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白纹伊蚊的解剖及解剖后组织总RNA提取

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DOI：

10.3791/72811

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2026年10月30日

 ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种从白纹伊蚊（Aedes albopictus）中分离中肠、卵巢和唾液腺的实验方案，随后进行总RNA提取，用于蚊媒病毒传播研究中媒介组织的分子表征。

摘要

2025年7月，在中国广东省佛山市，登革热和基孔肯雅热疫情暴发。Ae. albopictus 是这些病毒的主要传播媒介。本方案描述了一种简单、标准化的方法，用于解剖 Ae. albopictus 的中肠、唾液腺和卵巢，并从解剖所得组织中提取总RNA。将未吸血、3日龄的雌蚊置于−20 °C冷冻2分钟进行麻醉，随后解剖目标组织。使用组织RNA提取试剂盒提取总RNA，并通过微量分光光度计定量，用于定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析。结果表明，该解剖方法可快速、完整地分离各组织，且从分离组织中提取的RNA纯度相对较高。RT-qPCR检测了三个参考基因（GAPDH、β-actin 和 RPS6）的表达模式及其相对稳定性。该方法操作简便、经过验证，可为 Ae. albopictus 相关研究提供标准化的技术支持。

引言

Aedes albopictus（Ae. albopictus）是多种病原体的传播媒介，包括登革病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）1,2,3。该蚊种分布广泛，在多个地区引发了蚊媒疾病的暴发4,5。Ae. albopictus 传播病原体的能力，即媒介效能，在不同种群间存在差异，并与中肠、卵巢和唾液腺中的特定基因表达相关6。了解这些组织的结构并提取高质量的RNA，对于研究虫媒病毒的复制、扩散和传播机制至关重要7。

通过定量实时PCR（RT-qPCR）检测相对基因表达依赖于对Ae. albopictus组织的精确解剖以及高质量RNA的提取8,9。迄今为止，已发表的关于中肠、卵巢和唾液腺解剖的视频方案主要集中在Aedes aegypti10。因此，本方案展示了从Ae. albopictus中解剖中肠、卵巢和唾液腺的方法，其中解剖后的组织直接放入含有RNA保存液的研磨管中，避免了组织转移步骤，最大限度减少转移过程中的损失。采用基于柱法的方法从解剖组织中提取总RNA，相比传统的TRIzol方法，该方法所需操作步骤更少且耗时更短11。通常情况下，从五只Ae. albopictus的唾液腺中可提取出0.1–0.3 µg的总RNA，A260/A280比值为1.8–2.0，符合下游RT-qPCR对RNA纯度的要求。通过RT-qPCR检测三个参考基因在Ae. albopictus不同组织中的表达水平，以评估从各组织提取的RNA质量。

需要注意的是，本方案仅针对3日龄、未吸血雌性个体的中肠、卵巢和唾液腺进行了验证 白纹伊蚊，不适合用于脂肪体的RNA提取。获取完整且独立的组织是后续分析的基础。通过系统的解剖 Ae. albopictus 组织样本处理与高质量RNA提取，本方案为后续的基因表达检测、种群水平媒介能力评估以及虫媒病毒传播控制提供了技术支持。

方案

本研究仅使用实验室人工饲养的 Ae. albopictus 蚊子。因此，本研究无需机构伦理审批。实验所用的 Ae. albopictus 品系由国家卫生健康委员会中国寄生虫病防控重点实验室（江苏）提供。该种群最初于20世纪80年代采自无锡市，并在 江苏省血吸虫病防治研究所 的昆虫饲养室中按照标准条件长期维持。蚊种群饲养于人工气候箱中，温度为25 °C ± 1 °C，相对湿度为75% ± 5%，光照周期为10小时光照和14小时黑暗。幼虫在超纯水中饲养，并以猪肝粉与酵母提取物（上海啤酒厂）按2:1比例混合喂养。成蚊则维持在5%葡萄糖溶液上。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 材料准备

  1. 溶液的制备
    1. 1x PBS 缓冲液的制备：称取 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4，溶于 800 mL 超纯水中，搅拌溶解。调节 pH 至 7.4，定容至 1 L。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
    2. DEPC 溶液的制备：将 1 mL DEPC 原液加入 1 L 超纯水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌 12–16 小时。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
      警告： DEPC 具有高毒性且为致癌物。操作时须佩戴手套和护目镜，并在通风橱中进行。
      注意： 剧烈搅拌期间需用铝箔覆盖烧杯。将 DEPC 溶液分装后于 -20 °C 保存，可稳定保存长达 6 个月。
  2. 耗材的准备
    1. 灭菌解剖工具：将 1 mm 解剖针和尖头镊子放入铝制容器中，在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
    2. 准备含有 0.5–1.0 mm 二氧化硅珠的 2 mL 研磨管。将研磨管放入铝制容器中，在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
    3. 向每根研磨管中加入 200 µL 试剂盒提供的 RNA 保存液。
      注意： 组织离体后 1 分钟内，其内部 RNA 质量会显著下降。应提前准备好含保存液的研磨管。

2. 样品采集 白纹伊蚊

注意： 请穿白色实验服并佩戴手套。不要穿深色衣物，因为深色会吸引蚊子。

  1. 关闭饲养蚊笼房间内的所有门窗及通风系统，防止白纹伊蚊（Ae. albopictus）逃逸。
  2. 打开电动吸蚊器，将其插入蚊笼内。将吸蚊器对准停留在笼内壁上的白纹伊蚊（Ae. albopictus），收集蚊虫。
  3. 在缓慢抽出吸蚊器的同时保持其持续运行。立即密封蚊笼，并关闭吸蚊器的盖子。
  4. 取下收集室，置于 -20 °C 环境中 2 分钟，对白纹伊蚊（Ae. albopictus）进行低温麻痹。
  5. 将直径 10 cm 的玻璃培养皿置于冰上预冷。将麻痹后的白纹伊蚊（Ae. albopictus）从收集室转移至玻璃培养皿中。
    注意： 严格控制低温麻痹时间，以防止组织损伤。

3. 雌性个体的鉴定 白纹伊蚊 解剖前

  1. 从玻璃培养皿中选取形态完整且经低温麻醉的 Ae. albopictus，转移至载玻片上，在体视显微镜下以 80 倍放大倍数进行观察。
  2. 辨识中胸背板上的白色纵条。
  3. 确认跗节各节基部以及腹部第 II 至 VI 背板基部具有白色环带12。
  4. 在 80 倍放大倍数下检查触角，通过区分丝状触角（雌性）与羽状触角（雄性）来鉴定雌蚊。

4. 腹部解剖 Ae. albopictus

  1. 在已灭菌的载玻片上从左至右放置三滴无菌 1× PBS，每滴体积约为 20 µL，滴与滴之间相距约 5 mm。
    注意： PBS 滴应足够大，以完全浸没整只 Ae. albopictus。
  2. 使用精细镊子夹住 Ae. albopictus 的翅膀，将蚊子放入最左侧的 PBS 滴中。
  3. 调整 Ae. albopictus 的位置，使其腹面朝上。用左手持解剖针，按压第二腹节以固定 Ae. albopictus。
  4. 用右手将 1 mm 解剖针插入第六腹节的中点位置，做一横向的半圆形切口，以打开腹腔。
  5. 将右手所持的解剖针向后移动约 2 mm，并按压腹节 VI–VIII 的中段区域以固定腹部。
    注意： 卵巢位于腹节 II–VI 的背侧。按压腹节 VI–VIII 时切勿随意移动解剖针，以免破坏卵巢的完整形态。
  6. 用左手以解剖针夹住第二腹节，轻轻向外牵拉，使腹部在第六腹节处分离。分离过程中，前肠、中肠和马氏管将完全暴露。
    注意：马氏管呈白色、细长状；中肠半透明，呈纺锤形。
  7. 将中肠与前肠和后肠分离。在中间的 PBS 滴中清洗中肠两次。
  8. 将其转移至含有 200 µL 商业 RNA 提取试剂盒所提供的 RNA 保存液的研磨管中。
  9. 用解剖针按压第八腹节中部，使两侧成对的卵巢暴露。取出卵巢，在中间的 PBS 滴中清洗两次，然后转移至含有 200 µL RNA 保存液的研磨管中。
    注意： 成对的卵巢对称，呈米粒状，乳白色。操作时需小心，确保获取过程中卵巢结构的完整性。

5. 唾液腺解剖 白纹伊蚊

  1. 将显微镜放大倍数调至400倍。转移已解剖腹部的 白纹伊蚊 至最右侧的 PBS 液滴。
  2. 用左手解剖针轻轻按压中胸，直至头部略微抬起。
  3. 用右手持解剖针在颈部位置抬起头部，并缓慢向外牵拉。观察唾液腺（三叶状结构）随头部一起从胸部脱离的过程。
    注意： 唾液腺位于胸部前部，并与头部相连 通过 唾液腺导管。对胸部施加均匀的压力可防止唾液腺导管破裂，并使唾液腺随头部完整地从胸部脱离。此步骤中对力度的控制需要反复练习。
  4. 将唾液腺从头部分离，在中央的PBS液滴中清洗两次，然后转移至预先准备好的研磨管中。
    注意： 唾液腺大小约为1 mm。将其转移至含有研磨珠的研磨管中 200 µL RNA保存液中，置于白光光源下观察，以确认溶液中是否存在悬浮的小白色颗粒。

6. 从样本中提取 RNA 白纹伊蚊 及其唾液腺、卵巢和中肠

注意：所有RNA提取步骤均严格按照商业组织RNA提取试剂盒的制造商说明书进行，未作任何修改。

  1. 将组织研磨器预冷至 4 °C。设置参数为 30 Hz，研磨时间 30 s，循环次数 10 次，暂停时间 8 s。
  2. 将含有组织样本的研磨管放入研磨器中并运行程序。
    注意： 研磨完成后，检查组织是否已在 RNA 保存液中充分分散。若研磨不完全，额外运行 5 个循环。
  3. 将匀浆液转移至无菌 1.5 mL 离心管中。在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 5 分钟。
  4. 将上清液转移至新的无菌 1.5 mL 离心管中。加入 30 µL 氯仿。
    警告： 氯仿具有毒性和致癌性。操作时需佩戴手套和护目镜，并在通风橱中进行。
  5. 剧烈涡旋振荡 20 秒。室温孵育 15 分钟后，在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
    注意： 小心吸取上层水相，避免接触中间白色层，以防蛋白质污染。
  6. 将上层水相转移至新的无菌 1.5 mL 离心管中。加入 75 µL 异丙醇。
  7. 通过倒置混匀，并将全部混合物转移至硅胶离心柱中。以 12,000 x g 离心 1 分钟。
  8. 向离心柱中加入 600 µL 洗涤缓冲液。以 12,000 x g 离心 30 秒。弃去穿流液。
  9. 向离心柱中加入 600 µL 80% 乙醇。以 12,000 x g 离心 30 秒。弃去穿流液。重复此洗涤步骤一次，共洗涤两次。
  10. 向离心柱膜中心加入 30 µL DEPC 水。室温孵育 1 分钟。
  11. 将离心柱放入一个无菌 1.5 mL 离心管中。以 12,000 x g 离心 1 分钟以洗脱 RNA。
  12. 取 1 µL 洗脱的 RNA，使用微量分光光度计测定其浓度和纯度。

7. RNA 逆转录

  1. 反应体系准备
    1. 将4倍逆转录预混液、无核酸酶水和RNA模板置于冰上解冻。
    2. 在200 µL PCR管中，加入5 µL 4倍逆转录预混液、10 µL总RNA模板和5 µL无核酸酶水，配制20 µL反应体系。
    3. 短暂离心（1,000 × g，1分钟），使反应液全部沉降至管底。
    4. 将PCR管放入热循环仪中，运行逆转录程序：50 °C孵育5分钟；85 °C孵育5秒。
      注意： 使用前将逆转录产物稀释20倍，以降低潜在抑制物对RT-qPCR的影响。

8. 实时定量 PCR（RT-qPCR）

  1. RT-qPCR 反应体系的制备
    1. 将 2× SYBR Green qPCR 预混液、cDNA 模板以及 10 µM 的正向和反向引物置于冰上解冻，并全程避光。
    2. 在 96 孔 PCR 板中，每孔配制 20 µL 反应体系：加入 10 µL 2× SYBR Green qPCR 预混液、各 0.8 µL 的 10 µM 正向和反向引物（终浓度为 400 nM）、2 µL 20 倍稀释的 cDNA 模板以及 6.4 µL 无核酸酶水。
    3. 使用光学粘性密封膜密封 96 孔板，确保所有孔均完全密封。
    4. 以 1,000 × g 离心 1 分钟，使反应液沉至孔底。
    5. 将 PCR 板放入实时荧光定量 PCR 检测系统中，并运行热循环程序。
      注意：热循环程序为：95 °C 预变性 30 秒（1 个循环）；扩增阶段：95 °C 变性 30 秒，60 °C 退火 30 秒（共 40 个循环）；熔解曲线分析：95 °C 15 秒，60 °C 1 分钟，以 0.15 °C/s 的升温速率升至 95 °C。每个组织 RNA 样本进行四次技术重复的 qPCR 检测。每个组织样本由 5 只白纹伊蚊（Ae. albopictus）的混合组织构成。RT-qPCR 所用引物序列见表 1。
  2. 数据分析
    1. 检查每对引物的熔解曲线，确认是否存在单一且清晰的解离峰。
    2. 从仪器软件导出 Ct 值。作图与数据分析使用统计与绘图软件完成。
引物名称引物序列（5′'-3')
白纹伊蚊 β-肌动蛋白 正向引物 GGAGAAGATCTGGCATCACA
白纹伊蚊 β-肌动蛋白 反向引物TGTCATCTTCTCGCGGTTAG
白纹伊蚊 GAPDH 正向引物CTGCCAAGGCTGTCGGTAA
白纹伊蚊 GAPDH 反向引物TCATAGGAGGCAGGCTTGGA
白纹伊蚊 RPS6 正向引物ACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
白纹伊蚊 RPS6 反向引物CTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

表1：用于RT-qPCR的白纹伊蚊（Ae. albopictus）引物序列。

结果

本研究包括两个部分：解剖 白纹伊蚊 以及解剖后组织的RNA提取。整体工作流程如图所示 图1，其中 图1A 展示了分离过程 白纹伊蚊 和 图1B 展示RNA提取及随后的参考基因表达水平检测。

figure-results-1
图1：Ae. albopictus 的解剖示意图及解剖后组织的总RNA提取。（A）Ae. albopictus 的采集、麻醉与解剖。（B）解剖后组织的RNA提取、纯度鉴定及参考基因表达水平检测。请点击此处查看该图的放大版本。

五只实验室培育的 白纹伊蚊 解剖以分离中肠、唾液腺和卵巢。在80倍放大倍数下×透明的前肠、中肠和后肠 白纹伊蚊 清晰可见，颗粒状的卵巢位于两侧，表面覆盖着白色的马氏管（图2A）。当磁场调节至400×，半透明的唾液腺 白纹伊蚊 变得清晰可见（图2B). 图 2C，D 说明 分离的中肠和卵巢组织。结果表明，通过该解剖方法分离的组织保持了其结构完整性，这对于解剖后样本的总RNA提取至关重要。

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图2：Ae. albopictus 组织解剖后分析。（A）从 Ae. albopictus 腹部分离的组织。（B）半透明的三叶状 Ae. albopictus 唾液腺。（C）Ae. albopictus 的前肠和中肠。（D）呈米粒状成对的 Ae. albopictus 卵巢。I：前肠；II：中肠；III：后肠；IV：马尔皮基氏管；V：卵巢。请点击此处查看此图的放大版本。

从解剖组织中提取总RNA 白纹伊蚊组织样本（唾液腺、中肠和卵巢）在提取前被完全研磨。RNA浓度因组织类型而异：唾液腺为7.8 ng/µL，而雌性蚊虫的中肠、卵巢及全虫匀浆 白纹伊蚊 分别为 55.3、45.7 和 42.7 ng/µL，分别。所有样品均表现出高纯度，A260/A280比值为1.87–2.10，A260/A230比值为1.73–2.13（表2）。三个候选内参基因的表达水平（GAPDH, β-肌动蛋白，以及 RPS6通过RT-qPCR在所有组织中对这三个基因进行了检测。尽管其表达水平随RNA浓度略有变化，但在不同组织类型中，这三个基因的表达均相对稳定。图3). GAPDH, β-肌动蛋白，以及 RPS6 适用于不同组织中基因表达标准化的稳定参考基因 白纹伊蚊.

组织样本数量RNA 浓度 (ng/μL)A260/A280A260/A230
唾液腺57.81.871.73
中肠555.31.941.98
卵巢545.72.102.13
雌性个体142.72.041.92

表2：从样本中提取的RNA的浓度和纯度 Ae. albopictus 组织.

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图3：通过RT-qPCR检测的参考基因（GAPDH、β-actin 和 RPS6）的Ct值。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

Ae. albopictus 广泛分布于除南极洲以外的所有大陆的温带、亚热带和热带地区13,14。作为一种重要的节肢动物传播病毒（如登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）和基孔肯雅病毒（CHIKV））的媒介，该蚊种已多次引发中国广东省蚊媒疾病的暴发15。

协助相关研究 白纹伊蚊-相关病毒及其传播机制，我们开发了一种简便的解剖方法 白纹伊蚊 组织。在传统的解剖方案中，进行唾液腺解剖时，当头部与胸部分离时，唾液腺可能因施力不同而残留在胸部或附着于头部；由于唾液腺大小仅约1 mm，若其保留在胸部内，则难以定位16该方法基于标准的蚊虫器官分离方案，优化了位于前胸骨和中胸骨胸板下方的唾液腺的分离步骤，该部位应在400倍显微镜下观察。× 放大倍数17用一根针轻轻按压中胸，同时用另一根针施加压力以分离头部，使唾液腺完整脱落。该方法可避免在胸腔内寻找唾液腺，防止腺体污染和损伤，并缩短整体解剖时间。卵巢位于第六至第八腹节附近，从第六腹节开始解剖，小心取出中肠、马氏管和卵巢，即可完整保留卵巢。18该方法可获得完整的唾液腺、无粘连且形态正常的卵巢，以及未受损的中肠。图2）。该解剖技术为相关研究提供了重要的指导 白纹伊蚊 以及虫媒病毒的复制、传播和传播机制。

Ae. albopictus 组织的 RNA 提取对于检测蚊媒病毒至关重要。传统的 TRIzol 方法耗时较长且技术要求较高，但如果操作得当，通常可获得较高的 RNA 产量并生成高质量的 RNA。相比之下，基于柱的方法具有更好的可重复性且操作更简便，但可能导致 RNA 回收率较低，且在应用于脂肪体时效率不佳19,20。在本研究中，解剖所得组织被立即保存于核酸稳定剂中，充分研磨后采用离心柱法提取 RNA 用于 cDNA 合成21。为了在 cDNA 质量存在差异的情况下确保 RT-qPCR 数据的准确归一化，必须使用稳定的参考基因22。尽管已针对 Ae. albopictus 的不同发育阶段建立了参考基因，但组织特异性参考基因仍需进一步验证23,24。对所有解剖组织逆转录所得 RNA 进行 RT-qPCR 分析，均一致扩增出 GAPDH、β-actin 和 RPS6，证实本解剖方案所获得的 RNA 质量足以支持后续在 Ae. albopictus 中开展组织特异性基因表达研究。

采用本方案解剖白纹伊蚊（Ae. albopictus）组织时，唾液腺可能偶尔未能随头部一同分离。这通常是由于对胸部施加的压力不足，同时头部分离速度过快所致。为解决此问题，应持续对中胸施加压力，并缓慢向外牵拉头部，使唾液腺完整地随头部脱离。将唾液腺转移至含有RNA保存液的研磨管时，需在光源下仔细检查溶液中是否存在微小的白色漂浮颗粒。若在管中无法找到唾液腺，应立即检查其是否仍附着在解剖针上。进行RNA提取时，必须严格遵循试剂盒制造商提供的操作说明。若获得的RNA浓度较低，可使用洗脱缓冲液进行第二次洗脱。在RT-qPCR过程中，熔解曲线可能出现多个峰；此时应首先验证引物的特异性。若Ct值较高，应根据引物的熔解温度调整程序中的退火温度。通常情况下，程序中的退火温度应设定为比引物熔解温度低1–2 °C25。

本研究存在一些局限性。样本范围相对较窄，仅关注了中肠、唾液腺和卵巢组织，未对马氏管和脂肪体等其他组织进行研究26。此外，分析仅限于实验室饲养的3日龄雌蚊，排除了吸血后及病毒感染个体27。未来改进方向应包括扩大样本范围，纳入马氏管等组织，并考虑不同生理状态下的白纹伊蚊（Ae. albopictus）个体。

综上所述，从白纹伊蚊（Ae. albopictus）中分离中肠、卵巢和唾液腺，随后进行总RNA提取，为后续的媒介能力评估和虫媒病毒传播研究提供了技术基础。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3 mL 超长巴斯德吸管WHBWHB-S43 mL
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500 rxns
HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR kitVazymeR433-01100 rxns
微量总 RNA 提取试剂盒MedTechMDT-CFR07100T/盒
微量移液器 0.5-10μLEppendorf4043444
显微镜载玻片CITOTEST80302-210475 mm×25 mm
微量分光光度计KAIAOK5600C
核酸提取缓冲液MedTechMDT-TP01100 mL
PBS 磷酸盐缓冲液（无菌）ServicebioG4202500 mL
PCR 扩增仪EppendorfMastercycler X50s
QuantStudioTM 7 Pro 实时荧光定量 PCR 系统Applied biosystemsEN61326-1
Stemi 305 LAB 显微镜套装ZEISS435063-9010-000

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