，可能提示污染，此类管不应纳入评分。虽然整只死亡果蝇可进行评分，但若表型无法判断，则应丢弃受损个体。

2. TIDE 分析（图 4）

  1. 基因组DNA（gDNA）提取18
    1. 收集携带 DR- 的热激果蝇（或幼虫）白色 和 I-SceI 转基因，如杂交1代的子代（图3A).
    2. 将单只果蝇放入1.5 mL微量离心管中，迅速冷冻（例如干冰/乙醇浴或液氮）。
      警告：操作干冰、液氮、乙醇、异丙醇及其他化学品时，须使用适当的个人防护装备，并遵循机构的安全操作规程。
      暂停点：  样品如需可于 -80 °C 保存，后续再行处理。若分析果蝇或幼虫，每个样本使用一只果蝇或一条幼虫。若分析较小组织（如脑、成虫盘），可合并多个样本以提高 DNA 产量。
    3. 使用电动匀浆器在50 µL缓冲液A（100 mM Tris-Cl，pH 7.5；100 mM乙二胺四乙酸[EDTA]；100 mM氯化钠；0.5%十二烷基硫酸钠[SDS]）中匀浆每个样品。
    4. 将样品置于65 °C水浴中孵育30分钟。
    5. 向每个样品中加入100 µL缓冲液B（1.4 M乙酸钾，4.3 M氯化锂），通过倒置试管短暂混匀。
      注意：若使用整只果蝇，可能需要更大的体积才能充分匀浆样品。若如此，需保持缓冲液A与缓冲液B的体积比为1:2。
    6. 将样品置于冰上孵育至少30分钟。
    7. 以约 16,000 x g 离心样品 g 4 °C 下离心 15 分钟。
    8. 将125 µL澄清上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中，避免混入任何沉淀。
    9. 每125 µL上清液加入100 µL室温100%异丙醇，通过倒置离心管短暂混匀。
    10. 以约 16,000 x g 离心样品 g 室温下持续10分钟。
    11. 吸除上清液，注意不要扰动DNA沉淀。
      注意：此阶段DNA沉淀可能不可见。将离心管放入微量离心机时需标记其方向，并在预期沉淀所在位置的对侧进行吸液。
    12. 用250 µL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，然后轻轻倒置离心管进行短暂混匀。
    13. 以约 16,000 x g 离心样品 g 4 °C下离心5分钟。
    14. 吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
      注意：乙醇洗涤后沉淀可能更明显。若不明显，请参见 注意 步骤 2.1.11。
    15. 将离心管敞口置于室温下，以挥发残留的乙醇。避免沉淀过度干燥，否则可能无法完全重悬。
    16. 加入20 µL无核酸酶水，于4 °C下静置过夜以使沉淀重新溶解。
      暂停点：如果DNA沉淀未完全溶解，可加入更多水。
    17. 次日，轻轻颠倒混匀管并测定DNA浓度。若不立即进行后续处理，将样品于-20 °C保存。
      注意：单只果蝇提取的产量通常约为 100 ng/µL。高质量的样品至关重要。A260/A280 吸光度应在 1.7 至 2.0 之间。超出此范围的数值可能提示存在蛋白质等污染物。A260/A230 应在2.0至2.2之间。超出此范围的值表明存在乙醇和缓冲盐等污染物。产量较低或质量较差的样品可能导致PCR扩增效果不佳。
  2. 聚合酶链式反应（PCR）
    1. 扩增跨越 Sce.white 通过使用100 ng基因组DNA和引物DR-进行PCR扩增白色_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) 和 DR-白色_8a（5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC）按照制造商说明操作。包含一个DR-白色 对照果蝇样品（即 DR-白色 亲本品系，无 I-SceI 转基因存在）。使用以下扩增条件：94 °C 预变性 3 min；{94 °C 变性 30 s；降落退火，起始 66 °C（每循环递减 0.5 °C），30 s；72 °C 延伸 30 s}，共 16 个循环；{94 °C 变性 30 s；58 °C 退火 30 s；72 °C 延伸 30 s}，共 20 个循环；72 °C 最终延伸 5 min；反应结束置于 12 °C 保存。
      注意：若使用不同的试剂，可能需要调整扩增循环条件。
    2. 在1% TAE-琼脂糖诊断凝胶上电泳约2 µL PCR产物，以确认Sce的扩增。白色预期扩增片段大小约为1.7 kb。
    3. PCR纯化 Sce.white 扩增子并测定DNA浓度。
    4. 使用引物DR对纯化的PCR产物进行测序白色_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC)
      注意：我们通常对接纯化的 PCR 产物 40 ng 进行测序，但具体用量可能因测序服务提供商的说明而有所不同。
  3. TIDE 分析
    注意：使用 TIDE R 脚本时产生的大多数错误均可追溯至代码格式不正确。
    1. 从 Bioconductor.org 下载所需的 R 软件包（即 sangerseqR 和 Biostrings）。使用搜索栏查找每个软件包的最新版本。
    2. 分析序列色谱图以确保其质量良好。仅分析在断裂位点前背景信号极低或无背景信号的色谱图。
    3. 下载序列迹线文件（使用 .ab1 文件扩展名），并将所有序列迹线文件放入同一个计算机文件夹中。尽量简化序列文件名（例如 F1、Het2、Hom3），以便于后续步骤中的脚本编辑。
    4. 打开 TIDE R 脚本（补充文件 1) 在 RStudio 集成开发环境（IDE；参见 材料表）。在源窗格中，找到以 Control 开头的行 <- (补充文件 2A）并准确输入控制序列文件名（包括 .ab1 扩展名），文件名需用引号括起。
      注意：“对照序列”是指来自亲本DR的PCR序列白色 无库存 I-SceI 转基因或诱导
    5. 找到以 samplename 开头的行 <- c（并在括号内输入每个样本序列文件的文件名（补充文件 2A）。包含 .ab1 扩展名，每个文件名用独立的引号括起，并用逗号分隔文件名。
    6. 将编辑好的 TIDE R 脚本文件保存到与待分析序列相同的文件夹中。文件名应尽量简单，以避免后续步骤中出现错误。
    7. 在集成开发环境（IDE）中，使用输出窗格中的“文件”选项卡导航到 TIDE 文件夹补充文件 2B).
    8. 点击 更多 下拉并选择 在此处打开新终端 (补充文件 2C）。控制台窗格（左下角）中将打开一个新的终端。
    9. 在新打开的终端中，输入“R”并按下 输入 (补充文件 2D).
    10. R 在终端中运行后，通过输入 source("TIDE_analysis.R"）并按压 进入 (补充文件 2E）。终端将运行脚本并生成图形化结果（补充文件 2F）以及包含每个样本原始数据的 .csv 文件（补充文件 2G 和 补充文件 3). 输出文件将保存在与R脚本和序列文件相同的文件夹中。
      注意：如果重新运行相同的 R 脚本，新生成的 .csv 文件将覆盖旧文件。若需对相同文件进行多次分析，请复制该文件夹。
    11. 通过打开每个 .csv 文件来分析数据。
      1. 将原始数据解释为样本序列中插入缺失突变（indels）的比例。同源重组基因转换将 I-SceI 识别序列转变为野生型 SacI 序列，产生典型的 23 bp 缺失；该脚本在输出结果底部单独一行报告此同源重组（HR）值补充文件 2G）。0-indel 值代表无双链断裂（DSB）或无插入缺失（indel）的非同源末端连接（NHEJ）。将所有其他插入缺失值相加，得到经过加工的NHEJ。经过加工的NHEJ与同源重组（HR）之和即为可检测到的双链断裂修复事件总数。
      2. 使用以下公式计算在可检测到的DSB修复事件中各修复途径所占比例：
        NHEJ 加工比例 = （发生加工的 NHEJ）/（发生加工的 NHEJ + HR）
        HR 比例 = (HR) / (经加工的 NHEJ + HR)
        注意：每次遗传学实验（例如纯合突变体和杂合对照）的每个条件下大约使用10–15个样本。每项遗传学实验重复2–3次，并合并个体数据。

结果

Drosophila Rad51 在同源重组修复中的作用需求

成功的种系实验应产生如图3A所示的预期表型类别，且每管至少有20个可评分的后代。若出现非预期表型或可评分后代少于20个，表明存在污染或产率不足，应按照步骤1.4.3的规定予以排除。对于TIDE分析，成功的样本应产生约1.7 kb的扩增片段，且在断裂位点前的色谱图背景信号较低；产量低或DNA污染以及信噪比较高的色谱图属于次优结果，不应进行分析。

当使用DR-白色 热激诱导I-SceI来源的检测中，野生型果蝇的同源重组修复频率为38.5 ± 1.2%（均值 ± 标准误），而单链退火发生的频率约为3.2 ± 0.35%图3B 和 补充文件 4）。Rad51（由同源基因编码 spnA 在 果蝇同源重组的链侵入步骤需要）14,19因此，Rad51的缺失应导致同源重组效率降低。事实上，在一个 DmRad51-/- 背景，HR修复降低至1.3 ± 0.4%，同时伴随SSA修复的增加（34.5 ± 1.8%； 图3B 和 补充文件 4)14这最可能是由于原本应通过同源重组进行修复的事件，转而通过单链退火方式进行修复所致 白色 重复序列

Drosophila CtIP 在体细胞组织中对高效同源重组修复的贡献

TIDE 算法可用于测量体细胞中修复通路的选择。在非突变背景下，可检测到的修复事件中有 59.0% 为经过加工的非同源末端连接（NHEJ），同源重组（HR）占 41.0%（图 4B 和 补充文件 4）。CtIP 通过促进 DNA 末端切除，在启动 HR 修复过程中发挥重要作用20。因此，在 DmCtIP-/- 背景下，体细胞中的 HR 通路选择显著减少，从杂合对照的 41.0% 下降至纯合突变体的 10.9%（图 4B 和 补充文件 4）16。这表明在果蝇（Drosophila）中，CtIP 对 HR 修复具有促进作用，但并非其必需因子。

DR-white 测定示意图，展示 DNA 修复通路；HR、NHEJ、SSA 方法及 Sce.white 基因元件。
图1：DR-w白色 DSB 报告基因检测与修复结果 直接重复序列 白色 检测包含两个无功能的拷贝 白色 基因： Sce.white （包含一个23 bp的插入片段，该片段含有I-SceI识别位点并引入了一个提前终止密码子）以及 iwhite （5′ 和 3′ 端截短的供体序列）。使携带 DR-的果蝇杂交白色 和一个 I-SceI 转基因产生一个位点特异的DSB，可通过表型或分子方法进行分析。所产生的表型为（A白眼后代（y+ w−），表明无双链断裂（DSB）、姐妹染色单体同源重组（intersister HR）或非同源末端连接（NHEJ）；（B）红眼后代（y+ w+），表明染色体内同源重组恢复了野生型序列 SacI 序列来自 iwhite 供体；以及（C黄色体色、白色眼的子代（y− w−），表明为单链退火（SSA）或有丝分裂交换（mitotic CO）。图改编自 Do 等人。14缩写：CO = 交叉；DR-白色 = white 基因的直接重复；DSB = 双链断裂；HR = 同源重组；NHEJ = 非同源末端连接；SSA = 单链退火。 请点击此处以查看此图的放大版本。

基因编辑示意图：同源重组、I-SceI 切割、DR-white.mu、DNA、iwihiteΔ9、SacI 位点。
图 2：DR-white 检测的衍生形式。 （A）DR-white.mu 检测在 iwhite.mu 供体序列中含有 28 个沉默 SNP，使两个直接重复序列之间产生 1.4% 的序列差异。不同同源重组事件中各个多位点的基因转换情况各异，可通过测序确定。（B）使用 iwhiteΔ9 供体的 DR-white 检测可区分同源染色体间与染色体内重组。来自染色体内 iwhite 供体的同源重组可恢复野生型 SacI 序列，产生红眼后代；而来自同源染色体间 iwhiteΔ9 供体的同源重组由于 9 bp 的缺失导致 white 基因表达降低，产生橙眼后代。该图改编自 Do 等人14 和 Fernandez 等人15。缩写：DSB = 双链断裂；HR = 同源重组；SNP = 单核苷酸多态性。 请点击此处查看此图的放大版本。

果蝇基因修复通路、遗传杂交图解、后代分布柱状图分析。
图3： 检测减数分裂前生殖系中双链断裂修复结果的实验流程。（A）杂交1将DR-white报告系统（或其衍生系统）与I-SceI转基因（本例中位于第二染色体上）结合。同时携带DR-white检测系统和I-SceI转基因的后代，其生殖系和体细胞组织中均保留了修复事件。为分析减数分裂前生殖系中的单个修复事件，将携带两个转基因的后代与y w测试品系果蝇进行杂交（杂交2），并按照图1所述方法对后代进行评分。（B）野生型果蝇（n = 106 个生殖系）和DmRad51纯合突变体（n = 46 个生殖系）中单个生殖系双链断裂修复事件的分布。**P < 0.01；****P < 0.0001，采用双因素方差分析（ANOVA）后接Sidak多重比较检验。柱状图表示均值；误差线表示标准误（SEM）。数据重新分析自Do等人的研究14。缩写：ANOVA = 方差分析；CO = 交换；DSB = 双链断裂；HR = 同源重组；NHEJ = 非同源末端连接；SEM = 标准误；SSA = 单链退火。请点击此处查看此图的放大版本。

通过Sanger测序结合TIDE分析进行基因编辑过程；包含修复方法比较图表。
图4： 利用TIDE（通过分解追踪插入缺失）检测双链断裂修复结果的实验流程。 （A）携带DR-white和诱导型I-SceI转基因的果蝇通过基因组DNA（gDNA）提取、在双链断裂（DSB）位点两侧进行PCR扩增、Sanger测序以及R脚本进行TIDE分析。 （B）来自DmCtIP-/-突变体（n = 23）和DmCtIP+/-杂合对照（n = 31）的代表性数据。可检测到的修复事件计算为同源重组（HR）加上经加工的非同源末端连接（NHEJ），排除无双链断裂或无插入缺失的NHEJ事件。 ****P < 0.0001，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）后接Sidak多重比较检验。柱状图表示均值；误差棒表示标准误（SEM）。数据重新分析自Thomas等16。缩写：ANOVA = 方差分析；DSB = 双链断裂；gDNA = 基因组DNA；HR = 同源重组；NHEJ = 非同源末端连接；PCR = 聚合酶链式反应；SEM = 均值标准误；TIDE = 通过分解追踪插入缺失。 请点击此处查看该图的高清版本。

补充文件 1： 用于在测序色谱图中相对于无 DSB 对照识别插入和缺失的 TIDE R 脚本。用户可编辑的对照文件名、样本文件名以及 I-SceI 靶序列在脚本末尾附近标出。所需输入、输出文件及结果解读详见第 2.3 节。需要安装 sangerseqR 和 Biostrings 软件包。请点击此处下载该文件。

补充文件 2： TIDE R 脚本工作流程的分步截图指南。 各图示说明了第 2.3 节中描述的软件操作。请点击此处下载该文件。

补充文件 3： TIDE 分析结果示例及修复事件计算。 0-indel 值表示无双链断裂（DSB）或无插入缺失的非同源末端连接（NHEJ）；单独的 HR 行表示典型的 23-bp 缺失产物；其余所有插入缺失百分比之和记为经加工的 NHEJ。可检测到的总修复量计算为 HR 与经加工的 NHEJ 之和。请点击此处下载该文件。

补充文件 4： 图 3B 和图 4B 的原始数据，已整理为可单独编辑的工作表。 这些数据来自相应图注中引用的已发表研究，并进行了重新分析。请点击此处下载该文件。

讨论

DR-white 系统的多功能性是其在过去和未来对DNA修复领域产生重要影响的关键因素。首先，DR-white 报告基因构建体中的attB整合序列允许研究人员将报告基因靶向整合至Drosophila基因组的多个位点21，目前已存在多个已靶向整合的品系22。其次，多种不同的I-SceI转基因可供使用，例如通过hsp70启动子实现热激表达（本研究），通过ubiquitin启动子实现组成型表达23，以及通过Bam启动子实现减数分裂前生殖细胞特异性表达24，这些选择为研究DSB修复提供了多种发育阶段和组织特异性的实验条件。无论使用哪种 I-SceI转基因，都必须精心设计遗传杂交方案，确保I-SceI转基因仅在最终杂交步骤中引入，以保证DSB的正确诱导。需要注意的是，修复频率可能因DR-white在基因组中的整合位点和/或所使用的I-SceI 转基因的不同而存在显著差异。未来的研究可进一步比较不同基因组位点和I-SceI转基因，以确定是基因组环境还是组织特异性在驱动DSB修复过程中起主导作用。

DR-white 检测法及其衍生方法的一个显著优势在于，它们能够识别通过同源重组（HR）、经加工的非同源末端连接（NHEJ）以及在大多数情况下通过单链退火（SSA）途径修复的双链断裂（DSB）。尽管该系统最初设计用于在表型水平上检测生殖系中的修复事件，但也可通过TIDE算法分析对体细胞组织进行分析。尽管具有这些优势，该检测方法仍存在一些必须考虑的局限性。值得注意的是，DR-white 检测法可能低估同源重组的频率。与其他利用核酸酶诱导DSB的遗传报告系统类似，通过姐妹染色单体进行的同源重组修复（即姐妹染色单体间HR）无法与未发生DSB的事件或未经加工的NHEJ事件相区分。因此，至少部分归类为“无DSB/NHEJ”的事件实际上可能是HR事件。鉴于这一局限性，在比较不同遗传因素（例如突变品系）时应谨慎解读结果。该检测的其他局限性还包括无法统计未产生可存活后代的减数分裂前事件。例如，那些未能修复并导致细胞死亡的DSB事件将不会在后代中被检测到。虽然整体生育力可作为生殖系细胞死亡的一种定性指标，但可能需要借助基于细胞的检测方法（如TUNEL）加以验证。此外，TIDE R脚本分析仅能提供细胞群体中可检测事件的比例；若要确定特定的插入缺失（indel）序列结果，则需采用多重DNA测序技术对单个修复事件进行测序分析。

DR-white 检测法已在DSB修复研究中产生了深远影响。该方法的应用已鉴定出多种影响多细胞生物体DSB修复的因素，包括年龄25、性别26、DSB位置22,26、供体序列位置15、细胞周期以及组织类型26。此外，我们已利用该检测法鉴定了多个在果蝇（Drosophila）中调控修复通路选择和/或促进分歧序列修复的蛋白质，包括Msh627、Blm28、Rif116和CtIP16,29。事实上，果蝇（Drosophila）作为一种遗传模式生物，其DNA修复蛋白高度保守，为研究复杂生物学背景下影响DSB修复的遗传、细胞及个体水平因素提供了一个简便的多细胞体系。

披露

作者声明无任何财务或非财务利益冲突。

致谢

本方法由J.R.L.在获得美国衰老研究联合会（American Federation for Aging Research）AFAR研究基金期间开发。 本研究还得到了美国国立普通医学科学研究所（National Institute of General Medical Sciences）的资助（项目编号：1R15GM110454 和 1R15GM129628），资助对象为J.R.L。图示的绘制得到了BioRender（https://BioRender.com/b8sbcjp）2026年的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 mL 无 RNA酶/DNA酶污染的研磨杵Fisher Scientific12141363用于基因组DNA提取样品的匀浆处理
棉球Genesee Scientific51-101用于标准果蝇培养
果蝇帕尔贴制冷培养箱Shel LabSRI6PF用于标准果蝇培养
果蝇品系：y[1] w[1]Bloomington Drosophila  Stock CenterRRID:BDSC 1495
果蝇品系：y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque 实验室N/A由 LaRocque 实验室通过标准重组方法构建，所用亲本品系 RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) 来自 Bloomington Drosophila Stock Center；可向通讯作者申请获取
果蝇品系：y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque 实验室N/ADR-white 检测系统整合入品系 RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C)；可向通讯作者申请获取
果蝇品系：y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque 实验室N/ADR-white.mu 检测系统整合入品系 RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C)；可向通讯作者申请获取
果蝇品系：y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque 实验室N/AiwhiteΔ9 供体质粒整合入品系 RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C)；可向通讯作者申请获取
Flugs 果蝇培养瓶封口Genesee Scientific49-100用于标准果蝇培养
荧光体视显微镜（RFP）TriTech ResearchSMT1-FL用于基于荧光的标准果蝇"挑蝇"与分选
FlyStuff 果蝇操作垫Genesee Scientific59-172用于标准果蝇"挑蝇"
Kimwipes 擦镜纸Kimberly-Clarke06-666A
MyBath 4L 水浴锅Midwest ScientificMB-2000-4用于 热激处理
NanoDrop One 核酸测定仪Thermo Fisher Scientific13-400-518LY用于DNA定量
Nutri-fly Bloomington 配方培养基Genesee Scientific66-121用于标准果蝇培养
Pellet Pestle 无线电机匀浆器DWK Life SciencesK749540-0000用于基因组DNA提取样品的匀浆处理
聚丙烯培养瓶Genesee Scientific32-130用于标准果蝇培养
聚苯乙烯小管Genesee Scientific32-116用于标准果蝇培养，包括热激处理
引物/寡核苷酸 DR-white_8fN/A；任何寡核苷酸合成服务均可满足需求N/A5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
引物/寡核苷酸 DR-white_8aN/A；任何寡核苷酸合成服务均可满足需求N/A5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
引物/寡核苷酸 DR-white_9fN/A；任何寡核苷酸合成服务均可满足需求N/A5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioPositVersion 2023.06.1+524免费下载版本；任何版本的 R Studio 均可使用，但本文所展示数据使用的是 版本 2023.06.1+524 进行分析
R Studio 软件包：BiostringsBioconductor.org (Version 3.24)Version 2.76.0R 脚本将提示用户安装此软件包
R Studio 软件包：sangerseqRBioconductor.org (Version 3.24)Version 1.44.0R 脚本将提示用户安装此软件包
SapphireAMP 快速 PCR 试剂TakaraRR350B
体视显微镜LeicaM60用于标准果蝇"挑蝇"
Wizard SV 凝胶与 PCR 产物纯化系统 PromegaA9281

参考文献

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

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