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方法文章

用于在三维细胞外基质中研究机械压缩在肿瘤-免疫细胞相互作用中作用的微流控平台

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DOI：

10.3791/72929

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2026年8月28日

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1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

本文内容

摘要

我们提出了一种利用微流控平台在三维（3D）环境中模拟肿瘤-免疫相互作用的实验方案。实验结果表明，自然杀伤（NK）细胞在机械压缩条件下仍能保持其抗肿瘤活性。

摘要

在基于细胞的免疫治疗中，机械力显著影响免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力。为了杀伤肿瘤细胞，免疫细胞必须对靶细胞施加作用力，并形成免疫突触，从而递送包括颗粒酶B在内的细胞毒性分子。尽管机械信号的重要性已广为人知，但如何利用这些机械信号来增强免疫介导的杀伤作用仍不清楚。这一知识空白在一定程度上源于缺乏能够在生理上接近真实的环境中，为细胞培养提供精确控制的机械应力的工具。本文中，我们描述了一种微流控压缩装置，该装置可在细胞外基质（ECM）中对肿瘤类球体施加静态或动态压缩，同时通过光学显微镜实现对肿瘤-免疫相互作用的实时成像。

该微流控平台包含12个腔室（6个对照腔室和6个功能腔室）。每个腔室均设有位于压力控制单元正下方的细胞培养室。嵌入细胞外基质（ECM）中的类球体被放置在细胞培养室内。利用该平台，我们在定义的机械压缩条件下研究了自然杀伤（NK）细胞对乳腺肿瘤类球体（MCF-7）的杀伤效率。结果显示，在1.5 mg/mL胶原蛋白环境中，无论是否存在机械压缩，NK细胞仍然是诱导肿瘤类球体死亡的主要驱动因素。 因此表明，NK细胞能够在压缩应力下维持其抗肿瘤活性。这些发现证明了该平台在研究机械力在肿瘤-免疫相互作用中作用的实用性。目前正在进行的研究旨在鉴定使免疫细胞适应压缩应力的分子机制。这些研究获得的见解可能揭示一种有前景的治疗途径。

引言

基于细胞的癌症免疫疗法是一种利用免疫细胞靶向癌细胞的治疗策略1。该策略在血液系统肿瘤的治疗中已显示出显著成效2,3,4。然而，这种在血液系统肿瘤中取得的成功尚未完全转化为实体瘤治疗的成果5,6,7。造成这一局限性的主要原因之一是实体瘤所特有的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。

肿瘤微环境（TME）具有独特的力学信号，可调控细胞行为。免疫细胞有效杀伤肿瘤细胞需要其对靶细胞施加力学力，并形成免疫突触，通过该突触递送细胞毒性分子8。因此，理解力学力如何影响免疫细胞功能，可能揭示新的治疗策略，以提高基于细胞的免疫疗法对实体瘤的疗效。

实体肿瘤微环境（TME）的一个关键力学特征是其对生长中肿瘤施加的压缩应力9,10。迄今为止，大多数关于压缩的研究主要集中在压缩对肿瘤细胞行为的影响10,11。直到最近，研究关注才开始转向理解压缩如何影响TME中的免疫细胞12。因此，压缩应力影响自然杀伤（NK）细胞迁移、免疫突触形成及细胞毒活性的机制仍远未被充分阐明，也缺乏足够的量化研究。这一空白严重限制了我们对如何利用TME内的力学信号来增强对实体瘤的免疫靶向治疗的理解。

解决这一问题的主要障碍在于缺乏能够在生理相关的三维微环境中施加可控且可量化的压缩力，同时实现对肿瘤-免疫相互作用进行实时成像的实验平台。早期研究压缩应力的实验方法包括将类球体嵌入琼脂糖凝胶中13。尽管该方法能有效模拟物理限制，但消除了天然的细胞外基质（ECM）与细胞之间的相互作用。Dolega 等人采用渗透压诱导压缩应力，然而类球体悬浮于培养基中，因此仍缺乏ECM相互作用9。Pandey 等人则利用Transwell插入物和重物对嵌入胶原中的类球体施加压缩，该方法保留了ECM-细胞相互作用，但限制了对免疫细胞迁移能力和细胞毒性活性进行定量所需的高分辨率成像14。这些局限性共同凸显了开发一种能够实现在肿瘤微环境（TME）中对细胞形态响应压缩力的过程进行实时成像的实验平台的迫切需求。

本文介绍了一种微流控压缩装置的实验方案15，该装置可在施加可控压缩应力的同时，维持生理相关的细胞外基质-细胞相互作用，并支持对免疫-肿瘤动态过程进行高分辨率的活细胞成像。本方案包括装置组件的制备（第1节）、装置的组装（第2节）以及肿瘤-免疫相互作用的成像（第3节）。我们以自然杀伤（NK）细胞杀伤绿色荧光蛋白（GFP）标记的肿瘤类球体的实验为例，展示了该工作流程。除本应用外，该平台还可便捷地用于研究机械力对多种细胞类型及三维微环境中细胞间相互作用的影响。

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方案

1. 装置组件的准备

  1. 样品加载室的表面活化
    1. 将掩膜覆盖在样品加样室（第一层，L1）上，仅暴露加样孔。
    2. 使用高功率设置（45 W）将暴露的掩蔽层1用氧气等离子体处理15秒。
    3. 将第一层置于培养皿中，随后在生物安全柜中继续以下步骤。
    4. 每孔加入相应处理 10 µL 1% 聚乙烯亚胺（PEI）处理 10 分钟。
    5. 通过从每个孔的四个角落进行真空抽吸，移除PEI，以防止刮伤玻璃表面。
    6. 洗涤各孔 10 µL 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后从侧边用真空抽吸法除去洗涤液。
    7. 对孔进行处理 10 µL 用0.1%戊二醛固定30分钟，然后从角落处用真空抽滤法去除戊二醛。
    8. 用 PBS 洗涤孔板三次，每次洗涤后从角落吸去洗液。
    9. 用铝箔包裹含有第一层的培养皿，并将其留在生物安全柜中过夜。
  2. 灭菌 金属框架的
    1. 将38 mm × 88 mm 金属框架及十二个 M2.5 圆头螺丝置于 70% 乙醇中过夜。
  3. 引发 压力控制单元
    1. 使用高功率设置（45 W）将压力控制单元暴露于氧气等离子体中处理30秒。
    2. 将压力控制单元（特征面朝下）浸入去离子水（DI水）中过夜，以充满压力控制单元内的通道和腔室。
    3. 第二天，将压力控制单元从其浸泡的去离子水中取出。
    4. 向微流控储液池中加入50 mL去离子水。
      注意： 微流控储液池由一个50 mL的锥形管组成，该锥形管配有一个定制盖子，盖子上设有两个管路连接口：一个气动管路和一个液体输送管路。
    5. 将装有空气的注射器连接到气动管路线上。
    6. 缓慢下压注射器活塞，使储液器加压，推动去离子水通过流体输送管路，直至管路充满，水开始从管端滴出。
    7. 将预装且正在滴液的流体输送管连接至聚碳酸酯歧管，然后连接到压力控制单元背面的1.5 mm入口。
    8. 让压力控制单元和歧管组件自然风干2小时。完全干燥后，压力控制单元和歧管组件即可进行下一步操作。

2. 组装装置

  1. 细胞包埋胶原的制备
    1. 从70%乙醇中取出金属框架和螺丝并晾干。
    2. 在生物安全柜中，放置三个 600 µL 将微量离心管置于冰上。按如下方式标记各管： "N" （中和） "sp" （MCF-7 球状体），以及 "sp+NK" （MCF-7 球状体与NK细胞）
    3. 通过加入10制备中和混合液× 所需体积的 Medium 199 (M199) 和氢氧化钠 (NaOH) 加入到 "N" 管
    4. 将适量体积的 M199:NaOH 混合液转移至 "sp" 和 "sp+NK" 管，以达到最终1× 浓度
    5. 收集肿瘤类球体，并在141 × g下离心 × g 3 分钟，使类球体沉降至管底。
      注意：肿瘤类球体约 200 µm 使用先前描述的琼脂糖微孔阵列平台生成了直径为的微球16简而言之，3 × 106 MCF-7 细胞被接种至 36 × 由36个琼脂糖微孔组成的微孔阵列 200 µm 直径 200 µm 深入培养7天，以生成实验所用的肿瘤球体。
    6. 小心吸除上清液，并将球状体重新悬浮于 200 µL 50:50 MCF-7/NK 完全培养基（表1 和 表2).
    7. 将NK细胞收集至50 mL锥形管中，于141 × g离心 × g 4 分钟，然后计数细胞。
      注意：NK细胞的活力应 >实验当天85%
    8. 将所得沉淀重悬于 200 µL 完全NK培养基
    9. 向每支微量离心管中加入适量体积的胶原蛋白储备液。
    10. 向每支试管中加入适量的细胞悬液，以获得最终体积 200 µL 含 1.5 mg/mL 胶原蛋白。
      注意： "sp" 悬浮液仅含有肿瘤球状体，而 "sp+NK" 悬浮液含有肿瘤球体和1.5 × 106 自然杀伤细胞
    11. 通过移液轻轻混匀，以确保细胞和胶原蛋白分布均匀，同时尽量减少气泡的产生。
  2. 设备组装与细胞加载
    1. 将第一层放置于干燥的金属框架内。
    2. 加载 9 µL 将胶原混合物加入每个孔中。
    3. 使用显微镜将压力控制单元和歧管组件与第1层的细胞室对齐。
    4. 将干燥的螺丝穿过歧管并插入金属框架中，将压力控制单元和第1层固定在歧管与金属框架之间。
    5. 将组装好的装置放入 37 °C，5% CO₂₂ 孵育45分钟以使胶原蛋白聚合。
    6. 通过四个培养基加样口加入体积比为50:50的MCF-7/NK完全细胞培养基。

3. 肿瘤-免疫相互作用的成像

  1. 将组装好的装置放入倒置落射荧光显微镜上的载物台培养箱中，用于活细胞成像。
    注意：在整个成像过程中，载物台培养箱保持37 °C的温度和约50%的湿度。
  2. 在组装好的装置上放置一个辅助外盒，以在整个成像期间维持内部环境为37 °C、100%湿度和5% CO₂。
  3. 使用气动管路将装置连接至压力控制器。
  4. 在施加压缩之前，获取肿瘤类器官的明场和GFP图像，以便评估压缩后的类器官形变情况。
  5. 在整个成像期间施加120 mbar的恒定压力。
    注意：压力控制器软件允许用户设定实验过程中施加的压力模式和强度。补充图1展示了压力控制系统示意图。
  6. 开始延时成像，每10分钟获取一次明场和GFP图像，持续18小时。
    注意：图像使用倒置落射荧光显微镜配备的20×物镜，在每个肿瘤类器官的中心Z平面进行采集。明场和GFP荧光图像的曝光时间分别为200.1 ms和298.9 ms。

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结果

在以下实验中，采用一种微流控压缩装置15来模拟生理相关三维微环境中肿瘤与免疫系统的相互作用，同时可对肿瘤类球体施加静态和动态压缩（图1）。装置的各个组件（图1A1）及其组装顺序（图1A2）如图1A所示。金属框架作为装置的基底，细胞培养腔层（L1）置于框架内部。压力控制单元由L2和L3层经等离子体键合而成，放置于L1层上方，随后安装流体分配层（图1A2）。L1层与压力控制单元共同构成功能性微流控装置，并通过螺钉将金属框架与流体分配层夹紧固定。流体分配层包含用于连接管路以向装置供压的进样口，以及支持长期活细胞成像实验的培养基储液池。

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讨论

本方法描述了使用微流控压缩装置研究压缩应力对肿瘤-免疫相互作用的影响。该系统能够对嵌入三维胶原基质中的肿瘤类球体施加可控的机械压缩。构成细胞培养腔底部（L1）的玻璃基板可实现高分辨率的活细胞成像，使该平台非常适合用于量化免疫细胞运动性、浸润行为及细胞毒活性的研究。重要的是，该系统在精确控制机械环境的同时，保留了细胞-细胞和细胞-基质间的相互作用。相比之下，现有的许多研究压缩应力的实验方法往往需要在细胞外基质介导的细胞相互作用9,13与高分辨率成像14之间进行权衡。

在本研究中，自然杀伤细胞（NK细胞）和MCF-7乳腺肿瘤球体被用作模型系统。然而，该微流控压缩装置并不局限于这些细胞类型。迄今为止，该平台已成功应用于多种乳腺细胞模型，包括MDA-MB-231乳腺肿瘤球体和MCF-10A乳腺球体15,17。该...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作得到了美国国家癌症研究所（资助号 R01CA221346）、康奈尔大学工程学院授予 FM 的兰斯·R·柯林斯奖学金以及康奈尔大学教务长研究韧性基金对 FM 的资助。部分工作在康奈尔大学纳米尺度设施中心完成，该中心是国家纳米技术协调基础设施（NNCI）的成员，由美国国家科学基金会资助（资助号 NNCI-2025233）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 N NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× M199 培养基Sigma-AldrichM0650200 µL
2-巯基乙醇ThermoFisher313500100
空气压缩机ElveflowJun-Air Model 3 Compressor
自动 X-Y 显微镜载物台Applied Scientific InstrumentationMS-2000
CCD 相机Hamamatsu PhotonicsORCA-R2
胎牛血清（FBS）GeminiBioS11150
流体输送管路ElveflowPTFE 管路备用卷外径 1/16 英寸
荧光光源Excelitas Technologies X-Cite 系列 120 PC 装置
叶酸SigmaF7876
戊二醛EM Sciences 160190.10%
Harrick 等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC-001-HP高功率设置（45 W）
马血清（HS）ThermoFisher16050-122
倒置落射荧光显微镜OlympusIX8120 倍物镜（NA = 0.25），使用 Olympus CellSens 软件操作
掩膜Artus10 片铝制垫片材料厚度为 0.0125 英寸（0.75 mm）
MCF-7/GFP（嘌呤霉素）稳定细胞系GenTarget IncSC050-G
金属框架定制 定制 
微流控储液池Elveflow50 mL 微流控储液池 
显微镜 OlympusCKX414 倍物镜             （NA = 0.1）
肌醇SigmaI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
青霉素/链霉素Gibco 15140122
磷酸盐缓冲液（PBS） ThermoFisher 10010072
气动管路ElveflowPUR 聚醚透明进气管外径 4 mm
聚乙烯亚胺（PEI）Sigma-AldrichP31431%
压力控制器ElveflowOB1 NK4使用 Elveflow Smart Interface 软件操作
大鼠尾部 I 型胶原蛋白 Corning35424931.3 µL 的 9.6 mg/mL 胶原原液
螺丝PhillipsM2.5 圆头12 颗螺丝
载物台培养箱Precision Plastic定制
注射器Becton Dickinson303134配 Elveflow 的公鲁尔锁接头转 3/32 英寸外径卡套
α-MEM 培养基ThermoFisher12561056

参考文献

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