本研究证实，启明颗粒（QMG）通过调控肠-视网膜轴改善糖尿病视网膜病变（DR）。QMG重塑了肠道菌群结构，抑制全身性炎症反应，并恢复以CMKLR1为核心的调控网络，从而逆转视网膜组织病理损伤。这些发现表明，QMG是一种具有前景的、针对DR的肠-视网膜治疗策略。
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本研究证实，启明颗粒（QMG）通过调控肠-视网膜轴改善糖尿病视网膜病变（DR）。QMG重塑了肠道菌群结构，抑制全身性炎症反应，并恢复以CMKLR1为核心的调控网络，从而逆转视网膜组织病理损伤。这些发现表明，QMG是一种具有前景的、针对DR的肠-视网膜治疗策略。
糖尿病视网膜病变（DR）是一种由慢性高血糖和全身性炎症驱动的神经血管并发症，越来越多的证据表明肠-视网膜轴是一个关键但尚未被充分利用的治疗靶点。本研究探讨了启明颗粒（QMG）是否通过调节肠-视网膜轴发挥对DR的保护作用。将C57BL/6小鼠随机分为不同的实验组并接受相应的干预措施。采用苏木精-伊红（HE）染色评估视网膜组织病理学改变。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平。采用蛋白质印迹法（WB）检测视网膜和结肠组织中关键调控蛋白（CMKLR1、Wnt5a、PPAR-γ、AP-1、TP53）的表达。通过全长16S rDNA测序分析肠道微生物群的组成与多样性。进行相关性分析以评估肠道微生物群与炎症因子或关键蛋白之间的关系。QMG治疗改善了视网膜组织病理学异常，表现为视网膜层状结构的恢复、视网膜神经节细胞数量的部分恢复（P < 0.001），以及视网膜变薄的逆转（P < 0.01）。同时，QMG显著下调了血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平（P < 0.0001）。在肠-视网膜轴上，QMG逆转了关键调控蛋白的异常表达，特别是以CMKLR1为核心的调控网络（Wnt5a、PPAR-γ、AP-1、TP53）。此外，QMG恢复了肠道微生物群的组成、多样性和功能，相关性分析显示，QMG通过将全身性炎症与这些调控蛋白相偶联，从而调节肠-视网膜轴。 本研究提供了初步的药理学证据，表明QMG通过肠-视网膜轴，将CMKLR1为核心的调控网络（包括Wnt5a、PPAR-γ、AP-1和TP53）与全身性炎症相偶联，从而改善DR，提示QMG是一种具有前景的针对DR的肠-视网膜治疗策略。
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病（DM）最常见的微血管并发症之一，也是全球工作年龄成人失明的主要原因1。在全球范围内，约有20%-30%的DM患者受到DR影响2。慢性高血糖通过引发一系列病理事件驱动DR的发病过程，包括神经血管耦合受损、炎症反应增强以及氧化应激3。最近的研究发现，与无视网膜病变的糖尿病患者相比，患有视网膜病变的糖尿病患者其肠道微生物群的多样性和组成发生了改变4,5。因此，肠-视网膜轴——一种连接肠道稳态与视网膜健康的双向通讯网络——已成为推动DR进展的新机制。然而，将肠-视网膜信号转化为视网膜病理变化的具体分子介质仍大多未被阐明，这限制了可靠生物标志物和治疗靶点的发现。
肠-视网膜轴通过免疫、代谢、神经内分泌和血管通路，介导肠道微生物群及其代谢产物与视网膜组织之间复杂的双向通讯网络，从而调节两者的稳态平衡6。在分子层面，肠-视网膜轴的特征是关键的应激反应和细胞命运决定蛋白（特别是AP-1和TP53）的失调7,8,9。此外，CMKLR1作为一种关键的趋化因子受体，在内皮功能障碍和代谢紊乱中发挥重要作用，建立了肠道微生物群改变与糖尿病视网膜病变发病机制之间的关键联系10。重要的是，Wnt信号通路在维持视网膜血管稳态和肠道上皮屏障功能中发挥双重调控作用11，而PPAR信号通路则是眼组织和肠道组织中炎症反应与代谢过程的主要调控因子12,13。这些分子组分共同构成了肠-视网膜轴内的相互连接的信号网络，为糖尿病相关并发症提供了新的机制见解和治疗机遇。因此，靶向该轴上的结构与功能改变，代表了一种管理糖尿病视网膜病变（DR）的有前景策略。
传统中医（TCM）在糖尿病及其相关视网膜病变的治疗中历来发挥着重要作用，其治疗决策基于辨证论治14. 启明颗粒（QMG），由 黄芪、葛根、地黄、枸杞子、钝叶决明、益母草、蒲黄 和 Whitmania pigra，广泛应用于糖尿病视网膜病变的治疗。芪明颗粒已获得中国国家药品监督管理局批准（批准文号：Z20090036），顺利完成临床试验并取得上市许可。芪明颗粒可通过防止视网膜毛细血管基底膜增厚发挥保护作用， 减少周细胞和视网膜微血管的损伤，并维持眼部局部的病理形态15，使其成为治疗糖尿病视网膜病变（DR）的一种有前景的疗法。通过靶向关键蛋白和炎症因子，QMG的活性成分发挥 抗炎、抗氧化和抗凋亡作用，为其调控相关机制提供了理论基础 肠-视网膜轴16这些特性为QMG可能调节肠-视网膜轴提供了机制基础，但目前探索这一关联的研究仍较少。因此，本研究旨在验证QMG在调节肠-视网膜轴方面的有效性，为其在糖尿病视网膜病变（DR）中的治疗潜力提供实验依据。
本研究通过将理论预测与体内实验数据相结合，验证了QMG在调节肠-视网膜轴方面的有效性。研究结果表明，QMG通过肠-视网膜轴将CMKLR1为核心的调控网络（包括Wnt5a、PPAR-γ、AP-1和TP53）与全身性炎症相偶联，从而改善糖尿病视网膜病变（DR），提示QMG是一种具有前景的、靶向肠-视网膜轴的DR治疗策略。图解摘要见图1。
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所有动物实验均按照 ARRIVE 指南进行。本研究已获得四川科学家生物技术有限公司伦理审查委员会批准（IACUC 批准号 SYST-2024-011）。 研究设计的详细实验时间线见补充图1。
动物准备与处理
小鼠通过吸入2%异氟烷进行深度麻醉。在深度麻醉状态下，通过眼球后摘除法采集血液。血液采集后立即摘除眼球以获取视网膜组织。随后在深度麻醉下实施颈椎脱位，以确保安乐死。紧接着立即解剖结肠组织。 出现不良事件的动物将被立即移出实验，并接受适当的兽医护理。
随机化与盲法
将5周龄、体重在20至30克之间的雄性C57BL/6小鼠饲养于温度与湿度严格控制的环境中。经过一周的适应性饲养后，由未参与动物操作及结果评估的研究人员使用计算机生成的随机数字序列，将C57BL/6小鼠随机分为三组（空白组、模型组和干预组）。
为确保盲法，所有动物护理、给药及数据收集均由不了解分组情况的研究人员执行。编码的分组信息仅在全部实验及统计分析完成后才予以揭盲。实施盲法的对象包括：进行灌胃操作的技术人员、评估视网膜组织病理学的病理学家，以及定量分析蛋白质印迹（WB）条带的分析人员。
样本量计算
样本量是根据一项初步实验确定的，该实验在相同的实验条件下评估了视网膜神经节细胞（RGC）的数量。假设双侧显著性水平（α）为0.05，统计功效（1-β）为0.80，为检测模型组与干预组之间RGC数量具有临床意义的差异，每组至少需要5只小鼠。考虑到约20%的潜在脱落率，每组设定为包含6只小鼠。
糖尿病动物模型的建立
空白组给予标准饮食，而干预组和模型组则给予高脂高糖饮食（HFHSD），持续四周。饮食处理结束后，干预组和模型组小鼠接受腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ）溶液，剂量为35 mg/kg17,18,19,20。注射72小时后，非空腹血糖水平超过16.7 mmol/L的小鼠被认为糖尿病（DM）模型构建成功，被选入后续实验。糖尿病动物继续维持高脂高糖饮食额外四个月，而空白组则持续给予标准饮食。
分类学验证与质量评估
使用现代植物名称检索系统（MPNS，http://mpns.kew.org/mpns-portal/）对QMG中的八种成分进行了分类学验证。采用ConPhYMP工具评估了QMG组分报告的质量。
给药方法
在干预组中，动物通过口服给予 QMG。QMG 购自浙江三生曼地药业有限公司（中国国家药品批准文号：Z20090036）。QMG 悬液通过将 QMG 与蒸馏水均匀混合制备而成。 干预组小鼠通过灌胃给予该悬液，给药体积与模型组和空白组相当。给药剂量依据 FDA 和 Reagan-Shaw 推荐的体表面积（BSA）归一化方法，按照成人每 60 kg 体重临床单次治疗剂量 4.5 g（市售制剂的标准单位剂量）进行计算21。成人（Km = 37）与小鼠（Km = 3）之间的换算系数为 12.33，由此得出小鼠剂量为 0.9 g/kg 体重。模型组和空白组通过灌胃给予等体积的生理盐水。给药时间为每日上午 9 点至 11 点，连续进行 3 个月。
观察与检测指标
一般生命体征监测
系统观察并记录一般生命体征和生理指标，包括体重、血糖水平、饮水和进食量、尿量、活动水平和行为、体温，以及毛发和皮肤状况，以全面评估治疗干预效果并及时发现潜在并发症。
通过苏木精-伊红染色分析观察视网膜的形态学变化
所有标本经固定后，通过自动脱水机依次使用乙醇和二甲苯溶液进行脱水处理，随后包埋于石蜡中。之后切取4 µm厚的石蜡切片，经HE染色后用中性树胶封片。视网膜图像采用3DHISTECH Pannoramic SCAN扫描仪进行扫描。图像分析与数据测量由Image-Pro Plus软件完成。
采用ELISA分析法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β
通过眶后摘除法采集血液样本。血清在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 15 分钟分离，并储存于 -80 °C 直至分析。按照标准操作程序检测血清中 IL‑1β、IL‑6 和 TNF‑α 的水平，包括试剂平衡、加样、孵育、洗涤、加入偶联物和底物、终止反应、测定光密度以及根据标准曲线计算浓度。使用酶标仪在 450 nm 处读取光密度值，并依据标准曲线计算细胞因子浓度。
通过 WB 分析检测视网膜和结肠中的关键调控蛋白
在单张膜上进行了三次独立的生物学重复实验，并依次对目标蛋白进行检测。所有重复实验均来自同一批次同时处死的动物。当目标蛋白的分子量与GAPDH的分子量过于接近时<5 kDa 差异），为防止信号重叠，各蛋白在独立的膜上分别进行分析。每张膜仅用于检测目标蛋白或 GAPDH，以确保定量准确。所用一抗如下：GAPDH 多克隆 抗体（1:5000），CMKLR1 多克隆抗体（1:1000），Wnt5a 多克隆抗体（1:1000），TP53 多克隆抗体（1:1000），AP-1 单克隆抗体（1:5000），以及 PPAR gamma（PPAR-γ) 多克隆抗体（1:1000）。通过细胞裂解后离心获取总蛋白。采用以下方法测定蛋白浓度 采用BCA法测定。提取的蛋白质通过含12%分离胶的SDS-PAGE进行分离，随后转移至膜上。膜在含5%脱脂奶粉的TBST中封闭，并于4℃与相应的一抗孵育过夜 4 °C洗涤后，将膜与 HRP 标记的抗兔或抗小鼠二抗以 1:10,000 的稀释比例孵育。最后通过化学发光成像对蛋白条带进行可视化和分析。在可视化及数据处理过程中，对印迹图横向裁剪以去除无关的分子量区域，所有样品泳道均被保留，未去除泳道间的区域。为去除无关凝胶区域而进行裁剪时，边缘可能出现轻微变形。
通过16S rDNA测序分析检测肠道微生物群
在终末实验操作前，采集每只小鼠的新鲜粪便样本。将小鼠单独置于无菌笼中10–15分钟，以使其自然排便。使用无菌镊子立即收集粪便颗粒，转移至无菌的1.5 mL离心管中，于液氮中速冻后，保存于-80 °C，直至进行DNA提取。所有操作均在无菌条件下进行，以最大限度减少交叉污染。排便至冷冻的时间间隔控制在10分钟以内，以确保微生物组的完整性。采用粪便基因组DNA（gDNA）提取试剂盒对粪便样本中的基因组DNA进行纯化，随后使用通用引物8F（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’）和1492R（5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增全长16S rDNA基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，进行纯化和定量，用于后续实验。高通量测序在Nanopore GridION测序平台上进行。数据分析流程包括碱基识别（basecalling）、数据质量控制、物种注释、系统发育树构建、群落分析、Alpha和Beta多样性分析、差异丰度物种 分析以及群落功能预测。分析过程中使用了多种工具和数据库，如NanoFilt、Usearch、R语言、Python以及SILVA数据库。
肠道-视网膜轴与全身性炎症及多层级肠道微生物群的关联性分析
为了探讨多层级肠道微生物群与血清炎症细胞因子及关键调控蛋白之间的潜在关联，采用洛宁生物云平台进行了相关性分析。首先，从测序结果中提取了界、门、纲、目、科、属和种水平的物种丰度数据。将血清炎症细胞因子和蛋白表达水平等理化因子整理为环境因子文件。为确保相关性分析的可靠性和可视化效果，对数据进行了标准化处理，以消除微生物丰度与临床检测指标在量纲上的差异。计算了相关系数（R值）及其对应的显著性水平（P值）。结果通过相关性热图进行可视化展示，其中颜色梯度表示相关性的强度与方向（红色代表正相关，蓝色代表负相关），星号（**）表示统计学显著性（P < 0.01）。
统计学方法
所有统计分析和可视化均使用 GraphPad Prism 完成。对于符合正态分布的数据，采用 t 检验比较均值；对于偏离正态分布的数据，则使用 Kruskal-Wallis 检验。变量间关系通过 Spearman 或 Pearson 相关性分析进行评估。所有统计检验均为双尾检验，显著性水平设定为 0.05。
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实验动物总体情况
模型组的血糖水平显著升高（27.21 ± 与空白组（6.03 mmol/L）相比，P < p < 0.001），表明糖尿病模型诱导成功。在研究期间，实验动物体重稳定，饮水和摄食持续，尿量、体温正常，皮毛和皮肤状况健康，实验期间行为正常。
QMG 的组成与验证
QMG是一种已通过III期临床试验的专有中药，包含 黄芪 (Fisch.) Bunge [豆科, 黄芪]，葛根 (Willd.) Ohwi [豆科，葛根]， 地黄 (Gaertn.) Libosch. Ex Fisch. & C.A. Mey. [列当科；地黄]，Lycium barbarum L. [茄科；枸杞子]， Senna obtusifolia (L.) H.S. 欧文 & Barneby [豆科；决...
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糖尿病视网膜病变（DR）是一种由慢性高血糖、炎症和代谢紊乱驱动的复杂神经血管并发症22。美国眼科学会将DR分为非增殖性DR和增殖性DR，后者以新生血管形成为特征23。鉴于当前治疗策略的局限性，探索新的作用机制已成为应对DR的一个有前景的方向。值得注意的是，近年来的研究突破已确定肠-视网膜轴是DR的一个关键但尚未充分开发的治疗靶点。肠-视网膜轴最早由Sheldon Rowan于2017年提出并描述6，近年来在眼部疾病病理生理过程中的作用日益受到关注。然而，肠-视网膜轴在DR发病和进展中的具体分子机制仍不明确，这阻碍了针对该轴的治疗策略的开发与临床应用。
本研究系统评估了QMG对抗糖尿病视网膜病变（DR）的疗效及其潜在机制。这些发现提供了初步证据，表明QMG可减轻视网膜组织病理学损伤，抑制全身性炎症，恢复肠道菌群稳态，并双向调节结肠和视网膜中以CMKLR1为核心的调控网络中的关键调节蛋白，从而确立QMG作为肠-视网膜轴潜在调节剂的作用。慢性、低...
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作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或可能被认为影响本文所报道工作的个人关系。
作者希望感谢 所有为完成本研究提供了大量支持与帮助的团队成员。
本研究得到国家自然科学基金（项目编号：82474580）以及成都中医药大学附属医院自由探索项目（编号：23ZYTS1601）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AP-1 单克隆抗体 | Proteintech | 66313-1-IG | 1:5000 |
| CMKLR1 多克隆抗体 | Affinity | AF5291 | 1:1000 |
| GAPDH 多克隆抗体 | Affinity | AF7021 | 1:5000 |
| GoatAnti-Mouse IgG(H+L) HRP | MULTI SCIENCES | GAM0072 | 1:10000 |
| GoatAnti-Rabbit IgG(H+L) HRP | MULTI SCIENCES | GAR0072 | 1:10000 |
| GraphPad Prism | / | version 9.5 | |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA | version 6.0 | |
| Luoning Bio-Cloud 平台 | http://www.biomediv.cn/login.html | ||
| 小鼠 IL-1β（白细胞介素-1β）ELISA 试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0037 | 血清细胞因子检测 |
| 小鼠 IL-6（白细胞介素-6）ELISA 试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0044 | 血清细胞因子检测 |
| 小鼠 TNF-α（肿瘤坏死因子-α）ELISA 试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3063 | 血清细胞因子检测 |
| NanoFilt | / | version 2.7.1 | |
| Nanopore GridION 测序仪 | Oxford Nanopore Technologies | https://store.nanoporetech.com/gridion.html | |
| Pannoramic SCAN II | 3DHISTECH Pannoramic SCAN 扫描仪 | https://www.3dhistech.com/scanners/pannoramic-scan-ii-digital-scanner/ | |
| PPAR gamma (PPAR-γ) 多克隆抗体 | ImmunoWay | bs-0530R | 1:1000 |
| Python | / | version 3.7.4 | |
| 启明颗粒 | 浙江三生蔓迪药业有限公司 | 中国国家药品批准文号 Z20090036 | 0.9 g/kg，口服灌胃 |
| R 编程语言 | / | version 4.0.3 | |
| SILVA 数据库 | / | version 138 | |
| 链脲佐菌素（STZ） | Sigma-Aldrich | S0130 | 35 mg/kg，腹腔注射 |
| TP53 多克隆抗体 | Abcam | ab131442 | 1:1000 |
| Usearch | / | version 10.0.240 | |
| Wnt5a 多克隆抗体 | Proteintech | 55184-1-AP | 1:1000 |
| Zymo Research BIOMICS DNA Microprep 试剂盒 | Zymo Research | D4301 | 粪便基因组 DNA 提取 |
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