这项针对六名接受粪菌移植的帕金森病患者的探索性研究，观察到肠道微生物多样性、分类组成及预测功能谱的时间变化，同时伴有运动和非运动症状的改善。这些发现为开展基于微生物群干预的进一步研究提供了初步证据。
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摘要
摘要
肠道微生物群的改变与帕金森病（PD）相关，但粪便微生物群移植（FMT）后肠道微生物的纵向变化及其与临床特征的关联仍不明确。本单中心回顾性观察性研究纳入了6例PD患者，根据病程长短分为高严重度和低严重度亚组。>6年 vs ≤6年）。在FMT前及之后每月连续五个月，共采集36份粪便样本。采用16S核糖体RNA基因测序评估微生物多样性、群落结构、分类组成及预测的功能谱。分析内容包括α和β多样性、分类丰度、线性判别分析效应大小（LDA effect size）、基于Tax4Fun2的功能预测，以及微生物特征与临床指标之间的Spearman秩相关性。描述性分析显示，在不同严重程度亚组之间以及FMT后不同时间点之间，微生物丰富度、多样性、群落结构和预测功能存在差异。在基线时，低严重程度亚组的微生物丰富度和多样性高于高严重程度亚组，且Bifidobacterium和Lactobacillus等分类群的相对丰度较高。FMT后一个月，高严重程度亚组的丰富度和多样性较基线升高，并伴随分类组成的改变。两个亚组在FMT后均表现出微生物多样性及预测的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集程度随时间变化的趋势。预测的功能包括碳水化合物和氨基酸代谢、次级代谢产物生物合成、膜转运以及信号转导。多个可操作分类单元（OTUs）与运动障碍、便秘、睡眠质量、功能状态及神经精神症状等指标相关。因此，FMT与肠道微生物多样性、组成及预测功能的纵向变化相关，且特定的微生物特征与运动及非运动指标相关。鉴于本研究为小样本回顾性队列，上述结果尚属初步，需在更大规模的对照研究中加以验证。未来的研究应明确这些微生物变化是否可重复、是否持续超过五个月、是否反映供体菌群定植，以及在帕金森病（PD）患者移植后是否与可测量的临床改善相对应。
引言
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种常见的进行性神经退行性疾病，其特征为运动迟缓、肌强直、静止性震颤和姿势不稳1。尽管其发病机制尚未完全阐明，但已有研究表明多种因素，包括神经炎症、环境暴露和遗传易感性，在疾病的发生和发展中起着重要作用2。流行病学证据显示，PD 是老年人中最常见的神经系统疾病之一，与显著的致残负担相关，且患病率随年龄增长而升高3。目前的治疗方法，尤其是多巴胺替代疗法，可在一定程度上缓解运动症状，但对疾病进展及许多非运动症状的疗效仍有限，且不同个体对治疗的反应存在差异4。因此，进一步研究与 PD 相关的生物学改变及潜在治疗靶点在临床上仍具有重要意义。
肠道微生物群落在维持肠道屏障完整性、调节免疫反应和支持代谢稳态方面发挥着重要作用5。粪便微生物移植（FMT）是指将健康供体的粪便微生物群移植至受体体内，以恢复肠道微生物平衡6,7。多项动物研究表明，肠道微生物群移植可影响神经行为表型8,9。鉴于来自抑郁症或焦虑症患者的微生物群可在小鼠中诱导相应的行为改变，来自健康供体的微生物群可能改善行为学结局10。此外，初步的临床观察报道，在部分帕金森病（PD）和自闭症患者中进行FMT后症状有所改善，提示基于微生物群的干预措施在神经及神经精神疾病中可能具有潜在应用价值11,12。然而，这些效应背后的机制尚不明确，仍需开展临床研究以确立FMT在PD中的安全性和有效性。
尽管先前的研究已提示肠道微生物群与帕金森病（PD）之间存在关联，但粪菌移植（FMT）后肠道微生物组成随时间推移的变化及其与临床特征的关联仍不明确。目前尚不清楚不同临床严重程度的患者在FMT后是否表现出不同的微生物反应。
在这项单中心回顾性观察研究中，我们回顾了在常规临床实践中接受粪菌移植（FMT）的帕金森病（PD）患者。分析了FMT前后临床评分，并对可获取的粪便样本进行了16S rRNA基因测序，以探讨肠道微生物多样性、分类组成、预测的功能谱及其与临床指标的相关性。本研究旨在表征PD患者FMT后的临床结局和肠道菌群特征，为未来前瞻性对照研究提供初步证据。
方案
本研究遵循赫尔辛基宣言的规定进行，研究方案经南京医科大学第二附属医院伦理委员会批准（批准号：2021-KY-100-01）。所有参与者均签署了书面知情同意书。
本研究为一项在南京医科大学第二附属医院神经内科开展的单中心回顾性观察研究。研究纳入了2022年1月至2023年12月期间符合《帕金森病诊断标准（2020年版）》的原发性帕金森病患者共32例。最终，有6例符合严格筛选标准并完成全部研究流程的患者被纳入后续分析。筛选、排除及随访的详细情况见补充图1。
粪便样本采集与微生物群落分析
粪便微生物群来自健康志愿者。供体筛选过程严格遵循《中国粪便微生物移植临床应用专家共识》。供体纳入标准：年龄18–40岁，无慢性疾病史；无胃肠道疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病或精神疾病史；近3个月内未使用抗生素、益生菌、免疫抑制剂或质子泵抑制剂；近6个月内无疫区旅行史、输血史或手术史。血液和粪便筛查用于排除传染性疾病和病原体，包括：人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum） 艰难梭菌, 沙门氏菌, 志贺氏菌, 弯曲杆菌，致病的 大肠杆菌，肠道病毒和寄生虫。单份有效粪便样本的体积应至少为50 g。使用自动化粪便微生物群纯化系统（参见 材料表)，每100 g新鲜粪便中加入500 mL无菌生理盐水，进行三轮标准化离心和洗涤（700 × g，3 分钟），在用无菌生理盐水以 1:2 体积比制备菌悬液后立即接种。受试者接受一次注射，注射 150 mL 菌悬液，其中含有约 5 × 10^13 个活菌13.
所有受体均通过结肠镜接受粪菌移植（FMT），将内镜送至盲肠和升结肠；通过活检通道缓慢且均匀地注入菌液，以促进菌群优先定植于右半结肠。输注后，患者保持右侧卧位至少2小时。操作前，患者需遵循低渣饮食3天，随后在操作前24小时改为全流质饮食，并在输注前6小时禁食固体、2小时前禁食液体。移植前一晚，使用聚乙二醇电解质溶液进行标准的全肠道清洁，直至排出清亮无粪便残渣的液体。药物使用限制包括：在FMT前至少72小时内停用全身性抗生素，并在术后1周内避免使用；质子泵抑制剂（PPIs）需在操作前24–48小时停用；泻药和益生菌则在移植当天暂停使用。
在操作过程中，持续监测心率、血压和血氧饱和度，并观察任何症状，如腹胀、腹痛或恶心；若出现严重腹痛或低血压，立即停止输注。移植后前7天进行每日随访，记录排便频率、粪便性状以及所有不良事件，包括腹痛、腹泻、发热和便血。长期随访持续至5个月，期间按计划采集粪便样本进行肠道微生物组分析，并采用统一帕金森病评定量表（UPDRS）和Wexner便秘评分进行临床评估，同时记录症状变化及合并用药情况，以全面评估疗效与安全性。
粪便样本在六个时间点采集：FMT 前以及 FMT 后 1、2、3、4 和 5 个月。所有参与者均接受了标准化的粪便样本采集指导。使用无菌镊子采集约 10–20 g 的中段粪便，置于无菌采集容器中。样本在采集后 2–3 小时内运送至实验室，并由经过培训的研究人员在无菌条件下分装至无菌的 1.5 mL 微量离心管（见材料表）。所有分装样本立即于 −80 °C 保存，直至进一步分析。
粪便样本采集后，所有样本均用干冰运输至一家商业测序服务提供商（见材料表）进行16S rRNA基因测序。文库构建、测序及初步质量控制均按照该提供商的标准操作流程进行。从每份粪便样本中提取基因组DNA，并利用引物341F和805R通过聚合酶链式反应（PCR）扩增细菌16S rRNA基因的V3–V4高变区。测序使用台式短读长测序平台（见材料表），采用2 × 300 bp双端测序策略，以表征患者在粪菌移植（FMT）前及FMT后不同随访时间点的肠道微生物谱。测序完成后，对原始读段进行处理，以获得高质量序列用于后续微生物分析。采用商业化的16S分类学注释软件包及其配套的微生物鉴定数据库进行物种分类（见材料表）。所得的分类谱用于后续的微生物多样性、群落组成、差异丰度以及微生物功能预测分析。
临床评估与分析标签
根据病程长短，将帕金森病（PD）患者分为两个严重程度组：高严重程度组（病程>6年，标记为“_H”）和低严重程度组（病程≤6年，标记为“_L”）。粪便微生物移植（FMT）前采集的粪便样本定义为基线样本，并根据对应的严重程度组标记为FB_H或FB_L。FMT后1、2、3、4和5个月采集的样本分别标记为高严重程度组的FP1M_H、FP2M_H、FP3M_H、FP4M_H和FP5M_H，以及低严重程度组的FP1M_L、FP2M_L、FP3M_L、FP4M_L和FP5M_L。评估的临床参数包括Wexner便秘评分、非运动症状量表（NMSS）、非运动症状问卷（NMSQ）、神经精神量表（NPI）、Hoehn–Yahr分期、日常生活能力量表（ADL）、匹兹堡睡眠质量指数（PSQI）、原始统一帕金森病评定量表（UPDRS I–VI）以及总UPDRS评分。采用描述性与推断性统计方法相结合的方式，分析高严重程度组（_H组）和低严重程度组（_L组）在六个时间点的PD临床指标变化。为初步探索各时间点间的组间差异，使用Wilcoxon秩和检验比较_H组与_L组在每个时间点的指标分布，并进一步采用带有患者特异性随机截距的更严格的线性混合模型（LMM）进行分析。由于样本量有限，混合效应模型的结果仅作为探索性参考。本探索性研究的主要终点为从基线至FMT后各时间点肠道微生物多样性和组成的改变，临床变化作为次要终点进行评估。
OTU 聚类、多样性分析与分类学丰度
采用操作分类单元（OTUs）来汇总微生物群落组成，将相似度≥97%的序列聚类到同一个OTU中。通过基于Shannon指数的稀疏曲线评估测序深度，曲线趋于平缓表明测序覆盖度通常足以进行后续的多样性分析。
使用Chao1指数和基于丰度的覆盖率估计值（ACE）指数评估微生物丰富度的α多样性，使用Shannon指数和Simpson指数评估整体多样性和均匀性。β多样性通过加权和非加权UniFrac距离进行评估，并随后采用主坐标分析（PCoA）来可视化各组间微生物群落组成的差异。组间α多样性和β多样性的差异分别采用非参数检验和置换多元方差分析（PERMANOVA）进行评估，具体方法见统计分析部分。
基于16S rRNA基因测序数据，在门、纲、目、科和属水平上总结了分类组成。使用R语言的群落生态学分析软件包（见材料表），识别并可视化每个分类层级中丰度最高的前10个分类单元。采用柱状图展示分类谱型，并利用箱形图对选定的分类单元在不同组间进行进一步比较。
微生物分类群的差异丰度分析
使用线性判别分析效应大小（LEfSe）方法鉴定预定义组间差异富集的分类群。LEfSe 结合了 Kruskal–Wallis 检验、Wilcoxon 检验和线性判别分析（LDA），用于识别具有统计学显著性和判别价值的分类群。将 P < 0.05 且 LDA 得分（log10）> 3 的分类群视为差异富集。通过分类条形图可视化展示判别性分类群的相对丰度。
功能预测与临床相关性分析
利用Tax4Fun2基于16S rRNA基因测序数据推断肠道微生物群的预测功能谱，并根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行注释。采用LEfSe分析鉴定差异富集的预测通路，筛选阈值为P < 0.05且LDA得分（log10）> 3。由于这些功能谱是通过推断而非宏基因组学或代谢组学方法直接测定获得，因此结果应解释为预测的功能差异。采用Spearman秩相关分析探索微生物特征与临床指标之间的关联性。
统计分析
统计分析使用 R 软件进行（见材料表）。临床变量以中位数和范围（最小值–最大值）进行汇总。组间α多样性指数的比较采用Wilcoxon秩和检验，而β多样性的评估则通过PERMANOVA方法进行，置换次数为999次。差异富集的分类群及预测的功能通路采用LEfSe方法识别，显著性阈值设定为P < 0.05，且LDA得分（log10）> 3。对于纵向差异丰度分析，采用包含患者特异性随机截距的混合效应模型，随后进行Benjamini-Hochberg法校正的假发现率事后成对比较。Spearman秩相关分析用于评估肠道微生物特征与临床指标之间的关联，并对相关性P值应用Benjamini–Hochberg假发现率校正。双侧P < 0.05 被认为具有统计学显著性。对相关性分析和分类群丰度分析均进行了多重比较校正。鉴于样本量较小且采用重复纵向采样设计，本研究的统计分析被视为探索性分析，结果解释持谨慎态度。
结果
患者选择与基线特征
最终分析纳入了6名帕金森病患者，包括3名男性和3名女性。中位年龄为69.0岁（范围为61–75岁），中位体重指数为22.6 kg/m2。队列中包括2名以强直为主的、2名以震颤为主的以及2名混合型临床表型的患者。基线临床特征见表1。
高严重程度和低严重程度帕金森病亚组之间的临床特征存在差异（表1）。在此探索性队列中，FB_H组的UPDRS总分高于FB_L组，与预定义的严重程度分类一致，表明整体运动功能障碍更为严重。在多个运动和非运动临床参数中也观察到差异，包括UPDRS各分量表、匹兹堡睡眠质量指数（PSQI）、Wexner便秘评分、日常生活活动能力量表（ADL）以及非运动症状量表（NMSS）。这些结果提示，预定义的严重程度亚组不仅在运动疾病分期上存在差异，还在多种非运动症状及功能特征方面有所不同。
使用折线图对每位患者的关键临床指标进行了可视化展示（图1）。如图所示，在接受粪菌移植（FMT）后，无论基线疾病严重程度如何，所有六名患者的NMSQ、NMSS、NPI、PSQI、UPDRS总分和Wexner评分均呈现出持续下降的趋势。值得注意的是，尽管_H组患者的基线评分较高，但其临床改善幅度较_L组更为显著。临床比较显示，高严重程度组与低严重程度组之间存在持续差异。大多数特定时间点的组间比较具有显著性差异，所有汇总的临床指标在两组间均存在差异，混合效应模型进一步证实低严重程度组的症状负担更轻，日常功能更佳。
帕金森病患者 FMT 后的不良事件
FMT 后记录的不良事件汇总于表 2中。最常报告的事件为腹胀、腹泻、便秘加重以及恶心/呕吐，各有两名患者出现上述症状。一名患者报告了腹痛。未记录到发热情况，且无患者因不良事件而终止 FMT。这些结果提示，在此小样本队列中，胃肠道症状是最常见的记录不良事件；然而，由于样本量有限，安全性结果应谨慎解读。
足够的多样性覆盖及群体特异性OTU的鉴定
稀释曲线分析显示，随着测序深度的增加，Shannon 指数逐渐趋于平缓，表明测序深度总体足以评估各样本间的微生物多样性（图 2A）。所有样本中共鉴定出 80 个 OTU。这一相对较少的 OTU 数量与本探索性研究的测序深度和有限的样本量相符。Venn 图分析揭示了 12 个组之间共有的和特有的 OTU（图 2B）。共检测到 80 个 OTU，其中 53 个 OTU 为所有组共有。各组中特有的 OTU 数量分别为：FB_H 组 2 个，FB_L 组 12 个，FP1M_H 组 4 个，FP1M_L 组 0 个，FP2M_H 组 1 个，FP2M_L 组 0 个，FP3M_H 组 4 个，FP3M_L 组 0 个，FP4M_H 组 0 个，FP4M_L 组 1 个，FP5M_H 组 1 个，FP5M_L 组 2 个。在这些组中，FB_L 组特有的 OTU 数量最多，而 FP1M_L、FP2M_L、FP3M_L 和 FP4M_H 组在本分析中未检测到特有的 OTU。这些结果表明，PD 亚组共享一组核心 OTU，而部分组别表现出有限的组特异性 OTU 模式。
不同帕金森病严重程度亚组之间的微生物多样性及预测功能谱存在差异
FB_L 组的α多样性高于 FB_H 组，表现为 Chao1、ACE、Shannon 和 Simpson 指数升高（图 3A）。基于 UniFrac 的主坐标分析（PCoA）显示两个严重程度亚组之间存在明显分离，提示肠道微生物群落结构存在差异（图 3B）。在门水平上，FB_L 组中厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度较高，而 FB_H 组则以拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）的丰度较高为特征（图 3C）。在属水平上，Bacteroides、Megasphaera 和 Escherichia 在 FB_H 组中更为丰富，而 Bifidobacterium 和 Lactobacillus 在 FB_L 组中丰度更高（图 3D）。
LEfSe 分析鉴定了与严重程度相关的差异富集分类群。拟杆菌门/拟杆菌属相关分类群和变形菌门相关分类群在 FB_H 中富集，而 双歧杆菌-、放线菌门-、厚壁菌门-、梭菌纲- 和 副杆菌属-相关类群在 FB_L 中富集图3E). 预测的KEGG通路分析也显示各组之间具有不同的功能谱型。FB_H主要富集于预测的全局代谢、碳水化合物和能量代谢、信号转导、双组分系统以及脂多糖生物合成相关通路。相比之下，FB_L则主要富集于预测的次级代谢产物生物合成、氨基酸代谢、核苷酸代谢、复制与修复、群体感应、膜转运以及ABC转运蛋白相关通路（图3F这些发现表明，帕金森病严重程度亚组在微生物多样性、分类组成以及预测功能潜力方面存在差异。
粪菌移植一个月后，FP1M_H亚组显示出更高的微生物多样性及不同的预测功能谱
与 FB_H 相比，FP1M_H 的 α 多样性更高，表现为 Chao1、ACE、Shannon 和 Simpson 指数升高（图 4A）。基于 UniFrac 的主坐标分析（PCoA）显示 FB_H 与 FP1M_H 之间存在明显分离，提示粪便微生物移植（FMT）后一个月肠道微生物群落结构发生改变（图 4B）。在门水平上，FP1M_H 中厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）的相对丰度较高，而 FB_H 中拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）的丰度较高（图 4C）。在属水平上，FP1M_H 中双歧杆菌属（Bifidobacterium）、阿克曼菌属（Akkermansia）、肠球菌属（Enterococcus）和乳杆菌属（Lactobacillus）的丰度更高，而 FB_H 中拟杆菌属（Bacteroides）、巨球菌属（Megasphaera）和埃希菌属（Escherichia）的丰度更高（图 4D）。
LEfSe 分析鉴定了组间差异富集的分类群。拟杆菌门/拟杆菌属相关分类群在 FB_H 组中富集，而厚壁菌门、放线菌门、梭菌纲相关分类群 双歧杆菌属，且FP1M_H组中富集了与Acidaminococcus相关的分类群图4E). 预测的KEGG通路分析显示，FB_H在信号转导、双组分系统、碳水化合物代谢、脂质代谢、能量代谢以及辅因子/维生素代谢相关通路中富集。相比之下，FP1M_H在氨基酸代谢、核苷酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、复制与修复、翻译、次级代谢物生物合成、群体感应、ABC转运蛋白以及膜转运相关预测通路中富集。图4F这些结果表明，在重症亚组中，粪便微生物移植（FMT）与微生物多样性增加以及分类学组成和预测功能潜力的变化相关。
FB_L组与FP1M_L组在微生物丰富度、分类组成以及预测功能谱方面存在差异
与 FB_L 相比，FP1M_L 显示出更高的微生物丰富度，表现为 Chao1 和 ACE 指数升高，而 Shannon 和 Simpson 指数在两组间无显著差异（图 5A）。基于 UniFrac 的 PCoA 分析显示 FB_L 与 FP1M_L 之间存在明显分离，提示 FMT 后微生物群落组成存在差异（图 5B）。在门水平上，FP1M_L 中放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、协同菌门（Synergistetes）和广古菌门（Euryarchaeota）的相对丰度较高，而 FB_L 中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）更为丰富（图 5C）。在属水平上，FP1M_L 中双歧杆菌属（Bifidobacterium）、阿克曼菌属（Akkermansia）和副拟杆菌属（Parabacteroides）的丰度更高，而 FB_L 中拟杆菌属（Bacteroides）和乳杆菌属（Lactobacillus）的丰度更高（图 5D）。
LEfSe 分析显示，FB_L 中富集了与厚壁菌门（Firmicutes）、梭菌纲（Clostridia）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）相关的分类群，而 FP1M_L 中则富集了与拟杆菌门（Bacteroidetes）、拟杆菌目（Bacteroidales）、Parabacteroides、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）、梭杆菌门（Synergistetes）、Alistipes 和理研菌科（Rikenellaceae）相关的分类群（图 5E）。预测的 KEGG 通路分析表明，FB_L 富集于信号转导、双组分系统、碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢以及磷酸转移酶系统相关通路。FP1M_L 则在预测的全局代谢通路、氨基酸代谢、翻译、氨基酸生物合成、次级代谢产物生物合成以及遗传信息处理相关通路中富集（图 5F）。这些结果表明，在轻度亚组中，粪菌移植（FMT）主要与微生物丰富度的增加以及分类组成和预测功能潜力的变化相关。
在不同粪菌移植后时间点，重症帕金森病亚组之间的肠道微生物多样性、分类组成及预测功能谱存在差异
在五个高严重程度帕金森病亚组（FP1M_H 至 FP5M_H）之间进行的α多样性分析显示，各时间点的微生物丰富度和多样性存在差异（图6A）。在这些亚组中，FP2M_H 的 Chao1、ACE、Shannon 和 Simpson 指数最低，而 FP1M_H、FP3M_H、FP4M_H 和 FP5M_H 的指数相对较高。基于加权和非加权 UniFrac 距离的β多样性分析在 PCoA 图中显示出五个亚组之间的分离，表明粪便微生物移植（FMT）后不同时间点的肠道微生物群落组成存在差异（图6B）。在门水平上，图6C展示了丰度最高的10个分类群。拟杆菌门（Bacteroidetes）在 FP3M_H、FP4M_H 和 FP5M_H 中相对更丰富，而厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）在 FP1M_H 中更丰富。疣微菌门（Verrucomicrobia）在 FP2M_H 中相对富集。在属水平上，Bacteroides 在 FP3M_H、FP4M_H 和 FP5M_H 中相对更丰富，而 Akkermansia 和 Escherichia 在 FP2M_H 中更丰富。Bifidobacterium 在 FP1M_H 中相对富集（图6D）。LEfSe 分析识别出多个高严重程度亚组间显著差异的富集分类群（图6E），包括 FP1M_H 中与厚壁菌门、放线菌门、Bifidobacterium 和梭菌纲（Clostridia）相关的分类群；FP2M_H 中与变形菌门（Proteobacteria）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）相关的分类群；FP3M_H 中与拟杆菌门和Bacteroides相关的分类群；以及 FP4M_H 中与 Synergistetes 相关的分类群。基于 KEGG 通路注释的预测功能谱分析显示了各亚组特有的富集模式（图6F）。FP1M_H 在淀粉和蔗糖代谢以及其他次级代谢产物的生物合成通路中预测为富集；FP2M_H 在辅因子和维生素代谢以及能量代谢通路中预测为富集；FP5M_H 在信号转导和双组分系统通路中预测为富集。这些结果表明，高严重程度帕金森病亚组在粪便微生物移植后表现出微生物多样性、分类组成及预测功能谱的时序性变化。
不同严重程度较低的帕金森病亚组在FMT后不同时间点的肠道微生物多样性、分类组成及预测功能谱存在差异
在五个低严重程度帕金森病亚组（FP1M_L 至 FP5M_L）之间进行的α多样性分析显示，不同时间点的微生物丰富度和多样性存在差异（图7A）。FP2M_L的Chao1和ACE指数相对较低，而FP4M_L和FP5M_L的Shannon和Simpson指数相对较高，表明低严重程度亚组之间的丰富度和均匀度存在差异。基于加权和非加权UniFrac距离的β多样性分析在PCoA图中显示出五个亚组之间的分离，表明FMT后不同时间点肠道微生物群落组成存在差异（图7B）。在门水平上，丰度最高的10个分类群如图7C所示。拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）在各组中占主导地位，放线菌门（Actinobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）在FP1M_L中相对富集，而厚壁菌门在FP3M_L中相对更丰富。在属水平上，FP1M_L中双歧杆菌属（Bifidobacterium）和阿克曼菌属（Akkermansia）相对更丰富，而FP2M_L中拟杆菌属（Bacteroides）相对更丰富（图7D）。LEfSe分析鉴定了多个低严重程度亚组中与亚组相关的差异富集分类群（图7E），包括FP1M_L中与瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）相关的分类群，FP2M_L中与厚壁菌门和梭菌目（Clostridiales）相关的分类群，FP3M_L中与Synergistetes相关的分类群，以及FP4M_L中与拟杆菌门（Bacteroidetes）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、放线菌门（Actinobacteria）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）相关的分类群。基于KEGG通路注释的预测功能谱分析显示了各亚组特有的富集模式（图7F）。FP1M_L在次级代谢物生物合成通路中预测为富集，FP2M_L在信号转导、双组分系统、环境信息处理、细胞群落-原核生物以及碳水化合物代谢相关通路中预测为富集，FP3M_L在膜转运、群体感应、复制与修复以及磷酸转移酶系统中预测为富集，FP4M_L在遗传信息处理相关通路中预测为富集，FP5M_L在代谢及代谢通路中预测为富集。这些结果表明，低严重程度帕金森病亚组在FMT后表现出微生物多样性、分类组成和预测功能谱的时序性变化。
帕金森病中特定OTU与临床指标之间的关联
为了探讨帕金森病（PD）中肠道微生物改变与临床特征之间的关联，在进行多重比较校正后，对前50个OTU-临床参数相关性进行了可视化展示，共对应23个独特的OTU（图8）。多个OTU在多种临床指标中表现出相似的相关性模式。例如，OTU165、OTU67、OTU230、OTU154、OTU72以及若干其他OTU与Wexner评分、Hoehn–Yahr分期、PSQI评分以及多个与UPDRS相关的指标呈正相关，而与日常生活能力量表（ADL）和神经精神量表（NPI）呈负相关。相反，OTU10（Parabacteroides）和OTU45（Fusobacterium）在多个临床变量上表现出相反的相关模式。OTU165在门水平上被注释为厚壁菌门（Firmicutes），其与便秘严重程度、疾病分期、睡眠障碍以及多个UPDRS组分呈正相关，而与ADL量表和NPI呈负相关。类似地，OTU67（Porphyromonadaceae）也与多个运动和非运动临床指标相关。总体而言，这些结果提示特定OTU与帕金森病的多种临床指标存在关联，但这些相关性应谨慎解读，仅可视为产生假设，而非因果关系的证据。
数据可用性：
本研究的补充材料可在 DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.21620775 获取。
图1：帕金森病患者粪便微生物移植后临床评分的纵向变化。折线图显示了高严重程度组（H）和低严重程度组（L）在粪便微生物移植前基线期（FB）以及移植后1、2、3、4和5个月（FP1M–FP5M）期间，NMSQ、NMSS、NPI、PSQI、UPDRS总分及Wexner便秘评分的变化情况。数据点表示组水平的汇总值，误差线表示相应的变异程度/范围。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：各组间的稀释曲线与OTU比较。（A）香农稀释曲线，显示测序深度与微生物多样性的关系。横轴表示测序深度，纵轴表示香农多样性指数。曲线逐渐趋于平缓，表明测序深度总体足以用于多样性评估。（B）维恩图，展示12个组之间共有和特有的OTU。中心数字表示所有组共有的OTU数量，外围区域的数字表示各组独有的OTU数量。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：FB_H组与FB_L组之间的微生物多样性、分类组成及预测功能差异。（A）基于Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数的α多样性分析。（B）基于加权和非加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）。（C,D）门（C）和属（D）水平上前10位肠道微生物类群的相对丰度，以堆叠柱状图和箱形图表示。（E）LEfSe分析显示FB_H组与FB_L组间差异富集的微生物类群。（F）预测的KEGG功能通路的LEfSe分析。正负LDA得分分别表示在不同组中富集的通路。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 请点击此处查看该图的高清版本。
图4：FP1M_H组与FB_H组之间的微生物多样性、分类组成及预测功能差异。（A）基于Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数的α多样性分析。（B）基于加权和非加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）。（C,D）门（C）和属（D）水平上肠道微生物前10个分类群的相对丰度，以堆叠柱状图和箱线图表示。（E）LEfSe分析显示FP1M_H组与FB_H组间差异富集的分类群。（F）预测的KEGG功能通路的LEfSe分析。正负LDA得分分别表示在不同组中富集的通路。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：FB_L 组与 FP1M_L 组之间的微生物及功能差异。（A）FB_L 组与 FP1M_L 组的 Alpha 多样性分析。（B）FB_L 组与 FP1M_L 组的 Beta 多样性分析。（C,D）FB_L 组与 FP1M_L 组在门（C）和属（D）水平上的肠道微生物分类群相对丰度。（E）FB_L 组与 FP1M_L 组之间的物种差异比较分析。（F）FB_L 组与 FP1M_L 组中预测的微生物功能。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：FP1M_H、FP2M_H、FP3M_H、FP4M_H和FP5M_H组之间的微生物多样性、分类组成及预测功能差异。（A）基于Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数的α多样性分析。（B）基于加权和未加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）。（C,D）门（C）和属（D）水平上肠道微生物前10个分类群的相对丰度，以堆叠柱状图和箱形图表示。（E）LEfSe分析显示五个高严重程度FMT后亚组间差异富集的分类群。（F）预测KEGG功能通路的LEfSe分析。正的LDA得分表示在相应组中富集的通路。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：FP1M_L、FP2M_L、FP3M_L、FP4M_L 和 FP5M_L 组间微生物多样性、分类组成及预测功能差异。（A）基于 Chao1、ACE、Shannon 和 Simpson 指数的 Alpha 多样性分析。（B）基于加权和未加权 UniFrac 距离的主坐标分析（PCoA）。（C,D）门（C）和属（D）水平前 10 位肠道微生物类群的相对丰度，以堆叠柱状图和箱形图表示。（E）LEfSe 分析显示五种低严重程度 FMT 后亚组间差异富集的微生物类群。（F）预测的 KEGG 功能通路的 LEfSe 分析。正的 LDA 得分表示在相应组中富集的通路。请点击此处查看该图的高清版本。
图8：OTU与临床指标之间的Spearman相关性分析。 行代表OTU，列代表临床特征。每个单元格显示某一特定OTU与某一临床指标之间的Spearman相关系数。红色表示正相关，蓝色表示负相关，颜色强度反映关联程度。单元格中的数值表示相关系数。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，无显著性差异。 请点击此处查看该图的高清版本。
| 患者 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 性别（女/男） | M | F | M | F | M | F |
| 年龄（岁） | 65 | 72 | 68 | 75 | 61 | 70 |
| BMI | 23.5 | 21.8 | 24.2 | 20.5 | 22.1 | 23 |
| 帕金森病亚型 | 强直型 | 震颤型 | 混合型 | 强直型 | 震颤型 | 混合型 |
| 病程（年） | 5 | 8 | 6 | 10 | 3 | 7 |
| Wexner 评分 | 12 | 15 | 10 | 18 | 8 | 13 |
| UPDRS 总分 | 45 | 61 | 49 | 72 | 36 | 55 |
| NMSS 总分 | 45 | 62 | 50 | 70 | 38 | 55 |
| NMSQ | 10 | 14 | 11 | 16 | 8 | 12 |
| PSQI | 8 | 11 | 9 | 13 | 6 | 10 |
| 日常生活能力（ADL） | 90 | 75 | 85 | 70 | 95 | 65 |
| NPI | 5 | 9 | 6 | 12 | 3 | 7 |
| 便秘持续时间（年） | 4 | 7 | 5 | 9 | 2 | 6 |
| 左旋多巴等效日剂量（LEDD, mg/d） | 600 | 800 | 700 | 900 | 400 | 750 |
| 泻药使用情况 | 无 | 间歇使用 | 无 | 长期使用 | 无 | 间歇使用 |
| 益生菌使用情况 | 无 | 是 | 无 | 是 | 无 | 无 |
| 抗生素使用情况 | 无 | 无 | 是 | 无 | 无 | 无 |
| Hoehn–Yahr 分期 | 2 | 3 | 2.5 | 3.5 | 1.5 | 3 |
| 严重程度分组 | 低 | 高 | 低 | 高 | 低 | 高 |
表1：按病程分层的帕金森病患者基线人口统计学和临床特征。 患者被分为长病程组（>6年；FB_H）和短病程组（≤6年；FB_L）。连续变量数据以中位数（范围）表示，分类变量数据以数量（百分比）表示（如适用）。缩写： ADL，日常生活活动能力；BMI，体重指数；NMSS，非运动症状量表；NMSQ，非运动症状问卷；NPI，神经精神量表；PD，帕金森病；PSQI，匹兹堡睡眠质量指数；UPDRS，统一帕金森病评定量表。
| 不良事件 | 患者人数 (n, %) |
| 腹胀 | 2 (33.3%) |
| 腹痛 | 1 (16.7%) |
| 腹泻 | 2 (33.3%) |
| 便秘加重 | 2 (33.3%) |
| 发热 | 0 |
| 恶心/呕吐 | 2 (33.3%) |
| 因不良事件终止粪菌移植 | 0 |
表2：帕金森病患者粪便微生物移植后的不良事件。该表格列出了在粪便微生物移植后随访期间发生各项不良事件的患者人数及百分比。未报告发热或因不良事件导致治疗中断的情况。缩写：FMT，粪便微生物移植；PD，帕金森病。
补充图1： 参与者筛选与患者流程。 接受粪菌移植（FMT）并参与16S rRNA测序的帕金森病患者样本筛选流程图。n 表示参与者人数。请点击此处下载该文件。
讨论
粪菌移植（FMT）是一种基于微生物群的干预手段，通过将健康供体的粪便微生物群移植至受体肠道内，以恢复肠道微生物平衡14。越来越多的证据表明，肠道微生物群在维持神经系统稳态中发挥重要作用15。来自肠-脑轴双向通路的研究证据提示，肠道微生物群可能影响帕金森病（PD）中的中枢神经系统炎症、神经递质代谢及行为反应16,17。因此，微生物群移植作为一种潜在干预手段受到关注，尽管其在神经精神和神经退行性疾病中的临床应用仍处于探索阶段18。本项单中心回顾性观察性研究评估了在常规临床实践中接受粪菌移植（FMT）的帕金森病患者临床结局、安全性以及肠道微生物群的探索性特征。我们观察到，在不同帕金森病严重程度亚组及FMT后不同时间点，患者的肠道微生物丰富度、多样性、群落结构及预测功能谱存在差异。这些发现提示，肠道微生物谱可能随疾病严重程度而变化，并在FMT干预后发生动态改变。因此，这些结果应仅视为假设生成性发现，尚需在更大样本量、统计效能充足的前瞻性研究中加以验证。
便秘是帕金森病（PD）中最常见且最令人困扰的非运动症状之一19。便秘可能降低生活质量，增加对泻药的需求，并干扰多巴胺能药物的吸收。在本队列研究中，两个分析亚组在粪便微生物移植（FMT）后Wexner便秘评分均有所下降，尽管在不同随访时间点上改善的程度和持续性存在差异。该模式提示FMT与肠道症状改善之间存在时间上的关联。
我们还观察到多项运动和非运动临床指标的变化，包括NMSS、PSQI、UPDRS III以及总UPDRS评分。这些发现值得关注，因为帕金森病（PD）是一种多系统受累的疾病，常伴随胃肠道功能障碍、睡眠障碍、自主神经症状、神经精神症状以及运动功能障碍。一种可能的解释是，肠道微生物群的调节可能影响胃肠道蠕动、全身性炎症、肠道屏障完整性、微生物代谢产物以及微生物群-肠-脑轴之间的信号传导。然而，PD患者的运动和非运动评分受到多种因素的影响，包括疾病分期、多巴胺能治疗、睡眠质量、情绪状态、自主神经功能障碍、康复状况以及日常活动水平。因此，UPDRS、NMSS、PSQI和与日常生活活动（ADL）相关指标的变化应被视为探索性的临床观察结果。
我们的研究结果与既往将肠道微生物群与帕金森病（PD）相关的临床异质性相联系的研究广泛一致。最近一项研究报道，来自健康供体的粪便微生物群移植可改善帕金森病患者的运动及非运动症状，同时伴随肠道微生物群组成和功能通路的变化13,20。 尽管既往一项研究发现冲动控制障碍对帕金森病患者的α和β多样性无显著影响，但在患有冲动控制障碍的患者中富集了特定的微生物分类群，并在异生物质降解和烟酸代谢等通路中表现出潜在的功能差异21。另一项研究报道，伴有焦虑的帕金森病患者表现出肠道微生物群组成和β多样性的改变，进一步支持了肠道菌群与帕金森病相关非运动症状之间可能存在的关联22。在本研究中，高严重程度与低严重程度亚组之间的微生物多样性和组成存在差异，且多个粪便微生物群移植后亚组表现出不同的微生物模式。这些结果支持肠道微生物群可能参与帕金森病多维度临床表现的可能性，但其因果关系仍有待证实。
本研究鉴定出的若干分类群可能与帕金森病相关的肠道微生物组变化具有生物学相关性。某些细菌可能通过免疫和代谢通路影响帕金森病的病理生理过程23厚壁菌门是人类肠道中主要的革兰氏阳性菌门之一，包含参与短链脂肪酸生成和肠道屏障维持的菌种24在本研究中，OTU165在门水平上被注释为厚壁菌门（Firmicutes），是与临床变量关联最频繁的OTU之一。然而，厚壁菌门等广泛的分类群包含功能上具有多样性的成员，因此对其生物学意义的解释应谨慎对待。粪便宏基因组分析表明 乳酸杆菌 并且厚壁菌门相关的微生物表位在帕金森病患者中富集，且与炎症标志物及丙酸发酵等代谢通路相关25. 双歧杆菌 是一种具有抗炎潜力的细菌属，可能有助于肠道微生物的调节，而 拟杆菌属 是一种重要的共生菌属，其菌群失调与肠道屏障功能受损及炎症反应增强相关26,27在本研究中， 拟杆菌属 在 FP2M_L 中相对更为丰富，而 双歧杆菌 在FP1M_L中相对更为丰富。在帕金森病（PD）的大鼠模型中，补充 双歧杆菌 短小的 Bif11 改善了运动和认知功能障碍，降低了中脑的炎症因子和氧化应激水平，并恢复了短链脂肪酸含量及肠道屏障功能28既往研究也报道过改变的 拟杆菌属 帕金森病患者中丰度的变化，伴随短链脂肪酸前体代谢的改变，并与疾病严重程度相关29这些发现表明，本研究中观察到的分类单元可能具有潜在的生物学意义，但仍需更高分辨率的分类学分析和功能验证。
功能预测分析表明，不同帕金森病（PD）亚组显示出不同的预测KEGG通路富集模式。FB_H组在碳水化合物代谢、氧化磷酸化、多种环境中的微生物代谢以及脂多糖相关过程等通路中表现出预测富集，这可能反映了重度组中微生物代谢潜力的改变。氧化磷酸化是线粒体产生能量并维持正常神经元功能的主要过程30。氧化磷酸化的紊乱可能导致能量缺乏、氧化应激和神经炎症，这些因素已被认为与抑郁症和帕金森病相关31。研究表明，肠道微生物组可能通过调节神经递质合成、线粒体自噬以及氧化应激稳态来影响线粒体功能障碍32。与帕金森病相关的基因也可能损害线粒体复合物I的功能，减少ATP生成，并通过破坏Akt通路加剧疾病进展33。此外，脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌的重要组分，可能触发神经炎症反应，动物研究显示LPS暴露可激活小胶质细胞，促进炎症因子释放，损害神经结构，并诱导类似帕金森病的行为改变34。在本研究中，部分轻度组及粪菌移植后亚组也在氨基酸代谢、次级代谢物生物合成、膜转运、复制与修复以及短链脂肪酸相关代谢等通路中表现出预测富集。然而，由于这些通路结果是基于16S rRNA测序推断而来，而非通过宏基因组学或代谢组学方法直接测定，因此应视为探索性结果。
本研究还评估了肠道微生物特征与反映帕金森病（PD）患者运动症状和非运动症状的临床指标之间的关联。Wexner评分反映排便功能；Hoehn–Yahr分期和UPDRS评估运动障碍严重程度；PSQI和ADL分别测量睡眠质量和日常生活功能；NPI则评估焦虑、抑郁等神经精神症状35,36,37。多个OTU与便秘、睡眠障碍、运动障碍、功能状态及神经精神症状相关的临床量表存在关联。既往随机对照研究报道，粪便微生物移植（FMT）可能改善帕金森病患者的自主神经功能和胃肠道症状，并增加肠道微生物组的复杂性，提示FMT可能是一种可行的辅助干预手段38。另一项研究也发现，帕金森病患者的肠道微生物多样性发生改变，其中厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）与UPDRS III、NMSS、Wexner以及39项帕金森病问卷PDQ-39评分呈正相关，而拟杆菌门（Bacteroidetes）则与这些指标呈负相关39。然而，本研究中观察到的相关性并不能确立因果关系，对这些关联的方向性解释应持谨慎态度。
在评估粪菌移植（FMT）用于神经退行性疾病治疗时，安全性是必须重点考虑的因素。在本队列中，报告的不良事件主要为胃肠道相关，包括腹胀、腹泻、便秘加重、恶心/呕吐以及腹痛。未记录到发热情况，且无患者因不良事件而终止FMT治疗。这些结果提示，在该小规模队列中，FMT总体上是可耐受的。然而，安全性评估基于回顾性临床记录且患者数量有限，因此不能排除一些罕见但具有临床意义的并发症，包括感染、误吸、供体来源病原体传播、代谢异常以及迟发性不良事件。未来的研究应采用不良事件的标准化定义，实施主动的安全性监测，完善供体筛查记录，并进行长期随访。
应认识到本研究存在若干局限性，包括样本量较小（n = 6）、缺乏对照组、采用重复测量设计可能导致伪重复和均值回归，以及对饮食、便秘治疗、药物调整、抗生素或益生菌使用等潜在混杂因素的记录不完整。尽管已建议参与者避免使用后两者，但无法排除未记录的暴露可能对肠道微生物群产生影响。此外，帕金森病或其他神经系统疾病的家族史未被系统记录，因而无法评估遗传或家族因素的贡献。功能预测基于16S rRNA数据，而非直接的宏基因组或代谢组学测量，且部分OTU仅被注释至较宽泛的分类学层级，限制了生物学意义的解读。这些局限性提示应对本研究结果的解释保持谨慎。
尽管如此，这项探索性研究提示，粪便微生物移植（FMT）与帕金森病（PD）患者便秘相关症状、部分运动及非运动临床评分、胃肠道不良事件以及探索性肠道微生物组特征的变化相关。研究结果提供了初步的真实世界证据，支持进一步探索针对肠道微生物的干预措施在伴便秘的帕金森病患者中的应用。然而，由于样本量较小、采用回顾性设计、重复测量结构以及缺乏对照组，结果应谨慎解读。未来需要开展前瞻性对照研究，采用标准化的FMT方案、预设的临床终点、严格的安全性监测以及整合的多组学分析，以明确FMT在帕金森病中的临床价值、安全性及其生物学机制。
披露
利益冲突：作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢所有协助和支持本研究的同事们。他们的合作与鼓励对我们的工作具有不可估量的价值。
基金资助：本研究由江苏省老年健康重点计划（LKZ2022004）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MiSeq 系统 | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | 用于16S rRNA V3区测序的台式短读长测序平台–V4 可变区扩增子测序与 2 × 300 bp 双端测序化学技术。 |
| 宏基因组@KIN | World Fusion Co., Ltd. | v2.2.1；https://www.w-fusion.com/metagenome | 用于16S rRNA分类学指派和微生物群落分析的商业软件。 |
| 微生物鉴定数据库（细菌） | TechnoSuruga 实验室有限公司 | DB-BA，数据库版本10.0；https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/ | 用于微生物鉴定的细菌16S rDNA参考数据库 |
| 341F 引物 | BGI Genomics Co., Ltd. | 定制寡核苷酸；无目录号 | 正向引物序列：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′. |
| 805R 引物 | 华大基因有限公司 | 定制寡核苷酸；无目录号 | 反向引物序列：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. |
| 16S rRNA基因测序服务 | BGI Genomics Co., Ltd.（中国武汉） | https://www.bgi.com/us/sequencing-services/rna-sequencing-solutions/16s18s-its-sequencing/ | 商业测序服务提供商；负责文库构建、测序及初步质量控制。 |
| Eppendorf Safe-Lock 微量离心管，Biopur，1.5 mL | Eppendorf SE | '0030121589 | 用于分装粪便样本以在以下条件下储存的无菌聚丙烯管 −80 °C. |
| LEfSe | Segata 实验室/bioBakery | v1.1.2；https://github.com/SegataLab/lefse | 用于识别差异丰度分类群和预测通路的线性判别分析效应量软件。 |
| Tax4Fun2 | Tax4Fun2 开发团队 | v1.1.5；https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2 | 用于从16S rRNA数据推断京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能谱的R软件包。 |
| microeco R 包 | Chi Liu 及其贡献者 | v1.15.0；https://cran.r-project.org/package=microeco | 用于微生物丰度与多样性分析的群落生态学分析与可视化软件包。 |
| R 软件 | R 统计计算基金会 | 版本未报告；https://www.r-project.org/ | 用于临床和微生物组分析的统计计算环境；具体版本应由作者确认。 |
| GenFMTer 自动化粪便微生物群纯化系统 | 南京正序医疗科技有限公司 | 模型：GenFMTer；https://en.fmtmed.com/ | 用于标准化离心、洗涤及制备粪便微生物群悬液的自动化系统 |
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