我们提出了一种利用微流控平台在三维（3D）环境中模拟肿瘤-免疫相互作用的实验方案。实验结果表明，自然杀伤（NK）细胞在机械压缩条件下仍能保持其抗肿瘤活性。
本文内容
摘要
摘要
在基于细胞的免疫治疗中，机械力显著影响免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力。为了杀伤肿瘤细胞，免疫细胞必须对靶细胞施加作用力，并形成免疫突触，从而递送包括颗粒酶B在内的细胞毒性分子。尽管机械信号的重要性已广为人知，但如何利用这些机械信号来增强免疫介导的杀伤作用仍不清楚。这一知识空白在一定程度上源于缺乏能够在生理上接近真实的环境中，为细胞培养提供精确控制的机械应力的工具。本文中，我们描述了一种微流控压缩装置，该装置可在细胞外基质（ECM）中对肿瘤类球体施加静态或动态压缩，同时通过光学显微镜实现对肿瘤-免疫相互作用的实时成像。
该微流控平台包含12个腔室（6个对照腔室和6个功能腔室）。每个腔室均设有位于压力控制单元正下方的细胞培养室。嵌入细胞外基质（ECM）中的类球体被放置在细胞培养室内。利用该平台，我们在定义的机械压缩条件下研究了自然杀伤（NK）细胞对乳腺肿瘤类球体（MCF-7）的杀伤效率。结果显示，在1.5 mg/mL胶原蛋白环境中，无论是否存在机械压缩，NK细胞仍然是诱导肿瘤类球体死亡的主要驱动因素。 因此表明，NK细胞能够在压缩应力下维持其抗肿瘤活性。这些发现证明了该平台在研究机械力在肿瘤-免疫相互作用中作用的实用性。目前正在进行的研究旨在鉴定使免疫细胞适应压缩应力的分子机制。这些研究获得的见解可能揭示一种有前景的治疗途径。
引言
基于细胞的癌症免疫疗法是一种利用免疫细胞靶向癌细胞的治疗策略1。该策略在血液系统肿瘤的治疗中已显示出显著成效2,3,4。然而，这种在血液系统肿瘤中取得的成功尚未完全转化为实体瘤治疗的成果5,6,7。造成这一局限性的主要原因之一是实体瘤所特有的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。
肿瘤微环境（TME）具有独特的力学信号，可调控细胞行为。免疫细胞有效杀伤肿瘤细胞需要其对靶细胞施加力学力，并形成免疫突触，通过该突触递送细胞毒性分子8。因此，理解力学力如何影响免疫细胞功能，可能揭示新的治疗策略，以提高基于细胞的免疫疗法对实体瘤的疗效。
实体肿瘤微环境（TME）的一个关键力学特征是其对生长中肿瘤施加的压缩应力9,10。迄今为止，大多数关于压缩的研究主要集中在压缩对肿瘤细胞行为的影响10,11。直到最近，研究关注才开始转向理解压缩如何影响TME中的免疫细胞12。因此，压缩应力影响自然杀伤（NK）细胞迁移、免疫突触形成及细胞毒活性的机制仍远未被充分阐明，也缺乏足够的量化研究。这一空白严重限制了我们对如何利用TME内的力学信号来增强对实体瘤的免疫靶向治疗的理解。
解决这一问题的主要障碍在于缺乏能够在生理相关的三维微环境中施加可控且可量化的压缩力，同时实现对肿瘤-免疫相互作用进行实时成像的实验平台。早期研究压缩应力的实验方法包括将类球体嵌入琼脂糖凝胶中13。尽管该方法能有效模拟物理限制，但消除了天然的细胞外基质（ECM）与细胞之间的相互作用。Dolega 等人采用渗透压诱导压缩应力，然而类球体悬浮于培养基中，因此仍缺乏ECM相互作用9。Pandey 等人则利用Transwell插入物和重物对嵌入胶原中的类球体施加压缩，该方法保留了ECM-细胞相互作用，但限制了对免疫细胞迁移能力和细胞毒性活性进行定量所需的高分辨率成像14。这些局限性共同凸显了开发一种能够实现在肿瘤微环境（TME）中对细胞形态响应压缩力的过程进行实时成像的实验平台的迫切需求。
本文介绍了一种微流控压缩装置的实验方案15，该装置可在施加可控压缩应力的同时，维持生理相关的细胞外基质-细胞相互作用，并支持对免疫-肿瘤动态过程进行高分辨率的活细胞成像。本方案包括装置组件的制备（第1节）、装置的组装（第2节）以及肿瘤-免疫相互作用的成像（第3节）。我们以自然杀伤（NK）细胞杀伤绿色荧光蛋白（GFP）标记的肿瘤类球体的实验为例，展示了该工作流程。除本应用外，该平台还可便捷地用于研究机械力对多种细胞类型及三维微环境中细胞间相互作用的影响。
方案
1. 装置组件的准备
- 样品加载室的表面活化
- 将掩膜覆盖在样品加样室（第一层，L1）上，仅暴露加样孔。
- 使用高功率设置（45 W）将暴露的掩蔽层1用氧气等离子体处理15秒。
- 将第一层置于培养皿中，随后在生物安全柜中继续以下步骤。
- 每孔加入相应处理 10 µL 1% 聚乙烯亚胺（PEI）处理 10 分钟。
- 通过从每个孔的四个角落进行真空抽吸，移除PEI，以防止刮伤玻璃表面。
- 洗涤各孔 10 µL 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后从侧边用真空抽吸法除去洗涤液。
- 对孔进行处理 10 µL 用0.1%戊二醛固定30分钟，然后从角落处用真空抽滤法去除戊二醛。
- 用 PBS 洗涤孔板三次，每次洗涤后从角落吸去洗液。
- 用铝箔包裹含有第一层的培养皿，并将其留在生物安全柜中过夜。
- 灭菌 金属框架的
- 将38 mm × 88 mm 金属框架及十二个 M2.5 圆头螺丝置于 70% 乙醇中过夜。
- 引发 压力控制单元
- 使用高功率设置（45 W）将压力控制单元暴露于氧气等离子体中处理30秒。
- 将压力控制单元（特征面朝下）浸入去离子水（DI水）中过夜，以充满压力控制单元内的通道和腔室。
- 第二天，将压力控制单元从其浸泡的去离子水中取出。
- 向微流控储液池中加入50 mL去离子水。
注意： 微流控储液池由一个50 mL的锥形管组成，该锥形管配有一个定制盖子，盖子上设有两个管路连接口：一个气动管路和一个液体输送管路。 - 将装有空气的注射器连接到气动管路线上。
- 缓慢下压注射器活塞，使储液器加压，推动去离子水通过流体输送管路，直至管路充满，水开始从管端滴出。
- 将预装且正在滴液的流体输送管连接至聚碳酸酯歧管，然后连接到压力控制单元背面的1.5 mm入口。
- 让压力控制单元和歧管组件自然风干2小时。完全干燥后，压力控制单元和歧管组件即可进行下一步操作。
2. 组装装置
- 细胞包埋胶原的制备
- 从70%乙醇中取出金属框架和螺丝并晾干。
- 在生物安全柜中，放置三个 600 µL 将微量离心管置于冰上。按如下方式标记各管： "N" （中和） "sp" （MCF-7 球状体），以及 "sp+NK" （MCF-7 球状体与NK细胞）
- 通过加入10制备中和混合液× 所需体积的 Medium 199 (M199) 和氢氧化钠 (NaOH) 加入到 "N" 管
- 将适量体积的 M199:NaOH 混合液转移至 "sp" 和 "sp+NK" 管，以达到最终1× 浓度
- 收集肿瘤类球体，并在141 × g下离心 × g 3 分钟，使类球体沉降至管底。
注意：肿瘤类球体约 200 µm 使用先前描述的琼脂糖微孔阵列平台生成了直径为的微球16简而言之，3 × 106 MCF-7 细胞被接种至 36 × 由36个琼脂糖微孔组成的微孔阵列 200 µm 直径 200 µm 深入培养7天，以生成实验所用的肿瘤球体。 - 小心吸除上清液，并将球状体重新悬浮于 200 µL 50:50 MCF-7/NK 完全培养基（表1 和 表2).
- 将NK细胞收集至50 mL锥形管中，于141 × g离心 × g 4 分钟，然后计数细胞。
注意：NK细胞的活力应 >实验当天85% - 将所得沉淀重悬于 200 µL 完全NK培养基
- 向每支微量离心管中加入适量体积的胶原蛋白储备液。
- 向每支试管中加入适量的细胞悬液，以获得最终体积 200 µL 含 1.5 mg/mL 胶原蛋白。
注意： "sp" 悬浮液仅含有肿瘤球状体，而 "sp+NK" 悬浮液含有肿瘤球体和1.5 × 106 自然杀伤细胞 - 通过移液轻轻混匀，以确保细胞和胶原蛋白分布均匀，同时尽量减少气泡的产生。
- 设备组装与细胞加载
- 将第一层放置于干燥的金属框架内。
- 加载 9 µL 将胶原混合物加入每个孔中。
- 使用显微镜将压力控制单元和歧管组件与第1层的细胞室对齐。
- 将干燥的螺丝穿过歧管并插入金属框架中，将压力控制单元和第1层固定在歧管与金属框架之间。
- 将组装好的装置放入 37 °C，5% CO₂₂ 孵育45分钟以使胶原蛋白聚合。
- 通过四个培养基加样口加入体积比为50:50的MCF-7/NK完全细胞培养基。
3. 肿瘤-免疫相互作用的成像
- 将组装好的装置放入倒置落射荧光显微镜上的载物台培养箱中，用于活细胞成像。
注意：在整个成像过程中，载物台培养箱保持37 °C的温度和约50%的湿度。 - 在组装好的装置上放置一个辅助外盒，以在整个成像期间维持内部环境为37 °C、100%湿度和5% CO₂。
- 使用气动管路将装置连接至压力控制器。
- 在施加压缩之前，获取肿瘤类器官的明场和GFP图像，以便评估压缩后的类器官形变情况。
- 在整个成像期间施加120 mbar的恒定压力。
注意：压力控制器软件允许用户设定实验过程中施加的压力模式和强度。补充图1展示了压力控制系统示意图。 - 开始延时成像，每10分钟获取一次明场和GFP图像，持续18小时。
注意：图像使用倒置落射荧光显微镜配备的20×物镜，在每个肿瘤类器官的中心Z平面进行采集。明场和GFP荧光图像的曝光时间分别为200.1 ms和298.9 ms。
结果
在以下实验中，采用一种微流控压缩装置15来模拟生理相关三维微环境中肿瘤与免疫系统的相互作用，同时可对肿瘤类球体施加静态和动态压缩（图1）。装置的各个组件（图1A1）及其组装顺序（图1A2）如图1A所示。金属框架作为装置的基底，细胞培养腔层（L1）置于框架内部。压力控制单元由L2和L3层经等离子体键合而成，放置于L1层上方，随后安装流体分配层（图1A2）。L1层与压力控制单元共同构成功能性微流控装置，并通过螺钉将金属框架与流体分配层夹紧固定。流体分配层包含用于连接管路以向装置供压的进样口，以及支持长期活细胞成像实验的培养基储液池。
图1：用于在机械压缩条件下研究免疫细胞与肿瘤类球体相互作用的微流控压缩装置。（A1）装置组装所需组件的照片，从左至右依次为：流体分配器、压力控制单元（L2 + L3）、细胞室层（L1）和金属框架。（A2）装置组件的三维示意图，从上至下依次为：流体分配器、压力控制单元（L2 + L3）、细胞室层（L1）和金属框架。PDMS层L2和L3通过等离子体键合形成压力控制单元，位于细胞室上方。流体分配器和金属框架用于固定组装完成的装置。（B1）压缩单元在压缩前和压缩后的横截面示意图。将包埋于细胞外基质（ECM）中的肿瘤类球体和NK细胞置于细胞室内。压缩前，L1底层与L2底层之间的初始距离记为h。当对压力控制单元施加压力时，L2向下弯曲，导致PDMS活塞压缩肿瘤类球体。压缩后L2的向下位移记为Δh。（B2）MCF-7肿瘤类球体与NK细胞在压缩前（左）和压缩后（右）的明场与GFP荧光图像叠加图。MCF-7细胞经GFP标记，而NK细胞未标记。图中蓝色圆圈标示代表性NK细胞，黄色轮廓标示肿瘤类球体的边缘。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
组装完成后，可使用微流控压缩装置对肿瘤类球体进行压缩，如图1B所示。在此过程中，将包埋于胶原中的含自然杀伤细胞（NK细胞）的肿瘤类球体引入细胞腔室（L1）。当对压力腔室（L3）施加压力时，可变形的膜层（L2）向下偏转，促使聚二甲基硅氧烷（PDMS）活塞将压缩力传递至类球体。压力腔室由外部压力源控制。有关该微流控压缩装置的设计、制备及表征的更多细节已在另一项研究中发表15。
我们将细胞腔底部（L1）与可变形膜底部（L2）之间的距离定义为 h（图1B1，左图）。在压缩前，该距离为 200 µm。当向压力控制单元施加流体压力时，可变形膜向下弯曲，使距离 h 减小 Δh（Δh；图1B1，右图），从而压缩包埋于胶原中的肿瘤类球体。在本系统中，压缩应变定义为 Δh/h，其中 h 为压缩前 L1 与 L2 之间的初始距离，Δh 为压缩后 L2 向下的位移量。膜的位移此前已通过观察附着在 L2 底部的荧光微球进行过校准。有关校准步骤和压缩应变计算的详细描述可参见先前的研究17。校准曲线示例见补充图2。
图1B2 展示了嵌入1.5 mg/mL胶原蛋白中的MCF-7类球体与NK细胞在压缩前（左图）和压缩后（右图）的代表性明场与GFP荧光合并图像。肿瘤类球体边界以黄色标出。压缩后，类球体的投影面积增加，表明其在成功施加机械载荷后发生了形变。本研究中所有实验均采用Δh/h = 50%的压缩应变。需注意，类球体直径范围为140 µm至200 µm，因此类球体实际承受的压缩应变略小于50%。补充视频1和补充视频2分别展示了在施加50%压缩应变前后，于GFP荧光通道中获取的嵌入1.5 mg/mL胶原蛋白中的MCF-7类球体的代表性X-Y z轴层扫图像。
微流控压缩装置用于研究 NK 细胞、压缩作用以及二者联合作用对肿瘤类球体死亡的影响（图 2）。该装置的设计包含 12 个培养孔，使其成为可能。其中六个孔可施加压缩，其余六个孔作为无压缩的对照。该配置实现了四种实验条件（图 2A）：仅含类球体且无压缩（sp）、类球体与 NK 细胞共培养但无压缩（+NK）、施加压缩的类球体（+comp），以及同时接受压缩和 NK 细胞处理的类球体（+comp+NK）。
图2机械压缩调节自然杀伤细胞对肿瘤球体的杀伤作用 (A) 在四种条件下嵌入浓度为1.5 mg/mL胶原中的MCF-7类球体的延时荧光图像：仅类球体对照组（sp）、类球体与NK细胞共培养组（+NK）、类球体施加压缩组（+comp），以及类球体同时施加压缩与NK细胞组（+comp+NK）。GFP荧光标记存活的MCF-7肿瘤细胞。黄色轮廓表示感兴趣区域（ROI），该区域基于18小时图像定义，并应用于所有时间点以进行荧光定量。测量ROI内的总GFP荧光强度，并用于后续分析。比例尺 = 50 µm. (B) 不同条件下单个球形体随时间变化的总GFP荧光强度。每条彩色线代表一个球形体的总荧光强度，已归一化至其在 t = 0 时的初始强度。黑线是对在对照条件下培养的7个球形体的荧光强度数据进行合并后拟合的二阶多项式曲线，用于作为计算(C)中肿瘤细胞丢失的参考基准。C) 通过从各类聚球体（spheroid）在 t = 18 h 时的 GFP 荧光强度中减去仅含聚球体的参照组（sp）的 GFP 强度，计算 +comp、+NK 及 +comp+NK 条件下的归一化 GFP 损失。因此，每个数据点代表单个聚球体的归一化 GFP 损失。误差线表示标准误（SEM）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
NK细胞、压缩力以及二者联合作用对肿瘤类球体的影响可通过1.5 mg/mL胶原中MCF-7类球体的代表性图像进行观察（图2A）。由于生成肿瘤类球体所用的MCF-7细胞经GFP标记，因此可通过GFP荧光变化监测肿瘤细胞的存活力。使用倒置落射荧光显微镜，每10分钟采集一次GFP和明场图像，持续18小时。值得注意的是，经压缩处理的类球体其投影面积大于未压缩类球体，证实机械负荷已成功从可变形膜传递至肿瘤类球体。随着时间推移，在+NK和+comp+NK条件下观察到GFP荧光逐渐减弱（图2A），表明NK细胞介导了肿瘤细胞的杀伤作用。
我们以GFP荧光的丢失作为衡量肿瘤细胞死亡的指标。本研究中使用的GFP标记MCF-7细胞通过慢病毒转导获得。简言之，采用慢病毒载体导入一个由延伸因子-1α（EF1α）启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达盒，同时携带由劳斯肉瘤病毒（RSV）启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因。感染后，慢病毒表达盒整合至MCF-7细胞的基因组DNA中，从而实现GFP的稳定表达。随后使用嘌呤霉素筛选以清除未转导的细胞。MCF-7细胞的GFP标记使得通过监测GFP荧光强度随时间的变化来定量肿瘤细胞活力成为可能（图2B）。先前研究已证实GFP荧光的减弱与已知的细胞死亡标志物（包括活/死细胞染料碘化丙啶（PI）和凋亡标志物annexin-V）之间存在强相关性18，从而验证了GFP荧光丢失可作为肿瘤细胞死亡的替代性检测指标。
为了量化四种实验条件对肿瘤活力的影响，于每个时间点测量每个肿瘤类球体的总 GFP 荧光强度，扣除背景信号后，归一化至其初始值（图 2B）。类球体的总荧光强度在预定义的兴趣区域（ROI）内进行计算。该 ROI 通过使用实验室自编的 MATLAB 脚本，在 18 小时图像中手动勾勒肿瘤类球体的边界获得（18 小时图中的黄色轮廓，图 2A）。随后，计算每个时间点该 ROI 内的总荧光强度，并通过减去在图像其他位置选定的独立 ROI 中测得的平均背景荧光值进行校正。最终将背景校正后的荧光值归一化至类球体的初始荧光强度。
每条彩色曲线代表在特定实验条件下单个球状体的归一化GFP强度（图2B）。该曲线通过对实验数据进行二阶多项式拟合获得。紫色曲线代表仅受到压缩作用的球状体（+comp，图2B），红色曲线代表含有自然杀伤细胞（NK细胞）的球状体（+NK，图2B），蓝色曲线代表同时受到压缩作用和NK细胞作用的球状体（+comp+NK，图2B）。相比之下，黑色曲线是对七个体外培养的仅含球状体条件（sp，图2B）下数据的二阶多项式拟合，作为对照组。在图2B中，为清晰起见，仅展示了多项式拟合后的数据，未显示原始实验数据点。值得注意的是，仅含球状体（sp）和球状体+压缩（+comp）条件下的GFP荧光强度随时间总体呈上升趋势（图2B），表明肿瘤持续生长或细胞活力得以维持。相反，+NK和+comp+NK条件下的GFP荧光强度随时间逐渐下降（图2B），提示肿瘤细胞发生死亡。
通过从给定条件（+comp、+NK 或 +comp+NK）下每个类球体在 18 小时时拟合的归一化 GFP 荧光强度中减去对照条件下的值，来量化累积的肿瘤细胞损失（图 2C）。因此，每个数据点代表单个类球体相对于仅含类球体的对照组的归一化 GFP 损失量（图 2C）。据此，+comp 条件反映仅由压缩引起的 GFP 损失（紫色，图 2C），+NK 条件反映仅由 NK 细胞引起的 GFP 损失（红色，图 2C），而 +comp+NK 条件则反映压缩与 NK 细胞共同作用引起的 GFP 损失（蓝色，图 2C）。+comp 条件下的 GFP 损失程度最低（图 2C），表明单独压缩对类球体存活率的影响极小。相比之下，+NK 和 +comp+NK 条件下的 GFP 损失均显著高于 +comp 条件（图 2C），说明 NK 细胞是导致肿瘤细胞死亡的主要因素。尽管 +comp+NK 条件的平均 GFP 损失高于 +NK 条件，但该差异未达到统计学显著性（图 2C）。这些结果表明，压缩不会削弱 NK 细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用。综上所述，这些发现证明，微流控压缩装置可成功用于在生理相关的三维环境中定量评估压缩和 NK 细胞对肿瘤类球体存活率的独立及联合作用。
相比之下，当出现以下情况时可能会导致次优结果：（1）类球体位于活塞边界之外，（2）类球体过于靠近活塞边界，以及（3）多个类球体之间的间距小于一个类球体直径图3）。在这些情况下，应将相应字段从分析中排除。
图3：被排除在分析之外的类球体图像序列的代表性示例。展示的是在1.5 mg/mL胶原蛋白中，MCF-7类球体与NK细胞共培养时，在受压前（左列）和受压后（右两列）的延时明场（BF）、GFP荧光及合并图像。压缩前图像在施加压力前20分钟、延时成像开始前10分钟采集。随后每10分钟采集一次图像，持续18小时，其中0小时对应压缩后立即采集的第一张图像，18小时为实验结束时间点。蓝色箭头指示PDMS活塞（L2）的边缘。该成像视野被排除在分析之外，原因是压缩区域内存在两个类球体，且它们距离活塞边界过近。因此，在压缩过程中无法可靠地量化类球体的形变和GFP荧光强度。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
（1）位于活塞边界外的类球体不会受到压缩，因为压力仅施加在活塞区域内。因此，这些类球体应从压缩组和对照组中均予以排除。（2）位于活塞边界上或附近的类球体（图3，上方的类球体）也应排除，因为此类类球体承受的是非均匀的机械载荷。（3）与邻近类球体距离在一个类球体直径范围内的类球体应予以排除（图3）。类球体之间距离过近会增加GFP荧光强度定量的难度，因为感兴趣区域（ROI）是基于最终时间点来定义的。随着时间推移，类球体边界可能变得难以分辨，导致难以划定准确仅包含单个类球体的ROI。在装置加载过程中，确保类球体位于压缩区域中心，可最大程度减少上述问题。仔细关注类球体的分布、定位及装置设置，对于实现均匀压缩并获得可靠、可重复的实验结果至关重要。
| 组分 | 浓度 |
| α-MEM 培养基 | |
| 胎牛血清 (FBS) | 10% |
| 青霉素/链霉素 | 1% |
表1：完全MCF-7培养基。
| 组分 | 浓度 |
| α-MEM 培养基 | |
| 肌醇（Myo-inositol） | 0.2 mM |
| 2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol） | 0.1 mM |
| 胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS） | 12.50% |
| 叶酸（Folic acid） | 0.02 mM |
| 马血清（Horse serum, HS） | 12.50% |
| 青霉素/链霉素（Penicillin/streptomycin） | 1% |
表2：NK完全培养基。
补充图1：压力控制系统示意图。空气压缩机向压力控制器提供压缩空气（最高可达20 psi）。压力控制器根据用户设定的参数，调节输送至压力储液罐的空气压力。该控制器的最大工作压力为200 mbar，压力稳定性为满量程（FS）的0.005%，压力分辨率为满量程（FS）的0.003%，响应时间为9 ms，可实现精确且可重复的压力控制。控制器通过通用串行总线（USB）与计算机连接，用户可通过配套软件设定施加压力的大小和压力波形。该软件支持多种压缩波形，包括恒定压力、正弦波、三角波和周期性压缩。在本示意图中，压力设定为120 mbar，该压力下的压缩空气通过气动管路输送至加压储液罐。加压储液罐内含50 mL去离子（DI）水，用于将气动压力转换为流体压力。储液罐加压后，推动液体通过流体输送管路，进入微流控压缩装置的压力控制单元（装置细节见图1），利用流体压力对肿瘤类球体施加压缩。需注意，使用液体压力可避免在PDMS装置中产生气泡。请点击此处下载该文件。
补充图2：微流控压缩装置的校准曲线，显示活塞位移（µm）与施加到压力控制腔的压力（KPa）之间的关系。实验测量值用圆点表示，实线对应COMSOL模拟结果。误差线表示八次独立实验测量的平均值标准误差（SEM），但因数值过小而不可见。本图经英国皇家化学会许可，转载自Suh等人的研究15。请点击此处下载该文件。
补充视频 1： 压缩前 GFP 标记的 MCF-7 类球体的 X-Y Z 轴层扫图像。将类球体嵌入微流控压缩装置中浓度为 1.5 mg/mL 的胶原蛋白内，并使用 GFP 荧光通道以 1 µm 的 Z 轴步长进行成像。随后使用 ImageJ 增强对比度。比例尺 = 50 µm。请点击此处下载该文件。
补充视频 2： 对嵌入在 1.5 mg/mL 胶原蛋白中的 GFP 标记 MCF-7 类球体施加 50% 的压缩应变（Δh/h = 50%）。压缩后，使用 1 µm 步长在 GFP 荧光通道中采集 X–Y 方向的 z 轴层扫图像，并在 ImageJ 中进行处理以增强对比度。比例尺 = 50 µm。请点击此处下载该文件。
讨论
本方法描述了使用微流控压缩装置研究压缩应力对肿瘤-免疫相互作用的影响。该系统能够对嵌入三维胶原基质中的肿瘤类球体施加可控的机械压缩。构成细胞培养腔底部（L1）的玻璃基板可实现高分辨率的活细胞成像，使该平台非常适合用于量化免疫细胞运动性、浸润行为及细胞毒活性的研究。重要的是，该系统在精确控制机械环境的同时，保留了细胞-细胞和细胞-基质间的相互作用。相比之下，现有的许多研究压缩应力的实验方法往往需要在细胞外基质介导的细胞相互作用9,13与高分辨率成像14之间进行权衡。
在本研究中，自然杀伤细胞（NK细胞）和MCF-7乳腺肿瘤球体被用作模型系统。然而，该微流控压缩装置并不局限于这些细胞类型。迄今为止，该平台已成功应用于多种乳腺细胞模型，包括MDA-MB-231乳腺肿瘤球体和MCF-10A乳腺球体15,17。该平台可轻松适配用于研究多种其他肿瘤模型中的肿瘤–免疫相互作用，包括脑部和肺部肿瘤球体。同样，该平台也适用于除NK细胞外的多种免疫细胞群体，从而能够在机械压缩条件下探究多样化的肿瘤-免疫相互作用。此外，该装置不仅限于基于球体的研究，还可调整用于单细胞实验。综上所述，这些特性使该平台成为一种多功能工具，可用于研究机械力如何在广泛的生物学和疾病背景下调控细胞行为。
该系统的另一个优势在于能够精确控制施加于样品的压力大小和压缩模式。在本研究中，实验全程施加了50%的静态压缩应变。然而，应变水平可根据实验目的灵活调整。此外，利用外部压力控制系统，可对类球体施加多种形式的动态压缩，包括方波和正弦波压缩。方波压缩包含交替的加压与释放阶段17，而正弦波压缩则表现为压力随时间逐渐增加和减少的过程15。结合定量成像与预测性建模，这些功能可用于研究动态压缩对免疫杀伤效率的影响。
我们注意到，该压缩装置最初是为表征肿瘤力学特性而开发的17. 通过整合一个 原位 力传感器，肿瘤球体下方的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶层，可对球体的机械特性（如刚度和黏弹性）进行定量表征15,17这一改进拓展了该平台的应用范围，使其不仅可用于模拟压缩应力，还可直接测量肿瘤的力学行为。
总体而言，微流控压缩装置具有广泛的应用，从测量球状体的力学特性，到在力学可调控的环境中研究肿瘤与免疫细胞的相互作用。然而，要成功运行该装置，需完成若干关键步骤。肿瘤球状体应置于每个孔的中心附近，以确保压缩的均匀性。压力控制单元必须与细胞腔室层（L1）正确对齐，以确保压力的准确传递。当将压力控制单元放置在L1层上方时，可能引入气泡，从而对成像质量和实验结果产生不利影响。为避免此问题，在加载胶原混合物时应小心避免引入气泡，并在放置压力控制单元前，向每个孔中加入8 µL胶原混合物，使腔室略微过满。这有助于确保各层之间完全接触，并降低空气滞留的可能性。
综上所述，该装置能够在支持肿瘤-免疫相互作用的三维生理相关胶原基质中，实现对压缩应力的可控建模。该平台为研究静态和动态力学因素如何调控肿瘤微环境中免疫介导的杀伤作用及肿瘤细胞行为提供了工具。目前，我们正在鉴定介导免疫杀伤肿瘤细胞力学调控的分子机制。这些研究可能为开发潜在的新型治疗药物靶点提供依据。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了美国国家癌症研究所（资助号 R01CA221346）、康奈尔大学工程学院授予 FM 的兰斯·R·柯林斯奖学金以及康奈尔大学教务长研究韧性基金对 FM 的资助。部分工作在康奈尔大学纳米尺度设施中心完成，该中心是国家纳米技术协调基础设施（NNCI）的成员，由美国国家科学基金会资助（资助号 NNCI-2025233）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 N NaOH | Sigma-Aldrich | 79724 | 7 µL |
| 10× M199 培养基 | Sigma-Aldrich | M0650 | 200 µL |
| 2-巯基乙醇 | ThermoFisher | 313500100 | |
| 空气压缩机 | Elveflow | Jun-Air Model 3 Compressor | |
| 自动 X-Y 显微镜载物台 | Applied Scientific Instrumentation | MS-2000 | |
| CCD 相机 | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| 胎牛血清（FBS） | GeminiBio | S11150 | |
| 流体输送管路 | Elveflow | PTFE 管路备用卷 | 外径 1/16 英寸 |
| 荧光光源 | Excelitas Technologies | X-Cite 系列 120 PC 装置 | |
| 叶酸 | Sigma | F7876 | |
| 戊二醛 | EM Sciences | 16019 | 0.10% |
| Harrick 等离子清洗仪 | Harrick Plasma | PDC-001-HP | 高功率设置（45 W） |
| 马血清（HS） | ThermoFisher | 16050-122 | |
| 倒置落射荧光显微镜 | Olympus | IX81 | 20 倍物镜（NA = 0.25），使用 Olympus CellSens 软件操作 |
| 掩膜 | Artus | 10 片铝制垫片材料 | 厚度为 0.0125 英寸（0.75 mm） |
| MCF-7/GFP（嘌呤霉素）稳定细胞系 | GenTarget Inc | SC050-G | |
| 金属框架 | 定制 | 定制 | |
| 微流控储液池 | Elveflow | 50 mL 微流控储液池 | |
| 显微镜 | Olympus | CKX41 | 4 倍物镜 （NA = 0.1） |
| 肌醇 | Sigma | I7508 | |
| NK-92 MI | ATCC | CRL-2407 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | ThermoFisher | 10010072 | |
| 气动管路 | Elveflow | PUR 聚醚透明进气管 | 外径 4 mm |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Sigma-Aldrich | P3143 | 1% |
| 压力控制器 | Elveflow | OB1 NK4 | 使用 Elveflow Smart Interface 软件操作 |
| 大鼠尾部 I 型胶原蛋白 | Corning | 354249 | 31.3 µL 的 9.6 mg/mL 胶原原液 |
| 螺丝 | Phillips | M2.5 圆头 | 12 颗螺丝 |
| 载物台培养箱 | Precision Plastic | 定制 | |
| 注射器 | Becton Dickinson | 303134 | 配 Elveflow 的公鲁尔锁接头转 3/32 英寸外径卡套 |
| α-MEM 培养基 | ThermoFisher | 12561056 |
参考文献
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