这项针对六名接受粪菌移植的帕金森病患者的探索性研究，观察到肠道微生物多样性、分类组成及预测功能谱的时间变化，同时伴有运动和非运动症状的改善。这些发现为开展基于微生物群干预的进一步研究提供了初步证据。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
这项针对六名接受粪菌移植的帕金森病患者的探索性研究，观察到肠道微生物多样性、分类组成及预测功能谱的时间变化，同时伴有运动和非运动症状的改善。这些发现为开展基于微生物群干预的进一步研究提供了初步证据。
肠道微生物群的改变与帕金森病（PD）相关，但粪便微生物群移植（FMT）后肠道微生物的纵向变化及其与临床特征的关联仍不明确。本单中心回顾性观察性研究纳入了6例PD患者，根据病程长短分为高严重度和低严重度亚组。>6年 vs ≤6年）。在FMT前及之后每月连续五个月，共采集36份粪便样本。采用16S核糖体RNA基因测序评估微生物多样性、群落结构、分类组成及预测的功能谱。分析内容包括α和β多样性、分类丰度、线性判别分析效应大小（LDA effect size）、基于Tax4Fun2的功能预测，以及微生物特征与临床指标之间的Spearman秩相关性。描述性分析显示，在不同严重程度亚组之间以及FMT后不同时间点之间，微生物丰富度、多样性、群落结构和预测功能存在差异。在基线时，低严重程度亚组的微生物丰富度和多样性高于高严重程度亚组，且Bifidobacterium和Lactobacillus等分类群的相对丰度较高。FMT后一个月，高严重程度亚组的丰富度和多样性较基线升高，并伴随分类组成的改变。两个亚组在FMT后均表现出微生物多样性及预测的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集程度随时间变化的趋势。预测的功能包括碳水化合物和氨基酸代谢、次级代谢产物生物合成、膜转运以及信号转导。多个可操作分类单元（OTUs）与运动障碍、便秘、睡眠质量、功能状态及神经精神症状等指标相关。因此，FMT与肠道微生物多样性、组成及预测功能的纵向变化相关，且特定的微生物特征与运动及非运动指标相关。鉴于本研究为小样本回顾性队列，上述结果尚属初步，需在更大规模的对照研究中加以验证。未来的研究应明确这些微生物变化是否可重复、是否持续超过五个月、是否反映供体菌群定植，以及在帕金森病（PD）患者移植后是否与可测量的临床改善相对应。
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种常见的进行性神经退行性疾病，其特征为运动迟缓、肌强直、静止性震颤和姿势不稳1。尽管其发病机制尚未完全阐明，但已有研究表明多种因素，包括神经炎症、环境暴露和遗传易感性，在疾病的发生和发展中起着重要作用2。流行病学证据显示，PD 是老年人中最常见的神经系统疾病之一，与显著的致残负担相关，且患病率随年龄增长而升高3。目前的治疗方法，尤其是多巴胺替代疗法，可在一定程度上缓解运动症状，但对疾病进展及许多非运动症状的疗效仍有限，且不同个体对治疗的反应存在差异4。因此，进一步研究与 PD 相关的生物学改变及潜在治疗靶点在临床上仍具有重要意义。
肠道微生物群落在维持肠道屏障完整性、调节免疫反应和支持代谢稳态方面发挥着重要作用5。粪便微生物移植（FMT）是指将健康供体的粪便微生物群移植至受体体内，以恢复肠道微生物平衡6,7。多项动物研究表明，肠道微生物群移植可影响神经行为表型8,9。鉴于来自抑郁症或焦虑症患者的微生物群可在小鼠中诱导相应的行为改变，来自健康供体的微生物群可能改善行为学结局10。此外，初步的临床观察报道，在部分帕金森病（PD）和自闭症患者中进行FMT后症状有所改善，提示基于微生物群的干预措施在神经及神经精神疾病中可能具有潜在应用价值11,12。然而，这些效应背后的机制尚不明确，仍需开展临床研究以确立FMT在PD中的安全性和有效性。
尽管先前的研究已提示肠道微生物群与帕金森病（PD）之间存在关联，但粪菌移植（FMT）后肠道微生物组成随时间推移的变化及其与临床特征的关联仍不明确。目前尚不清楚不同临床严重程度的患者在FMT后是否表现出不同的微生物反应。
在这项单中心回顾性观察研究中，我们回顾了在常规临床实践中接受粪菌移植（FMT）的帕金森病（PD）患者。分析了FMT前后临床评分，并对可获取的粪便样本进行了16S rRNA基因测序，以探讨肠道微生物多样性、分类组成、预测的功能谱及其与临床指标的相关性。本研究旨在表征PD患者FMT后的临床结局和肠道菌群特征，为未来前瞻性对照研究提供初步证据。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究遵循赫尔辛基宣言的规定进行，研究方案经南京医科大学第二附属医院伦理委员会批准（批准号：2021-KY-100-01）。所有参与者均签署了书面知情同意书。
本研究为一项在南京医科大学第二附属医院神经内科开展的单中心回顾性观察研究。研究纳入了2022年1月至2023年12月期间符合《帕金森病诊断标准（2020年版）》的原发性帕金森病患者共32例。最终，有6例符合严格筛选标准并完成全部研究流程的患者被纳入后续分析。筛选、排除及随访的详细情况见补充图1。
粪便样本采集与微生物群落分析
粪便微生物群来自健康志愿者。供体筛选过程严格遵循《中国粪便微生物移植临床应用专家共识》。供体纳入标准：年龄18–40岁，无慢性疾病史；无胃肠道疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病或精神疾病史；近3个月内未使用抗生素、益生菌、免疫抑制剂或质子泵抑制剂；近6个月内无疫区旅行史、输血史或手术史。血液和粪便筛查用于排除传染性疾病和病原体，包括：人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum） 艰难梭菌, 沙门氏菌, 志贺氏菌, 弯曲杆菌，致病的 大肠杆菌，肠道病毒和寄生虫。单份有效粪便样本的体积应至少为50 g。使用自动化粪便微生物群纯化系统（参见 材料表)，每100 g新鲜粪便中加入500 mL无菌生理盐水，进行三轮标准化离心和洗涤（700 × g，3 分钟），在用无菌生理盐水以 1:2 体积比制备菌悬液后立即接种。受试者接受一次注射，注射 150 mL 菌悬液，其中含有约 5 × 10^13 个活菌13.
所有受体均通过结肠镜接受粪菌移植（FMT），将内镜送至盲肠和升结肠；通过活检通道缓慢且均匀地注入菌液，以促进菌群优先定植于右半结肠。输注后，患者保持右侧卧位至少2小时。操作前，患者需遵循低渣饮食3天，随后在操作前24小时改为全流质饮食，并在输注前6小时禁食固体、2小时前禁食液体。移植前一晚，使用聚乙二醇电解质溶液进行标准的全肠道清洁，直至排出清亮无粪便残渣的液体。药物使用限制包括：在FMT前至少72小时内停用全身性抗生素，并在术后1周内避免使用；质子泵抑制剂（PPIs）需在操作前24–48小时停用；泻药和益生菌则在移植当天暂停使用。
在操作过程中，持续监测心率、血压和血氧饱和度，并观察任何症状，如腹胀、腹痛或恶心；若出现严重腹痛或低血压，立即停止输注。移植后前7天进行每日随访，记录排便频率、粪便性状以及所有不良事件，包括腹痛、腹泻、发热和便血。长期随访持续至5个月，期间按计划采集粪便样本进行肠道微生物组分析，并采用统一帕金森病评定量表（UPDRS）和Wexner便秘评分进行临床评估，同时记录症状变化及合并用药情况，以全面评估疗效与安全性。
粪便样本在六个时间点采集：FMT 前以及 FMT 后 1、2、3、4 和 5 个月。所有参与者均接受了标准化的粪便样本采集指导。使用无菌镊子采集约 10–20 g 的中段粪便，置于无菌采集容器中。样本在采集后 2–3 小时内运送至实验室，并由经过培训的研究人员在无菌条件下分装至无菌的 1.5 mL 微量离心管（见材料表）。所有分装样本立即于 −80 °C 保存，直至进一步分析。
粪便样本采集后，所有样本均用干冰运输至一家商业测序服务提供商（见材料表）进行16S rRNA基因测序。文库构建、测序及初步质量控制均按照该提供商的标准操作流程进行。从每份粪便样本中提取基因组DNA，并利用引物341F和805R通过聚合酶链式反应（PCR）扩增细菌16S rRNA基因的V3–V4高变区。测序使用台式短读长测序平台（见材料表），采用2 × 300 bp双端测序策略，以表征患者在粪菌移植（FMT）前及FMT后不同随访时间点的肠道微生物谱。测序完成后，对原始读段进行处理，以获得高质量序列用于后续微生物分析。采用商业化的16S分类学注释软件包及其配套的微生物鉴定数据库进行物种分类（见材料表）。所得的分类谱用于后续的微生物多样性、群落组成、差异丰度以及微生物功能预测分析。
临床评估与分析标签
根据病程长短，将帕金森病（PD）患者分为两个严重程度组：高严重程度组（病程>6年，标记为“_H”）和低严重程度组（病程≤6年，标记为“_L”）。粪便微生物移植（FMT）前采集的粪便样本定义为基线样本，并根据对应的严重程度组标记为FB_H或FB_L。FMT后1、2、3、4和5个月采集的样本分别标记为高严重程度组的FP1M_H、FP2M_H、FP3M_H、FP4M_H和FP5M_H，以及低严重程度组的FP1M_L、FP2M_L、FP3M_L、FP4M_L和FP5M_L。评估的临床参数包括Wexner便秘评分、非运动症状量表（NMSS）、非运动症状问卷（NMSQ）、神经精神量表（NPI）、Hoehn–Yahr分期、日常生活能力量表（ADL）、匹兹堡睡眠质量指数（PSQI）、原始统一帕金森病评定量表（UPDRS I–VI）以及总UPDRS评分。采用描述性与推断性统计方法相结合的方式，分析高严重程度组（_H组）和低严重程度组（_L组）在六个时间点的PD临床指标变化。为初步探索各时间点间的组间差异，使用Wilcoxon秩和检验比较_H组与_L组在每个时间点的指标分布，并进一步采用带有患者特异性随机截距的更严格的线性混合模型（LMM）进行分析。由于样本量有限，混合效应模型的结果仅作为探索性参考。本探索性研究的主要终点为从基线至FMT后各时间点肠道微生物多样性和组成的改变，临床变化作为次要终点进行评估。
OTU 聚类、多样性分析与分类学丰度
采用操作分类单元（OTUs）来汇总微生物群落组成，将相似度≥97%的序列聚类到同一个OTU中。通过基于Shannon指数的稀疏曲线评估测序深度，曲线趋于平缓表明测序覆盖度通常足以进行后续的多样性分析。
使用Chao1指数和基于丰度的覆盖率估计值（ACE）指数评估微生物丰富度的α多样性，使用Shannon指数和Simpson指数评估整体多样性和均匀性。β多样性通过加权和非加权UniFrac距离进行评估，并随后采用主坐标分析（PCoA）来可视化各组间微生物群落组成的差异。组间α多样性和β多样性的差异分别采用非参数检验和置换多元方差分析（PERMANOVA）进行评估，具体方法见统计分析部分。
基于16S rRNA基因测序数据，在门、纲、目、科和属水平上总结了分类组成。使用R语言的群落生态学分析软件包（见材料表），识别并可视化每个分类层级中丰度最高的前10个分类单元。采用柱状图展示分类谱型，并利用箱形图对选定的分类单元在不同组间进行进一步比较。
微生物分类群的差异丰度分析
使用线性判别分析效应大小（LEfSe）方法鉴定预定义组间差异富集的分类群。LEfSe 结合了 Kruskal–Wallis 检验、Wilcoxon 检验和线性判别分析（LDA），用于识别具有统计学显著性和判别价值的分类群。将 P < 0.05 且 LDA 得分（log10）> 3 的分类群视为差异富集。通过分类条形图可视化展示判别性分类群的相对丰度。
功能预测与临床相关性分析
利用Tax4Fun2基于16S rRNA基因测序数据推断肠道微生物群的预测功能谱，并根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行注释。采用LEfSe分析鉴定差异富集的预测通路，筛选阈值为P < 0.05且LDA得分（log10）> 3。由于这些功能谱是通过推断而非宏基因组学或代谢组学方法直接测定获得，因此结果应解释为预测的功能差异。采用Spearman秩相关分析探索微生物特征与临床指标之间的关联性。
统计分析
统计分析使用 R 软件进行（见材料表）。临床变量以中位数和范围（最小值–最大值）进行汇总。组间α多样性指数的比较采用Wilcoxon秩和检验，而β多样性的评估则通过PERMANOVA方法进行，置换次数为999次。差异富集的分类群及预测的功能通路采用LEfSe方法识别，显著性阈值设定为P < 0.05，且LDA得分（log10）> 3。对于纵向差异丰度分析，采用包含患者特异性随机截距的混合效应模型，随后进行Benjamini-Hochberg法校正的假发现率事后成对比较。Spearman秩相关分析用于评估肠道微生物特征与临床指标之间的关联，并对相关性P值应用Benjamini–Hochberg假发现率校正。双侧P < 0.05 被认为具有统计学显著性。对相关性分析和分类群丰度分析均进行了多重比较校正。鉴于样本量较小且采用重复纵向采样设计，本研究的统计分析被视为探索性分析，结果解释持谨慎态度。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
患者选择与基线特征
最终分析纳入了6名帕金森病患者，包括3名男性和3名女性。中位年龄为69.0岁（范围为61–75岁），中位体重指数为22.6 kg/m2。队列中包括2名以强直为主的、2名以震颤为主的以及2名混合型临床表型的患者。基线临床特征见表1。
高严重程度和低严重程度帕金森病亚组之间的临床特征存在差异（表1）。在此探索性队列中，FB_H组的UPDRS总分高于FB_L组，与预定义的严重程度分类一致，表明整体运动功能障碍更为严重。在多个运动和非运动临床参数中也观察到差异，包括UPDRS各分量表、匹兹堡睡眠质量指数（PSQI）、Wexner便秘评分、日常生活活动能力量表（ADL）以及非运动症状量表（NMSS）。这些结果提示，预定义的严重程度亚组不仅在运动疾病分期上存在差异，还在多种非运动症状及功能特征方面有所不同。
使用折线图对每位患者的关键临床指标...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
粪菌移植（FMT）是一种基于微生物群的干预手段，通过将健康供体的粪便微生物群移植至受体肠道内，以恢复肠道微生物平衡14。越来越多的证据表明，肠道微生物群在维持神经系统稳态中发挥重要作用15。来自肠-脑轴双向通路的研究证据提示，肠道微生物群可能影响帕金森病（PD）中的中枢神经系统炎症、神经递质代谢及行为反应16,17。因此，微生物群移植作为一种潜在干预手段受到关注，尽管其在神经精神和神经退行性疾病中的临床应用仍处于探索阶段18。本项单中心回顾性观察性研究评估了在常规临床实践中接受粪菌移植（FMT）的帕金森病患者临床结局、安全性以及肠道微生物群的探索性特征。我们观察到，在不同帕金森病严重程度亚组及FMT后不同时间点，患者的肠道微生物丰富度、多样性、群落结构及预测功能谱存在差异。这些发现提示，肠道微生物谱可能随疾病严重程度而变化，并在FMT干预后发生动态改变。因此，这些结果应仅视为假设...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
利益冲突：作者声明无利益冲突。
我们感谢所有协助和支持本研究的同事们。他们的合作与鼓励对我们的工作具有不可估量的价值。
基金资助：本研究由江苏省老年健康重点计划（LKZ2022004）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MiSeq 系统 | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | 用于16S rRNA V3区测序的台式短读长测序平台–V4 可变区扩增子测序与 2 × 300 bp 双端测序化学技术。 |
| 宏基因组@KIN | World Fusion Co., Ltd. | v2.2.1；https://www.w-fusion.com/metagenome | 用于16S rRNA分类学指派和微生物群落分析的商业软件。 |
| 微生物鉴定数据库（细菌） | TechnoSuruga 实验室有限公司 | DB-BA，数据库版本10.0；https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/ | 用于微生物鉴定的细菌16S rDNA参考数据库 |
| 341F 引物 | BGI Genomics Co., Ltd. | 定制寡核苷酸；无目录号 | 正向引物序列：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′. |
| 805R 引物 | 华大基因有限公司 | 定制寡核苷酸；无目录号 | 反向引物序列：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. |
| 16S rRNA基因测序服务 | BGI Genomics Co., Ltd.（中国武汉） | https://www.bgi.com/us/sequencing-services/rna-sequencing-solutions/16s18s-its-sequencing/ | 商业测序服务提供商；负责文库构建、测序及初步质量控制。 |
| Eppendorf Safe-Lock 微量离心管，Biopur，1.5 mL | Eppendorf SE | '0030121589 | 用于分装粪便样本以在以下条件下储存的无菌聚丙烯管 −80 °C. |
| LEfSe | Segata 实验室/bioBakery | v1.1.2；https://github.com/SegataLab/lefse | 用于识别差异丰度分类群和预测通路的线性判别分析效应量软件。 |
| Tax4Fun2 | Tax4Fun2 开发团队 | v1.1.5；https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2 | 用于从16S rRNA数据推断京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能谱的R软件包。 |
| microeco R 包 | Chi Liu 及其贡献者 | v1.15.0；https://cran.r-project.org/package=microeco | 用于微生物丰度与多样性分析的群落生态学分析与可视化软件包。 |
| R 软件 | R 统计计算基金会 | 版本未报告；https://www.r-project.org/ | 用于临床和微生物组分析的统计计算环境；具体版本应由作者确认。 |
| GenFMTer 自动化粪便微生物群纯化系统 | 南京正序医疗科技有限公司 | 模型：GenFMTer；https://en.fmtmed.com/ | 用于标准化离心、洗涤及制备粪便微生物群悬液的自动化系统 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。