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方法文章

一种改良的小鼠下颌牙槽窝愈合模型中的拔牙方法以提高操作效率与一致性

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DOI：

10.3791/72974

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2026年9月8日

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

本文内容

摘要

本文描述了一种改良的小鼠下颌第一磨牙拔除方法，并与传统方法进行了比较，以评估其操作效率和可重复性。该改良方法提高了操作的一致性，降低了建立小鼠下颌牙槽窝愈合模型时的技术难度。

摘要

牙槽窝愈合模型（TSHM）是一种广泛用于研究骨再生分子机制的动物模型。尽管小鼠下颌TSHM在研究下颌特异性病理过程方面具有重要价值，但由于下颌磨牙区域的解剖和生物力学特性，该模型的建立在技术上仍具挑战性。本方案介绍了一种改良的小鼠下颌第一磨牙拔除方法，并将其与传统技术进行比较，以提高操作效率和可重复性。在受控实验条件下，改良方法将平均拔牙时间从29分钟显著缩短至10分钟。此外，改良组在拔牙相关并发症（包括牙根和牙槽骨骨折）方面发生率更低，表明操作一致性得到改善。显微计算机断层扫描（μCT）分析进一步显示，在早期愈合过程中，拔牙窝结构的保存更为完整。这些结果表明，改良拔牙方法在降低小鼠下颌牙齿拔除技术难度的同时，提高了操作效率和可重复性。该方案可能有助于更一致地建立小鼠下颌牙槽窝愈合模型，尤其适用于显微外科经验有限的研究人员。

引言

牙槽骨愈合模型（TSHM）是研究骨再生的经典模型1。该模型在牙槽骨内造成一种具有挑战性但未达到临界大小的损伤，可在无需额外干预的情况下实现良好的自然愈合1。小鼠因其遗传背景清晰、骨代谢与人类相似、繁殖成本相对较低且易于饲养，被广泛用作模式生物2。在过去几十年中，基因编辑技术的快速发展使小鼠成为研究骨再生分子机制不可或缺的工具3。因此，转基因小鼠磨牙拔除已被广泛用于建立TSHM，以探究骨再生的调控机制4,5,6。

以往大多数研究均采用上颌骨建立小鼠拔牙后牙槽骨缺损模型4,5,6，因为下颌骨在力学上比上颌骨更坚硬且顺应性更低7，从而增加了拔牙操作的技术难度。此外，上颌磨牙拔除的手术视野相对更易接近，且上颌骨比下颌骨更易于固定，使手术操作的技术要求相对较低。尽管如此，小鼠下颌第一磨牙具有弯曲且增大的根尖形态，增强了其在周围牙槽骨中的机械固位力8,9，进一步加大了拔除难度（图1）。然而，下颌骨拔牙模型对于研究下颌骨特异性的病理过程仍不可或缺，包括骨髓炎、药物相关性颌骨骨坏死、种植体骨整合以及利用生物材料进行骨再生等研究10,11,12。因此，建立一种可重复且可靠的下颌磨牙拔除方法，对于需要下颌骨特异性牙槽窝愈合模型的研究具有重要意义。

牙齿解剖结构示意图：显示釉质、牙本质和牙骨质；A、B、C 表示不同阶段。
图 1．人类与小鼠牙齿形态的示意图比较。 
（A）成人人类牙齿的示意图。（B）青少年小鼠下颌第一磨牙的示意图。（C）成年小鼠下颌第一磨牙的示意图。这些图示突出了根部形态和牙骨质分布的差异，这些差异有助于增强成年小鼠下颌第一磨牙在牙槽骨中的机械固位力。釉质、牙本质和牙骨质由图例中相应的颜色标示。解剖学特征基于已发表的描述8,9,15。请点击此处查看此图的放大版本。

我们研究团队先前开发的一种小鼠拔牙技术，利用经改造的注射器作为牙挺13。尽管该方法能够成功拔除小鼠右侧下颌第一磨牙，但其对操作技术的精确性要求较高，学习曲线陡峭，需要大量练习才能掌握。操作经验不足者可能无意中损伤邻近的解剖结构。此外，拔除左侧下颌第一磨牙还需额外进行“镜像”训练以达到操作熟练。这些挑战可能影响拔牙窝的完整性，降低动物间愈合结果的一致性，并限制缺乏显微外科经验的研究人员使用该模型。

本方案描述了一种改良的小鼠下颌第一磨牙拔除方法，旨在提高操作的可及性与可重复性。该方案在8周龄雄性C57BL/6小鼠中进行了验证，用于建立下颌第一磨牙牙槽骨保留模型（TSHM）。通过系统比较改良法与传统技术，评估了操作效率、拔牙成功率及与操作相关的并发症。此外，还分析了在方法学习过程中常见的技术失败模式，为建立小鼠下颌TSHM的研究人员提供实用的操作指导。

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方案

所有操作均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2025-188）批准，并按照机构动物护理指南进行。

注意：使用8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重为22–29 g。在标准饲养条件下（21°C–24°C，湿度40%–60%，12小时光照-黑暗循环），给予标准饲料并自由饮水。使用材料表中列出的试剂和仪器。为进行比较评估并展示失败案例，需使用24只小鼠。在开展比较实验前，另需使用额外小鼠进行操作者培训。

1. 术前准备

  1. 仪器准备
    1. 准备25 G注射器针头用作挺子（可选）。将每根针头的斜面尖端弯曲至约20°–40°13。
    2. 准备带齿眼科镊子用作牙科钳。在放大镜下检查带齿尖端，确认齿部对齐且无变形。
    3. 使用一根橡皮筋和四根25 G注射器针头组装口腔牵开器。准备泡沫板或纸板作为手术平台，用于固定小鼠四肢的胶带，以及用于照亮手术区域的头灯。
    4. 准备加热垫用于术后恢复，并在手术前将其预热至约38°C。准备棉球用于止血，以及适量生理盐水用于清洁口腔。
    5. 准备指套覆盖拇指，以在拔牙过程中保护操作者。
    6. 在手术表面和加热垫上覆盖无菌非织造布，以维持无菌环境。
  2. 麻醉准备
    1. 使用浸有聚维酮-碘消毒液的棉球对小鼠腹部进行消毒。按50 mg/kg剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠14。通过夹趾试验评估麻醉深度，并根据需要追加麻醉药物。
      注意：若夹趾反射恢复或操作接近预期麻醉持续时间，应暂停操作，并根据机构批准的兽医方案追加麻醉药物。
    2. 麻醉后立即在双眼涂抹兽用眼科软膏，以防止角膜干燥。
  3. 消毒与灭菌准备
    1. 使用75%乙醇对手术平台、加热垫、胶带、指套及周围工作区域进行消毒。每只小鼠均应使用新的无菌棉签、非织造布、橡皮筋和针头。使用机构标准的蒸汽灭菌程序对带齿镊子和生理盐水进行灭菌。
      警告：75%乙醇易燃。应在通风良好、远离热源、火花、明火及其他点火源的区域使用。佩戴适当的个人防护装备。乙醇处理过的器械和表面必须完全干燥后方可开始操作。
    2. 操作前执行手部卫生。穿戴清洁的手术服、无菌手术帽、外科口罩和无菌手套。

2. 手术过程

  1. 小鼠的固定与清洁
    1. 将小鼠仰卧位放置于固定板上，用胶带固定四肢。在眶耳平面水平的泡沫板上插入两根25 G针头，并在下颌下方再插入两根25 G针头。
    2. 将橡皮筋套在针头上并跨过门齿，以保持口腔张开。轻柔地牵拉舌头并将其置于与拔牙侧相对的一侧，以防止手术视野受阻。本方案中以右侧下颌第一磨牙作为代表性示例。
    3. 使用生理盐水浸湿的小棉球清除口腔内的食物残渣及其他异物。
      注意：需彻底挤干棉球中的多余生理盐水，防止液体流入口腔导致窒息。
  2. 消除远中和近中阻力（可选步骤）
    1. 用左手持镊子牵拉右侧口角，充分暴露右侧下颌第一磨牙及其周围颊侧和舌侧软组织。
    2. 右手持镊子，左手持一根25 G针头，小心地将针头插入邻近远中根的颊侧牙周膜，以形成牙周膜间隙。
    3. 缓慢将针头向根尖方向推进，同时向近中和舌侧旋转，以松动牙齿根部与牙槽窝之间的连接。
    4. 从颊侧将一根25 G针头插入根分叉处，并用左手向上（咬合方向）撬动；同时用右手将另一根25 G针头插入邻近近中根的舌侧牙周膜，建立牙周膜间隙后，再将针头向远中和颊侧旋转。
    5. 完成牙周膜预松解后，将两根针头均从手术区域撤出。
      注意：仅当使用镊子初步摆动后牙齿仍活动度极小且存在明显阻力时，才进行牙周膜预松解操作。
  3. 摆动与拔除
    1. 用左手的食指和中指固定小鼠头部。右手持镊子的同时，将戴有指套的拇指抵住下颌门齿提供支撑。
    2. 使镊子尖端垂直于咬合平面，并与牙齿长轴平行。将带齿的镊尖置于根分叉内，以获得稳定的牵引力。
      注意：切勿直接用镊子夹持牙根，以免导致牙根折断。
    3. 用镊子夹住牙冠，施加轻柔的颊舌向摆动动作。限制颊侧摆动角度为30°，舌侧摆动角度为50°。每1–1.5秒完成一次摆动动作。
    4. 在沿磨牙长轴从根尖向牙冠方向持续施加牵引力的同时，用左手拇指指腹稳定地抵住下颌门齿以提供反向支撑，从而固定下颌骨。
      注意：应保持连续而稳定的反向支撑，避免对门齿及邻近软组织造成过度压迫或移位。
    5. 持续进行摆动操作，直至牙齿逐渐松动且咬合面明显高于邻近磨牙。在整个过程中保持镊子尖端与牙齿长轴平行，待达到足够松动度后即可拔除牙齿。
      注意：在施加最终拔除力之前，应通过轻柔地在颊舌方向摆动牙冠来评估牙齿松动度。仅当牙冠可轻易移动、阻力极小且颊舌向摆动幅度达到约半个牙冠宽度时，方可进行拔除。在完全拔除前应立即重新评估麻醉深度，必要时追加麻醉（图2）。

牙齿拔除技术比较、示意图及结果；传统与改良方法及拔除的牙根。
图 2．传统与改良小鼠下颌第一磨牙拔除方法的比较。 
（A）传统拔牙方法的示意图，将一根弯曲的25 G针头插入牙周韧带，并用作杠杆松动牙齿。（B）改良拔牙方法的示意图，使用带齿眼科镊夹住牙冠，并沿牙齿长轴方向施加牵引力。（C）用作牙挺的弯曲25 G针头尖端的代表性图像。（D）用作微型拔牙钳的带齿眼科镊的代表性图像。（E）下颌第一磨牙拔除后即刻的术中图像；虚线轮廓表示拔牙窝。（F）成功拔除的下颌第一磨牙的颊侧观。（G）同一颗拔除下颌第一磨牙的舌侧观。比例尺 = 2 mm（C，D）和 400 µm（E–G）。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 检查拔除的牙齿及拔牙窝

  1. 检查拔除的牙齿，确认其完整移除且结构完整。确认牙根形态得以保留，具有较长的近中根、较短的远中根以及根尖扩大15。核实拔除的牙齿上无残留的牙槽骨碎片。
  2. 检查拔牙窝，确认其清洁且无残留牙根碎片（图2）。
    注意：若在拔牙过程中怀疑存在残留或折断的牙根，应避免反复操作，因为过度尝试可能会加重牙槽窝缺损。在放大条件下检查拔牙部位，以确认是否存在残留牙根碎片。将存在残留或折断牙根的情况记录为拔牙失败，并从后续模型评估中排除。按照批准的动物实验方案处理这些动物。

4. 术后护理

  1. 使用干棉球实现止血。用少量浸有生理盐水的棉球清洁口腔，然后复位舌头。
    注意：棉球仅需用最少体积的无菌生理盐水润湿其表面，避免产生游离液体。
  2. 术后给予卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射）以进行术后镇痛。
  3. 将动物置于加热垫上，并持续监测直至其恢复意识。
  4. 麻醉恢复后，在笼底提供软化标准饲料或凝胶饮食共 3 天，自由饮水。确认动物恢复正常摄食行为后，恢复标准饲料喂养。
  5. 在预设时间点监测摄食量、体重、活动情况、理毛行为、面部肿胀、口腔出血以及疼痛或痛苦的迹象。

5. 操作人员培训

  1. 将两名无小鼠硬组织再生模型操作经验的操作者随机分配至传统拔牙组或改良拔牙组。在同一名精通传统与改良拔牙技术的指导者监督下，对两名操作者分别进行独立培训。
  2. 在第一周培训中，指导每位操作者在小鼠尸体上练习所分配的拔牙操作，以熟悉手术流程。
  3. 在第二周培训中，监督操作者在活体小鼠上进行操作，以评估并优化每种技术的实际应用效果。监测每次操作过程，确保麻醉充分，并防止发生意外手术并发症，包括因器械操作不当导致周围软组织损伤或牙槽结构受损。当操作者能够独立完成连续三次成功的拔牙操作时，确认其具备操作能力。完成监督培训后，进入对比性拔牙实验阶段。

6. 样品制备

  1. 采用颈椎脱位法处死小鼠。从头部解剖下下颌骨，并去除附着的软组织。
  2. 将下颌骨置于4%多聚甲醛溶液中固定48小时。在进行µCT扫描前，将样本保存在PBS中。

7. µCT 及分析

  1. 使用 µCT 扫描仪扫描下颌骨。将扫描参数设置为 80 kV、500 µA、10 µm 体素分辨率，并进行逐层扫描。
  2. 使用羟基磷灰石体模对 µCT 系统进行校准。扫描体模，并使用 DataViewer 导出重建图像。
    1. 使用 CTAn 分析体模图像。通过将体模插入物测得的 CT 衰减值与其已知的矿物密度相关联，建立校准曲线，以将衰减值转换为骨密度（BMD）。
    2. 对所有样本采用相同的扫描和重建参数。
    3. 使用与 µCT 系统配套的标准重建流程在 CTAn 中重建所有数据集。对所有样本应用相同的重建设置、感兴趣区域（ROI）定义和定量分析标准。使用 Mimics Research 单独进行三维重建以实现代表性可视化，其 ROI 定义与 CTAn 定量分析中所用的一致。
  3. 通过选择拔除的下颌第一磨牙的远端牙根区域来定义感兴趣区域（ROI）。从邻近第二磨牙的釉牙骨质界开始，向根尖方向连续采集 100 个横断面切片。
    1. 在每个切片中手动沿拔牙窝周围新形成的牙槽骨边界勾画 ROI。使用 CTAn 对所有样本采用相同的分析参数进行后续图像处理和定量分析。
  4. 使用 Mimics Research 进行三维重建。计算根折和牙槽窝壁缺损的发生率，即出现每种情况的下颌样本数占总下颌样本数的比例。
  5. 使用 GraphPad Prism v10.1.2 进行所有统计分析并生成图表。使用 Shapiro–Wilk 检验评估连续变量的正态性。
    1. 将每只小鼠及其对应的拔牙窝定义为所有分析的实验单位。
    2. 采用未配对双尾 Student’s t 检验比较各组之间的拔牙时间、BMD 和骨体积/总体积（BV/TV）。采用 Fisher 精确检验比较根折和牙槽窝壁缺损的发生率。
    3. 统计显著性表示如下：*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001。使用“ns”表示两组之间无统计学显著差异。

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结果

与下颌第一磨牙拔除相关的解剖特征如图1所示，传统与改良拔牙方法的示意图见图2A、B。制备好的针头和带齿眼科镊子、新鲜拔牙窝以及拔下的下颌第一磨牙的代表性图像见图2C–G。完整的操作流程总结于图3。为比较两种方法在操作效率和一致性方面的差异，两名在小鼠操作经验上相当的研究人员被随机分配，分别采用传统或改良方法进行下颌第一磨牙拔除。所有实验小鼠均为8周龄雄性C57BL/6小鼠。拔牙时间及操作相关并发症在拔牙后立即记录，而拔牙窝则在愈合2周后通过µCT进行评估。拔牙时间在操作过程中记录，因此无法进行盲法评估；而拔除的牙齿和µCT数据集在评估前进行编码，以确保评估者对所采用的拔牙方法保持盲态。

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讨论

成功建立TSHM需要在保留周围牙槽骨结构的同时完全拔除牙齿，因为拔牙相关的损伤可能会影响后续的骨再生16。因此，拔牙操作的可重复性是模型可靠性的一个关键决定因素17。在本研究中，在标准化培训条件下，系统比较了一种改良的钳夹式下颌第一磨牙拔除法与传统的杠杆式技术。改良方法在操作效率和可重复性方面表现更优，表现为显著缩短的拔牙时间以及更少的拔牙相关并发症。具体而言，在相同的两周培训期后，采用传统方法的平均拔牙时间为29分钟，而采用改良方法则缩短至10分钟。此外，在改良组中未观察到牙槽窝壁缺损，而该并发症在传统组中频繁出现。尽管两组间牙根折断的发生率无显著差异，但改良方法所观察到的较低发生频率提示在当前实验条件下操作的一致性更佳。此外，拔牙窝结构的更好保留与两周后的早期骨愈合增强相关。综上所述，这些结果表明，改良技术可能在模型建立过程中减少操作者依赖的变异性。

直接检查拔除的牙齿及牙槽窝足以常规识别明显的牙根折断和主要的牙槽窝缺损。在本项对比研究中，微计算机断层扫描（µCT）被用作客观验证工具...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82571084）和四川省科技计划项目（项目编号：2024JDKXJ0001）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25 G 注射器针头BeyotimeFS802-30pcs用于口腔牵开器及可选的牙周膜预松解的一次性注射器针头
4% 多聚甲醛溶液SolarbioP1110用于标本固定的 4% 多聚甲醛溶液
75% 乙醇Ouse Medical Devices StoreN/A用于表面消毒的 75% 医用级乙醇
C57BL/6 小鼠Charles River2138 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，体重 22–29 g
卡洛芬SolarbioC5350术后镇痛药，皮下注射，剂量为 5 mg/kg
棉球Ouning Medical DevicesN/A用于口腔清洁和止血的无菌棉球
CTAn v1.18.4.0+SkyScanN/A用于 μCT 图像分析的软件
DataViewer v1.5.6.2SkyScanN/A用于查看和导出重建的 μCT 图像的软件
指套LeSu OfficeMEKU-1/2/3B拔牙过程中用于保护拇指的指套
泡沫板东莞利江龙工业有限公司N/A用作手术操作和固定平台的泡沫板
凝胶饲料ReadyDietechJ10001术后使用时，在笼底提供 3 天的凝胶饲料
GraphPad Prism v10.1.2GraphPadRRID: SCR_002798用于统计分析和图表生成的软件
头灯霸州鹏恩防护设备厂N/A用于照亮手术区域的头灯
加热垫石家庄佳暖电器有限公司N/A预热至约 38 °C 的加热垫，用于术后恢复
羟基磷灰石体模QRMQRM-70127用于将 CT 衰减值转换为骨密度的校准体模
放大装置奥林巴斯公司SZX10用于在放大条件下检查带齿镊尖端和拔牙窝的装置
口罩森伦医疗器械专营店N/A外科口罩
微型计算机断层扫描仪Bruker SkyScanSkyScan 1276μCT 扫描仪，工作参数为 80 kV、500 μA 和 10 μm 体素分辨率
Mimics Research v21.0MaterialiseRRID: SCR_015802用于三维重建的软件
戊巴比妥钠Sigma-AldrichP3761用作 1% 麻醉溶液的戊巴比妥钠盐
磷酸盐缓冲液SolarbioP10100.01 M 磷酸盐缓冲液粉末，pH 7.2–7.4
聚维酮碘消毒液Belkon 药房旗舰店N/A用于腹部消毒的聚维酮碘溶液
橡胶圈佛山普力橡胶制品厂N/A用于组装口腔牵开器的橡胶圈
生理盐水溶液Thermo FisherBR0053G用于配制口腔清洁溶液的生理盐水片剂
标准颗粒饲料江苏协通医药生物科技工程有限公司XTC01WC-001用于常规饲养及术后软化后喂食的标准颗粒饲料
蒸汽灭菌器机构设施N/A用于灭菌带齿镊和生理盐水溶液的设备
无菌棉签康百来医疗器械店N/A一次性无菌棉签
无菌手套森伦医疗器械专营店N/A无菌乳胶手套
无菌无纺布山东新华感控用品杭州店N/A用于覆盖操作表面和加热垫的无菌无纺布
无菌手术帽森伦医疗器械专营店N/A无菌手术帽
手术服森伦医疗器械专营店N/A操作过程中穿着的清洁手术服
胶带Thermo Fisher15947用于固定小鼠四肢的粘性胶带
带齿眼科镊BeyotimeFS229用作牙科镊的带齿眼科镊
兽用眼科软膏德克拉兽药产品143-16麻醉后涂抹以防止角膜干燥的眼科软膏

参考文献

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