在伴有阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的急性脑梗死患者中，miR‑486‑3p 表达下调，其水平与疾病严重程度及炎症标志物呈负相关，并可预测1年不良预后，提示其作为诊断和预后生物标志物的潜在价值。
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在伴有阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的急性脑梗死患者中，miR‑486‑3p 表达下调，其水平与疾病严重程度及炎症标志物呈负相关，并可预测1年不良预后，提示其作为诊断和预后生物标志物的潜在价值。
急性脑梗死（ACI）合并阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）具有较高的卒中复发和死亡风险，但目前针对该共病状态的有效生物标志物仍十分有限。本回顾性队列研究纳入了2020年11月至2023年12月期间收治的270例ACI患者，根据呼吸暂停-低通气指数（AHI）将其分为ACI组（n = 100，AHI < 5）和ACI合并OSAS组（n = 170，AHI ≥ 5），后者进一步分为轻度（5 ≤ AHI < 15，n = 60）、中度（15 ≤ AHI < 30，n = 75）和重度（AHI ≥ 30，n = 35）亚组。采用RT-qPCR检测血清miR-486-3p表达水平，通过ELISA定量检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C反应蛋白（CRP）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）等炎症标志物。采用受试者工作特征曲线分析评估miR-486-3p的诊断价值，并通过Kaplan-Meier生存分析和Cox回归模型评估其预后意义。结果显示，共病组患者miR-486-3p水平显著降低，且具有良好的诊断效能（AUC = 0.927）。值得注意的是，在OSAS严重程度不同的亚组中观察到明显的剂量依赖趋势：随着OSAS严重程度从轻度至重度进展，miR-486-3p水平逐步下降，而TNF-α和CRP水平则逐步升高。Spearman相关性分析显示，miR-486-3p与AHI、NIHSS评分、TNF-α和CRP呈负相关。在为期1年的随访中，miR-486-3p表达水平较低的患者功能预后显著差于高表达者。多变量Cox回归分析证实，miR-486-3p是1年预后的独立保护因素。上述结果提示，miR-486-3p可能作为ACI合并OSAS患者的新型诊断与预后生物标志物，其作用机制可能与调控全身性炎症反应有关，尚需在更大规模的前瞻性队列中进一步验证。
阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）是一种常见疾病，其特征是在睡眠过程中反复出现呼吸中断1。OSAS 常与代谢性、心血管、肾脏、肺部及神经精神系统等多种共病相关2。除了与心血管和代谢性疾病的一般关联外，OSAS 在急性缺血性卒中中构成特定且严重的威胁，高达 70% 的卒中患者合并此症，并增加神经功能恶化、死亡及卒中复发的风险3,4,5。急性脑梗死（ACI）是卒中最常见的类型。尽管近年来在 ACI 治疗方面已取得显著进展，但大多数患者仍遗留严重残疾甚至死亡6。ACI 与 OSAS 的协同作用会加剧缺血性损伤和全身性炎症反应，显著提高卒中复发、致残和死亡的风险。因此，识别可用于早期诊断和管理这一高危共病状态的可靠生物标志物具有极其重要的意义。
近年来，microRNA（miRNA）作为生物标志物展现出巨大潜力。其中，miR-486-3p 在神经血管疾病中具有重要意义。既往研究表明，miR-486-3p 在阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）中的表达受到抑制7。此外，狂犬病病毒糖蛋白-miR-486-3p-外泌体治疗可缓解神经行为障碍、脑水肿、血脑屏障损伤及神经退行性病变8，提示 miR-486-3p 在脑损伤中发挥一定作用。急性脑梗死（ACI）后，受损脑组织中的小胶质细胞被激活，促进炎症细胞因子的分泌5。阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）可引起间歇性低氧，导致交感神经系统激活和氧化应激，从而触发全身性炎症级联反应9。miR-486-3p 与炎症密切相关10。这些证据表明，miR-486-3p 可能是连接 OSAS 相关低氧、全身炎症与卒中后恢复的分子桥梁。
然而，miR-486-3p在合并阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）的急性脑梗死（ACI）患者中的表达谱、诊断准确性及预后意义尚未得到系统研究，其是否以剂量依赖方式与OSAS严重程度或炎症介质相关亦不清楚。为填补上述研究空白，本研究评估了miR-486-3p在ACI患者中对OSAS的诊断价值，并探讨其与OSAS严重程度及炎症标志物（TNF-α，CRP，和HIF-1α，并评估了其对1年功能预后的预测价值。据我们所知，这是首次全面研究表明，miR-486-3p可能作为ACI-OSAS共病的一种新型诊断和预后生物标志物，其作用机制可能涉及对全身性炎症的调控。
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本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准 （批准编号：XYFY2024-KL238-01），并获准免除额外获取患者知情同意的要求。所用试剂与设备列于材料表中。
患者与标本
本研究为一项回顾性队列研究。2020年11月至2023年12月期间，连续纳入徐州医科大学附属医院接受急性缺血性脑卒中（ACI）治疗的270例患者。患者筛选流程详见补充图1。通过每日筛查卒中病房所有新入院患者来确定符合条件的受试者。入院前72小时内出现症状由急诊医疗记录确认，并由认证神经科医生通过患者病史及家属访谈进一步核实。样本量根据检测各组间miR-486-3p水平显著差异的能力进行计算。假设效应量为0.5，双侧α为0.05，检验效能（1-β）为0.80，每组至少需要64例患者。最终各组样本量反映了实际招募情况以及卒中人群中阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）较高的患病率，而非预先设定的分组比例。合并OSAS的ACI患者被随访1年以评估其预后情况。
纳入标准为：（1）经磁共振成像证实的急性缺血性卒中，且症状发作时间在入院前72小时内；（2）能够理解并完成研究问卷及神经功能评估；（3）入院时采用美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评估急性脑梗死（ACI）严重程度：当NIHSS评分＜5时，定义为轻度ACI；当NIHSS评分在5至20之间时，定义为中度ACI。主要排除标准包括：恶性肿瘤病史、既往存在严重躯体残疾或精神疾病、严重心、肺或肾功能不全、近3个月内有重大手术或创伤史、活动性感染或自身免疫性疾病、6个月内有卒中病史、接受免疫抑制治疗，以及既往诊断或接受过阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）治疗（包括持续气道正压通气治疗）。
为进行磁共振成像（MRI）确认，所有患者均在3.0-T系统上接受标准脑部MRI检查，包括以下序列：T1加权成像、T2加权成像、液体衰减反转恢复（FLAIR）、扩散加权成像（DWI）以及表观扩散系数（ADC）图。急性脑梗死定义为DWI上出现高信号，且在ADC图上相应区域呈现低信号。所有MRI扫描均由两名经验丰富的神经放射科医师进行判读，判读过程对临床资料设盲，若有分歧则通过共识解决。美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分由经过认证的神经科医师在患者入院时、任何溶栓或血管内治疗前完成。
在卒中发病后24至48小时内，于隔夜空腹至少8小时后采集空腹静脉血。为尽量减少昼夜节律变异，采血时间安排在上午6:00至8:00之间。采集总共5 mL外周静脉血至含EDTA涂层的真空采血管中。采集后2小时内，使用冷藏离心机在4 °C条件下以1,500 × g 离心15分钟。小心吸取血清上清液，分装至1.5 mL无RNase的微量离心管中，并立即于−80 °C保存，直至进行RNA提取。严格避免反复冻融；所有分装样本在分析前最多经历一次冻融循环。
患者分组
根据多导睡眠图（polysomnography）测得的呼吸暂停低通气指数（AHI）将受试者进行分组。所有记录均在医院睡眠实验室于晚上10:00至次日早上6:00之间完成，持续时间不少于7小时。监测的生理信号通道包括：脑电图（EEG，6个通道）、眼电图（EOG，2个通道）、肌电图（EMG，颏肌及双侧胫前肌）、心电图（ECG，单导联）、鼻气流（热敏电阻和压力传感器）、胸腹呼吸努力（呼吸感应体积描记法）以及脉搏血氧饱和度（SpO2）。睡眠研究技术人员计算AHI值。睡眠阶段和呼吸事件的判读由经认证的睡眠技术人员根据美国睡眠医学会（AASM）2012年判读手册手动完成，并使用Somnolyzer 24×7软件进行分析。根据美国睡眠医学会广泛接受的诊断标准，每小时AHI ≥ 5次事件是诊断阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSA）的标准阈值。因此，AHI ＜ 5的受试者被归类为ACI组（n = 100），而AHI ≥ 5的受试者被归类为ACI合并OSAS组（n = 170）。在AHI ≥ 5的受试者（ACI合并OSAS组，n = 170）中，根据既定标准进一步分为三个严重程度亚组：轻度OSAS（5 ≤ AHI ＜ 15，n = 60）、中度OSAS（15 ≤ AHI ＜ 30，n = 75）和重度OSAS（AHI ≥ 30，n = 35）。该分层策略有助于评估缺氧负荷、miR‑486‑3p表达水平与炎症标志物之间的剂量依赖关系。为避免对基线AHI测量造成干扰，本研究未纳入既往接受过OSAS治疗（如CPAP）的患者。
预后评估
1年时间点可使急性效应消退，并充分显现阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）的累积缺氧负荷，从而为评估其预后影响提供可靠的时间窗口。卒中后患者的临床预后采用改良Rankin量表（mRS）在疾病发病后进行评价。所有mRS评估均由经过标准化培训的认证神经科医生采用结构化mRS访谈表完成。评估者间的一致性通过kappa系数进行检验。 >0.85。随访评估通过预约的门诊诊所就诊进行。对于无法亲自到场的患者，由经过培训的研究护士使用标准化脚本进行结构化电话访谈。所有评估人员均对患者的miR-486-3p水平及OSAS状态设盲。为保持门诊与电话评估之间的一致性，两种形式均采用相同的结构化问卷，且所有评估人员均完成了研究前的校准练习。评分为0–2分的患者被归入预后良好组，评分为3–6分的患者被归入预后不良组。无患者失访。SAQLI、ESS、TNF-α，以及 HIF-1α 被评估为预后变量，而非用于定义预后分组。NIHSS、SAQLI 和 ESS 由经过培训的研究人员进行评定。SAQLI 和 ESS 在安静的房间内以面对面问卷访谈的形式进行。
评分指数
NIHSS 是一种用于脑卒中的定量量表11，分数越高表明急性脑梗死（ACI）的严重程度越高。SAQLI 是针对阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）患者的生活质量问卷，评分范围为 1–7，分数越高表示生活质量越差，涵盖日常活动、社交互动、情绪状态、症状及与治疗相关的症状12。ESS 用于评估患者自述的日间嗜睡情况，评分范围为 0 至 24，评分 > 10 表示存在日间嗜睡13。
RNA 提取与逆转录
使用 TRIzol 试剂从 200 µL 血清中提取总 RNA。简言之，将血清样本与 800 µL TRIzol 混合，在室温下孵育 5 分钟，然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。加入 200 µL 氯仿，剧烈振荡 15 秒，孵育 3 分钟后，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。将水相转移至新离心管中，加入 500 µL 异丙醇沉淀 RNA，在 −20 °C 下孵育 1 小时，然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。用 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，空气干燥后溶于 20 µL 无 RNase 水中。使用微量分光光度计测定 RNA 浓度和纯度，A260/A280 比值在 1.8 至 2.0 之间的样本可用于后续分析。通过琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。
使用500 ng总RNA，按照逆转录试剂盒的制造商说明书，以随机六聚体引物在20 µL的总反应体系中进行逆转录反应。逆转录反应条件为：25 °C孵育10分钟，42 °C孵育60分钟，70 °C孵育5分钟。所得cDNA保存于−20 °C，待用。
RT-qPCR
使用基于SYBR Green的实时PCR试剂盒，在实时定量PCR（qPCR）系统上检测miR-486-3p的表达水平。反应体系包含 10 µL 2 的× SYBR Green Master Mix 2 µL cDNA 模板（1:5 稀释） 1 µL 每种引物10 µM），并用无核酸酶水定容至终体积 20 µL引物序列如下（5'-3'方向）：miR-486-3p-上游：TCGGCAGCGGGGCAGCUCAGU，下游：CTCAACTGGTGTCGTGGA；U6-上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT。qPCR扩增条件为： 95 °C 2分钟，随后进行40个循环的 95 °C 30 秒 60 °C 30 秒，以及 72 °C 60秒。每个样本设三个复孔，每次运行均包含无模板对照。通过熔解曲线分析确认扩增的特异性。 60 °C 到 95 °C循环阈值（Ct）由 QuantStudio 6 Pro 软件（v1.5）使用默认阈值设置自动确定。miR-486-3p 水平采用 2-ΔΔ计算机断层扫描 方法并以U6进行标准化。使用NormFinder算法验证U6在我们的血清样本中为稳定的参考基因，以确保各组间的一致性。批间和批内变异系数分别为 <5%.
ELISA
采用ELISA试剂盒检测血清中C反应蛋白（CRP）、TNF-α和HIF-1α的浓度。实验操作严格按照试剂盒说明书进行。简言之，将血清样本置于冰上解冻，并用所提供的稀释缓冲液按1:2比例稀释。将样本和标准品各100 µL加入预先包被的96孔板中，于37°C孵育2小时。用300 µL洗涤缓冲液洗涤4次后，每孔加入100 µL生物素标记的检测抗体，于37°C孵育1小时。再次洗涤后，每孔加入100 µL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，于37°C避光孵育30分钟。随后加入显色底物（四甲基联苯胺，100 µL），于37°C避光孵育15分钟。加入50 µL终止液终止反应，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。根据已知浓度重组蛋白绘制的标准曲线计算各样本的浓度。每个样本设两个复孔，取均值用于后续分析。每块板均包含试剂盒提供的质控样本，仅当质控值处于厂家规定的范围内时，结果方可被接受。
质量控制与可重复性
所有实验室检测均按照 RT-qPCR 的 MIQE（定量实时 PCR 实验发表的最低信息标准）指南以及 ELISA 的相应报告标准进行。主要仪器均按照制造商规定的时间表进行校准。每次 RT-qPCR 和 ELISA 实验批次中均包含阴性对照和阳性对照样本，以监测板间变异。所有数据均使用 Microsoft Excel 记录和管理，通讯作者将在合理要求下提供详细的实验方案和原始数据。
统计学分析
采用 SPSS 23.0 及统计绘图软件进行数据分析。正态分布通过 Shapiro–Wilk 检验进行评估。连续变量以均值 ± 标准差或中位数（四分位距）表示，根据情况采用 t 检验或 Mann–Whitney U 检验进行比较。分类变量采用 χ2 检验进行比较。根据数据分布情况，采用 Pearson 或 Spearman 相关性分析评估相关性。通过 ROC 曲线确定预测价值，并采用 5 折交叉验证进行验证。miR-486-3p 的最佳截断值通过最大化 Youden 指数确定。采用 Pearson 和 Spearman 相关性分析评估相关性。在预后分析中，根据 miR-486-3p 表达的中位数将患者分层，采用 Kaplan–Meier 生存曲线及 log-rank 检验比较组间生存结果。单变量 Cox 回归分析中 P < 0.1 的变量被纳入多变量 Cox 模型。以 P < 0.05 为差异具有统计学意义。
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ACI 组与 ACI 合并 OSAS 组的基线特征
如表 1所示，ACI 组包括 68 名男性和 32 名女性，平均年龄为 62.84 ± 12.65 岁；ACI 合并 OSAS 组包括 116 名男性和 54 名女性，平均年龄为 61.31 ± 11.25 岁。ACI 合并 OSAS 组的 AHI、NIHSS 评分和 CRP 水平显著更高。然而，两组在年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、心脏病、血脂异常、吸烟、饮酒、溶栓治疗和 TOAST 分型方面的分布具有可比性。
OSAS严重程度亚组中miR-486-3p与炎症标志物的变化
为了评估阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）严重程度与分子变化之间的剂量依赖关系，我们将170例合并急性脑梗死（ACI）和OSAS的患者根据呼吸暂停低通气指数（AHI）分为轻度（5 ≤ AHI < 15）、中度（15 ≤ AHI < 30）和重度（AHI ≥ 30）三组。 < 15，n = 60），中度（15 ≤ AHI < 3...
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患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）的患者会出现反复的气道塌陷和阻塞，导致间歇性低氧（IH）和过度日间嗜睡（EDS），这些症状可能引起神经元损伤14阻塞性睡眠呼吸暂停在急性冠脉综合征后极为常见，影响约72%的患者，并显著增加心血管风险15急性脑缺血（ACI）是由灌注不足引起的局部脑缺血和缺氧所导致的一系列神经功能缺损。16阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）病理机制中的间歇性低氧可能与急性脑梗死（ACI）的缺血性损伤产生协同作用，从而加重脑损伤。然而，针对这一高风险共病状态的研究仍十分有限。越来越多的证据表明，miRNA在OSAS和ACI的发病机制中均发挥关键作用。17,18有研究先前指出，miR-486-3p 可能与阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）及急性脑梗死（ACI）相关。因此，我们探讨了 miR-486-3p 作为 OSAS 与 ACI 之间潜在分子关...
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本研究由“脑卒中预防与治疗技术研究”（编号：WKZX2023CZ0143）资助。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3.0T MRI 扫描仪 | 西门子医疗，德国 | MAGNETOM Skyra | 急性脑梗死确诊的脑成像 |
| 96孔ELISA微孔板 | 中国深圳新博生生物科技有限公司 | XBS-PLATE | 用于ELISA检测的抗原-抗体反应 |
| AASM 睡眠呼吸障碍临床实践指南 | 美国睡眠医学会 | 2020年完整指南 | 标准化AHI诊断及OSAS严重程度分层标准 |
| 卡尔加里睡眠呼吸暂停生活质量指数（SAQLI）中文验证版 | 卡尔加里大学 | 2021年翻译版 | 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征合并急性脑梗死患者的生活质量评估 |
| EDTA-K2 5 mL 真空采血管 | BD 生物科学，美国 | 367863 | 用于血清分离的外周静脉采血 |
| Epworth嗜睡量表（ESS）中文验证版 | 约翰斯·霍普金斯大学 | 2018年修订版 | 卒中患者日间嗜睡的评估 |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Software，美国 | 版本 9.4.1 | 散点图，箱线图，ROC曲线可视化 |
| 人C反应蛋白ELISA试剂盒 | 中国深圳新博生生物科技有限公司，中国深圳 | XBS-H001 | 血清C反应蛋白的定量检测 |
| 人HIF-1α ELISA试剂盒 | 中国深圳新博生生物科技有限公司，中国深圳 | XBS-H007 | 血清缺氧诱导因子-1的定量检测α |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | 中国深圳新博生生物科技有限公司，中国深圳 | XBS-H003 | 血清TNF-α的定量检测α 炎症因子 |
| IBM SPSS Statistics 23.0 | IBM，阿蒙克，纽约州，美国 | 版本 23.0 | 所有统计分析（t检验、相关性分析、ROC、Kaplan–梅尔（Meier）、Cox 回归 |
| 微孔板分光光度计 | 赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆） | Multiskan FC | ELISA 板在 450 nm 处的吸光度读数 |
| miR-486-3p & U6 qPCR 引物 | 中国上海 Sangon Biotech | 定制合成 | qPCR 的目的基因与参照基因扩增 |
| miScript SYBR Green PCR 试剂盒 | Qiagen GmbH，德国希尔登 | 218073 | 实时定量PCR扩增miR-486-3p和U6 |
| 美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）中文验证版 | 美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS） | 标准临床版 | 脑卒中患者基线神经功能缺损严重程度评估 |
| PSG睡眠分期软件 | BMC Medical Co., Ltd., 中国 | v3.2 | 睡眠呼吸事件的自动化初步评分 |
| QuantStudio 6 Pro 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆） | QuantStudio 6 Pro | 实时定量PCR扩增、熔解曲线采集、Ct值记录 |
| QuantStudio 实时荧光定量 PCR 软件 | Applied Biosystems，美国 | v1.7 | qPCR原始数据导出，Ct值分析 |
| 冷藏台式离心机 | 中国湖南向仪离心机仪器有限公司 | TDZ5-WS | 全血中血清的分离（2700 × 克， 4 °C) |
| RevertAid RT反转录试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | K1691 | 血清miRNA逆转录为cDNA |
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| TRIzol RNA 提取试剂 | Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 15596026 | 从人血清样本中提取总RNA |
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| YH-600B 多导睡眠图监测仪 | 中国北京，BMC Medical Co., Ltd. | YH-600B | 夜间睡眠监测及用于OSAS诊断的AHI计算 |
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