本研究利用活性炭和膨润土优化环介导等温扩增（LAMP）检测方法，用于检测海产品中致病性Vibrio菌种。该前处理方法可有效去除反应抑制物，与传统方法相比，显著提高了检测速度和灵敏度，且更具成本效益。
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摘要
摘要
的 弧菌属 属内包含100多个物种，其中12种被认为对人类具有致病性；在食品中最常分离到的物种是 V. cholerae, 副溶血性弧菌, 创伤弧菌， 和 V. alginolyticus主要问题在于通过传统微生物学方法进行鉴定时成本较高且诊断周期较长。采用环介导等温扩增（LAMP）技术对以下目标进行鉴定 霍乱弧菌，副溶血性弧菌，创伤弧菌 和 V. alginolyticus活性炭与膨润土（ACB）用于去除抑制物，从而提高检测的灵敏度；测试了pH 6、7和9，以及样品与ACB之间的不同接触时间。在虾、鱼和牡蛎样品中，使用活性炭和膨润土去除反应抑制物后，LAMP检测的灵敏度得到提升。所有测试样品的LAMP灵敏度、阴性预测值、阳性预测值和LAMP特异性均等于或高于90%。LAMP方法可作为鉴定的替代方案 霍乱弧菌，副溶血性弧菌, 创伤弧菌， 和 V. alginolyticus 由于比标准方法应用更快、灵敏度更高且成本更低，因此在水产品中广泛应用。
引言
物种的 弧菌属 属在海洋环境中广泛分布，可能与鱼类、软体动物或甲壳类动物相关，其关系可为致病性或共栖性。已有报道指出，其中12个种可对人类具有致病性，可引起 霍乱弧菌, 副溶血性弧菌, V. vulnificus，以及 V. alginolyticus 揭示出在渔业产品中分离到该病原体的频率更高。在美国，卫生当局估计 弧菌 spp. 每年导致超过 80,000 例感染1,2,3,4,5通过常规方法分离弧菌属细菌，包括预增菌、选择性培养基培养，以及生化和血清学试验确认6,7。这些传统方法受限于分离病原体所需时间较长（长达5天）以及分辨率不足，往往无法准确区分同一属内亲缘关系密切的物种 弧菌属 由于表型和生化特征相似而归入同一属6,7,8.
此外，环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）已被报道为一种快速、准确且经济的分子检测技术，可用于病原体的鉴定9,10。该方法比传统PCR更具成本效益且速度更快，因其无需使用如热循环仪等复杂设备9。LAMP技术可在单一反应步骤中通过观察反应管中浊度的变化来检测目标基因，该浊度源于焦磷酸镁沉淀；由于焦磷酸镁在LAMP技术所采用的65 °C条件下是稳定的反应产物，浊度的增加与合成的DNA量成正比，从而避免了琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统的使用11,12,13,14,15。
通过去除可能抑制Bst聚合酶或与DNA靶标结合从而阻碍扩增的反应抑制剂（如蛋白酶、钙离子、糖原和脂质），可提高对这些病原体的检测灵敏度13,16,17,18,19,20。已有报道表明，活性炭与膨润土的复合物（ACB）在消除扩增抑制剂方面具有高效性，因此可提高牡蛎样品中大肠杆菌（Escherichia coli）检测的灵敏度，同时由于ACB的成本低于商用试剂盒，有助于降低检测成本21。
本研究拟通过使用活性炭和膨润土优化LAMP方法，以提高直接从水产品中检测V. cholerae、V. parahaemolyticus、V. vulnificus和V. alginolyticus的灵敏度。该优化方法为食品行业中的常规监测与质量控制提供了实用指导，适用于病原体的快速诊断，避免了耗时的前增菌步骤。在预期性能方面，该方法在鱼类和虾类等基质中表现出优异的灵敏度（高于98%）和特异性（100%）。然而，需注意的一个关键局限性是，在来自源头的高污染样本（如牡蛎）中，ACB系统无法完全去除所有干扰性有机物质，可能导致检测灵敏度略有下降（94%–98%）。
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方案
本研究未涉及人类或脊椎动物实验对象，因此无需机构伦理审批。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 使用的细菌菌株及DNA提取
Vibrio cholerae no O1 CECT 55、V. parahaemolyticus ATCC 17802、V. vulnificus ATCC 29037 和 V. alginolyticus ATCC 17749 菌株在含有 2% NaCl 的脑心浸出液（BHI）肉汤中，于 37 °C 培养 24 小时。大肠杆菌 Escherichia coli ATCC 25922、阪崎肠杆菌 Cronobacter sakazakii ATCC 12868、单核细胞增生李斯特菌 Listeria monocytogenes ATCC 49594 和鼠伤寒沙门菌 Salmonella Typhimurium ATCC 14028 菌株则在不含氯化钠的 BHI 肉汤中，于 37 °C 培养 24 小时，作为检测中的阴性对照。用于 DNA 提取时，将过夜培养物在 25 °C 条件下以 16,000 × g 离心 6 分钟。小心倾去上清液，避免扰动菌体沉淀，然后用移液器将沉淀充分重悬于 500 μL TAE 缓冲液（Tris-乙酸-EDTA，pH 8）中。将悬液煮沸 6 分钟以裂解细胞，随后立即置于冰上冷却 5 分钟。再进行一次最终离心，以沉淀细胞碎片，获得含有提取 DNA 的澄清上清液，该上清液随后用作 LAMP 扩增的模板22,23。
2. LAMP 程序
LAMP 中使用的引物（表1）被用于验证鉴定特异性 V. cholerae, 副溶血性弧菌, V. vulnificus，以及 V. alginolyticus. 每个的鉴定 弧菌属 使用LAMP对物种进行检测在反应管中进行，制备的终体积为 25 μL 混合物的组成包括： 1.6 μM 每种引物、1.4 mM dNTP混合物、6 mM MgSO₄、800 mM甜菜碱、8 U的 Bst DNA聚合酶，以及 5 μL 模板DNA。将反应混合物轻轻混匀后，置于水浴中孵育 65 °C 60 分钟。孵育结束后，将扩增产物在 1.5% 琼脂糖凝胶上进行分离。随后使用染色剂对扩增产物进行染色。 1 μL 1:100 稀释的荧光 DNA 染料，使用蓝光透射仪观察结果。另一种用于判断病原体检测是否为阳性的技术涉及添加 4 μL 羟基萘酚蓝（HNB， 125 μM将反应管中的溶液用肉眼观察颜色变化。阳性结果表现为蓝色的形成，阴性结果表现为紫色。24. 大肠杆菌 ATCC 25922 阪崎肠杆菌 ATCC 12868 单核细胞增生李斯特菌 ATCC 49594，以及 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 被用作 LAMP 方法的阴性对照。LAMP 扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并使用凝胶成像系统观察。所得图像采用 MS 1D Analysis Software 进行采集和数字化处理。
3. 蚝、虾和鱼类样品的处理以去除 弧菌 样本中自然存在的种
采集了10个牡蛎样品、10个虾样品和10个鱼样品，每个样品的重量约为200 g。为去除样品中天然存在的Vibrio细胞，采用先前已发表的方法21。称取每种样品各50 g，在桨叶式搅拌器中以260 rpm机械均质1分钟，制成均匀的组织悬液，随后于-70 °C保存72小时。之后，将样品置于40 °C水浴中完全解冻，并用300 mL磷酸盐盐水缓冲液（0.85% NaCl，pH 9）洗涤。为确保前述步骤已成功清除样品中的Vibrio，按照美国食品药品监督管理局《细菌学分析手册》第9章所述的预增菌方法进行验证7。将含有样品的盐水溶液替换为450 mL碱性蛋白胨水（APW，pH 9）。随后在APW中精确进行系列稀释，直至10⁻3稀释度，并于37 °C培养24小时。最后，取每支试管中的等分试样划线接种于硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）选择性琼脂培养基，于37 °C培养24小时，以肉眼确认无典型Vibrio菌落生长。所有实验均设三个重复。
4. 膨润土活性炭（ACB）的制备及细胞回收率的评价
为了确定活性炭-膨润土（ACB）在吸收水产品样品中抑制物时效率最高，同时对目标细胞的吸附最小化的条件，参照已发表的方法21，建立了ACB与食品样品之间作用的最佳pH值和接触时间。将活性炭用蒸馏水充分洗涤后，在55 °C下干燥。随后，将32.6 g活性炭与3.04 g膨润土混合，在150 rpm条件下持续搅拌24小时以确保均匀分布，再于55 °C下干燥并灭菌，最终得到细密均一的干燥ACB粉末。为评估Vibrio细胞与活性炭-膨润土（ACB）混合物混合后的细胞回收率，将各菌株分别在含2% NaCl的BHI肉汤中培养至细胞密度达到1.5 × 104 CFU/mL。然后，分别取1 mL各Vibrio菌株接种于100 mL磷酸盐缓冲液（PBS，0.85% NaCl，pH分别调节至4、6和9）中。将细菌悬液与4.6 g预先制备好的ACB混合，在150 rpm条件下分别搅拌15、30和60分钟，以促进充分接触。在每个指定的接触时间结束后，小心取出0.1 mL等分试样，涂布于TCBS琼脂平板上，于37 °C培养24小时后进行菌落计数。
5. 检测限的评估 V. cholerae, 副溶血性弧菌, V. vulnificus，以及 V. alginolyticus 在经活性炭和膨润土处理的牡蛎、虾和鱼样品中
每一个 弧菌 本研究中使用的菌种在BHI肉汤中培养，其细胞密度被精确调整为1.5 x 104，7.5 × 103，3.8 × 103，1.5 × 103，7.5 × 102，3 × 102，1.5 × 102，以及使用分光光度计测得的76 CFU/mL（A600 nm ~0.25）。随后，取每种1 mL 弧菌 培养物用于接种已进行预处理以消除任何可能存在的50克各样本（牡蛎、鱼类、虾类） 弧菌 存在。接种后的样品在桨叶式均质器中以360 rpm均质30秒，并加入450 mL APW（pH 6）稀释。随后将混合液在260 × g 5 分钟 4 °C 以分离大块杂质。将所得上清液倾入含有23 g ACB的烧瓶中，在150 rpm条件下搅拌15分钟以吸附抑制物，随后使用滤纸过滤，得到不含大颗粒的澄清洗脱液。该洗脱液随后在16,000 x g 10 分钟 4 °C，导致试管底部出现可见的细胞沉淀，随后用于提取DNA。每个 弧菌 通过LAMP方法鉴定物种。阴性对照包括接种了菌株的样本 大肠杆菌 coli ATCC 25922 阪崎肠杆菌 ATCC 12868，单核细胞增生李斯特菌 ATCC 49594，以及 沙门氏菌鼠伤寒血清型 ATCC 14028。将反应混合物置于水浴中孵育 65 °C 孵育60分钟。孵育结束后，将扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离，并用荧光DNA染料染色。凝胶在蓝光透射仪中观察成像。最后， 4 μL 羟基萘酚蓝（125 μM向每支试管中加入）以进行肉眼检测24.
6. LAMP 方法阳性预测值、阴性预测值、特异性和灵敏度的确定
采用30个样本（虾样本10个、牡蛎样本10个、鱼样本10个）测定LAMP方法的灵敏度、特异性和预测值。每个样本均接种各Vibrio物种的最低可检出浓度。为确定灵敏度和特异性的百分比以及阴性预测值（NPV）和阳性预测值25，使用列联表汇总实验过程中获得的真阳性（TP）、真阴性（TN）、假阳性（FP）和假阴性（FN）结果（表2）。根据这些数据，应用以下公式：
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结果
所用细菌菌株及DNA提取
已成功从所有致病菌株和阴性对照菌株中提取DNA，用于后续LAMP检测的模板。
LAMP 程序
本研究中使用的引物针对各分子靶标的扩增特异性设计 弧菌 物种。LAMP 扩增获得的产物 弧菌 菌株的使用表明，每对引物在各自目标基因的扩增中均具有特异性 弧菌属 物种图1).
对牡蛎、虾和鱼样品进行处理以消除样品中天然存在的Vibrio spp.
针对样品中天然存在的Vibrio spp. 的消除处理是有效的，可实现100%减少Vibrio spp.。按照BAM方法操作时，未观察到Vibrio spp. 的生长7。
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讨论
本研究建立了优化条件，以提高环介导等温扩增（LAMP）检测受污染海产品中霍乱弧菌（V. cholerae）、副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）和创伤弧菌（V. vulnificus）的灵敏度。通过省去传统的预增菌步骤，显著缩短了诊断时间，为直接从水产品中快速高效地鉴定病原体提供了有效方法。
本研究中一项关键的方法学改进是优化了抑制剂去除步骤。以往的方法在扩增前使用 pH 为 4 的条件21，但这导致弧菌菌株的回收率为零，主要原因是Vibrio（弧菌）物种对酸性环境高度敏感26。为解决这一问题，系统性地调整了实验条件，以同时提高细胞回收率并消除样品中天然存在的反应抑制物。结果表明，将活性炭与膨润土（ACB）在 pH 6 的缓冲液中悬浮，并与样品振荡混合 15 分钟，是最佳条件。该改进通过使环境接近细菌膜的等电点
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披露
作者声明无竞争利益。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活性炭 | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| 膨润土 | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| 甜菜碱 | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Bio-Image systems 转基因成像仪 | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Bst DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0374 | |
| 离心机（型号 J2-HS） | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| 阪崎克罗诺杆菌 | ATCC | 12868 | |
| dNTP 混合物 | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| 大肠杆菌 | ATCC | 25922 | |
| 羟基萘酚蓝 | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| 单核细胞增生李斯特菌 | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| MS 1D 分析软件 | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| 鼠伤寒沙门氏菌 | ATCC | 14028 | |
| 分光光度计（型号 6300） | Jenway | 630531 | |
| 均质器循环仪（型号 400） | Seward | 0400/000/AJ | |
| 溶藻弧菌 | ATCC | 17749 | |
| 非 O1 群霍乱弧菌 | CECT | 55 | |
| 副溶血性弧菌 | ATCC | 17802 | |
| 创伤弧菌 | ATCC | 29037 | |
| Whatman 滤纸 | Whatman | 1001-055 |
参考文献
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