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载羟基脲纳米结构脂质载体用于增强体外细胞毒性和药物递送

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DOI：

10.3791/73012

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2026年9月22日

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1Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Jazan University, 2School of Health Sciences, University of Petroleum and Energy Studies, 3Center for Global Health Research, Saveetha Medical College, and Hospitals, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, Saveetha University

本文内容

摘要

本研究开发了载有羟基脲的纳米结构脂质载体（NLCs），并评估了其性质及体外抗肿瘤活性。NX-ST表现出较高的包封效率、可控释放特性，以及对MCF-7细胞更强的细胞毒性（IC₅₀ = 225 µg/mL），优于游离羟基脲（IC₅₀ = 722.57 µg/mL）。

摘要

羟基脲（HU）是一种用于治疗慢性粒细胞白血病的成熟抗癌药物，但其治疗效果受到快速清除、生物利用度不稳定以及剂量相关毒性的限制。本研究旨在通过采用不同表面活性剂组合制备载药羟基脲的纳米结构脂质载体（NLCs），以改善HU的递送效果。共制备了三种配方，分别为NX-ST（吐温80-十二烷基硫酸钠）、NX-CT（克列莫佛EL-吐温80）和NX-CS（克列莫佛EL-十二烷基硫酸钠），并对它们的粒径、多分散指数（PDI）、zeta电位、包封率（EE）及细胞毒性活性进行了评估。这些配方表现出纳米级粒径（67.377 至 110 nm）、可接受的PDI（<0.35）、较高的zeta电位（-30.033 至 -46.433 mV）以及良好的包封效率（78.189% 至 86.626%），表明其具有良好的制剂稳定性。药物释放曲线显示在0.5–6小时期间呈近似线性增长，随后趋于平稳。细胞毒性研究表明，与游离HU相比（IC₅₀ = 722.57 µg/mL），各配方的抗癌活性有所增强。其中，NX-ST配方表现出最高的细胞毒性（IC₅₀ = 225 ± 21.47 µg/mL），这与药物递送效率的提升一致；研究推断其效果可能源于细胞摄取的改善，但本研究未直接测定细胞摄取情况。所研究的NLC配方，尤其是NX-ST，通过提高稳定性、递送效率和抗癌活性，显著增强了HU的治疗性能。

引言

癌症仍然是全球主要的死亡原因之一，2022年记录了近2000万例新发病例和970万例癌症相关死亡。预计到2040年，这些数字将显著上升，每年新增病例将达到2990万例，癌症相关死亡将达到1530万例1,2。目前大多数抗癌药物治疗方案依赖于高毒性化合物，但其系统性毒性限制了能够有效到达癌组织的治疗浓度3。为克服这一挑战，研究人员一直在探索新型药物递送方法，以增强对肿瘤的靶向性，并提高化疗的治疗指数。

肿瘤学研究的一个关键领域是开发先进的药物递送系统，以提高抗癌药物的治疗效果，同时尽量减少其副作用。羟基脲（HU）是一种成熟的化疗和抗肿瘤药物，因其能够增加胎儿血红蛋白的生成并靶向抑制核糖核苷酸还原酶从而阻断DNA合成，已成为治疗镰状细胞病、慢性粒细胞白血病以及某些实体瘤的重要手段4,5。尽管羟基脲具有明确的临床疗效，但其治疗潜力仍受到快速清除、生物利用度不稳定以及治疗窗狭窄等挑战的限制，常导致药代动力学差异以及剂量依赖性毒性，包括骨髓抑制、胃肠道紊乱和潜在的继发性恶性肿瘤6,7。为克服这些局限性，包括纳米结构脂质载体（NLCs）在内的先进药物递送系统已成为提升羟基脲稳定性、溶解性和可控释放性能的有前景策略，从而改善其安全性和疗效特征8。

NLC 是一种基于脂质的纳米颗粒，相较于传统药物递送系统具有多项优势。它由表面活性剂稳定的固态脂质基质构成，可包载亲水性和亲脂性药物。这种独特结构可提高药物载药量、实现可控释放并增强稳定性9,10。NLC 的制备通常采用高压均质和超声处理等技术，有助于形成粒径分布窄、包封效率高的纳米颗粒11,12。将药物包封于 NLC 中不仅可提高其溶解度和稳定性，还能促进药物向癌细胞的靶向递送，从而减少脱靶效应。近期研究已表明，载药 NLC 可改善药物的治疗指数和缓释特性13,9。这种可控释放机制对于在较长时间内维持治疗性药物浓度至关重要，可减少给药频率并提高患者依从性14。研究表明，负载吉非替尼15、卡培他滨16和伊马替尼14等抗癌药物的 NLC 可通过增强药物在癌细胞中的摄取和蓄积，显著提升药效。例如，与游离药物相比，负载吉非替尼的 NLC 对癌细胞的细胞毒性提高了 4.5 倍，凸显了 NLC 在提升用于治疗非小细胞肺癌和结直肠癌的酪氨酸激酶抑制剂治疗指数方面的潜力。同样，负载卡培他滨的 NLC 可改善药物稳定性与可控释放，这对于维持有效治疗浓度并降低全身毒性至关重要。负载伊马替尼的 NLC 也因靶向递送能力增强，减少了脱靶效应，从而改善慢性髓系白血病患者的治疗效果。这些特性使 NLC 成为开展临床试验以及在个体化医疗中根据患者个体特征定制治疗方案的有力候选者。载药 NLC 的稳定性评价是影响其临床应用的另一重要方面。稳定性研究通常需将制剂置于不同环境条件下，以评估其随时间推移的物理完整性。

加速稳定性试验表明，这些NLC在较长时间内能够保持其结构完整性和药物含量，凸显了其在长期储存和使用方面的潜力4,17.

尽管具有上述优势，表面活性剂的选择会显著影响纳米结构脂质载体（NLCs）的理化性质和性能。脂质-表面活性剂体系在提高纳米颗粒的稳定性、药物包封率和生物利用度方面发挥着重要作用18,19,20。然而，目前关于不同表面活性剂组合如何影响载羟基脲NLCs的理化特性和细胞毒性的研究仍较为有限。因此，本研究旨在采用不同的表面活性剂体系制备载羟基脲NLCs（NANOXURIA），并系统评估这些变化对理化稳定性、储存行为及抗肿瘤活性的影响。通过建立处方设计与治疗性能之间的明确关系，本研究致力于提供一种基于纳米载体的高效分散体系（胶体分散体系），用于表征载羟基脲NLC制剂，并评估其体外药物释放、细胞毒性及短期储存稳定性，从而生成基础性的理化和体外性能数据，为未来羟基脲递送系统的开发提供依据，同时不改变药物分子本身。

方案

本研究未涉及人类受试者、人类来源组织或活体动物。所有生物学评价均在体外进行，使用的是从美国模式培养物集存库（ATCC）获得的商用MCF-7人乳腺癌细胞系。因此，本研究无需机构审查委员会（IRB）或伦理委员会批准。

材料

实验所用羟基脲（HU）（纯度≥99%）、十二烷基硫酸钠（SDS）（阴离子型，纯度90%）、Tween-80（T80）（非离子型，油酸含量≥58%）、Cremophor EL（非离子型，来源于蓖麻油，纯度≥98%）、硬脂酸（纯度95–106%）和芝麻油均直接使用，未进一步纯化。其他所有化学品和试剂均为分析纯。所有材料和仪器的完整供应商信息及目录号详见材料表。

羟基脲负载型NLC的制备（NANOXURIA）

NANOXURIA 的制备包括三个步骤，即脂质相的制备、药物的加入以及水相的制备。脂质相是通过将硬脂酸（500 mg）与芝麻油（250 µl）混合并加热熔融获得的。该熔融过程在置于加热板上的烧杯中进行。精确称量的羟基脲（HU）（150 mg）被加入至脂质相中并混合。水相是通过将表面活性剂（表 1）溶解于水（Millipore 水）（25 mL）中制备而成。将表面活性剂溶液加热至与脂质相相同的温度（70°C），以防止过早固化。在高速搅拌条件下，将热的水相逐步加入熔融的脂质相中。混合物在高速（6,000 rpm）下均质化 20 分钟，以形成稳定的热乳剂。在持续搅拌下将热乳剂冷却至室温。冷却过程中，脂质相固化，从而形成纳米结构脂质载体（NLCs）。所制备的载药羟基脲（HU）NLCs 被储存以用于后续表征与应用。

表征与评估

粒径、zeta电位（ZP）和多分散系数（PDI）

采用Zetasizer Nano ZS90对NANOXURIA的粒径分布及多分散系数（PDI）进行分析。该仪器基于动态光散射（DLS）原理，通过测量悬浮液中颗粒的布朗运动，并利用斯托克斯-爱因斯坦方程将其与流体动力学直径相关联。除粒径和PDI外，还使用同一仪器通过测定Zeta电位（ZP）来评估NANOXURIA的表面电荷。Zeta电位采用电泳光散射（ELS）法测定，该方法通过分析颗粒在施加电场中的迁移速度来计算其表面电荷。该参数对于评价NANOXURIA的胶体稳定性至关重要。所有测量均在受控环境中进行，将稀释后的样品置于比色皿中，以确保满足仪器的光学和电学要求。为提高结果的可靠性和可重复性，所有测量均设置三次重复。

形态学

采用透射和扫描两种模式的电子显微镜对NANOXURIA的形态进行了研究。透射电子显微镜（TEM）用于观察内部结构和颗粒形状，而场发射扫描电子显微镜 采用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察表面形貌和颗粒分布。样品经适当制备后，在合适的加速电压下进行分析，以获得高分辨率图像。样品制备过程中，将NANOXURIA分散液用纯化水稀释；透射电子显微镜（TEM）观察时，取一滴稀释后的分散液置于碳支持膜铜网上，吸去多余液体，室温下自然风干成膜，随后在高真空条件下、加速电压为60–80 kV时进行成像。FE-SEM观察时，取一滴稀释后的分散液滴于铝质样品台，风干后溅射镀上一层薄导电层，再在1–3 kV加速电压下成像。在不同放大倍数下采集代表性显微图像。

NANOXURIA 制剂包封率分析

采用超滤-离心法，使用 Amicon Ultra-2 mL 离心过滤器（3 kDa 截留分子量）评估 NANOXURIA 的包封率（EE）。该方法通过在 25 °C 下以 4,000 × g 离心 20 分钟，将未包封的羟基脲（HU）（约 6 mg 溶于 1 mL NANOXURIA 中）与包封组分分离，从而实现有效分离。含有游离 HU 的滤液用纯化水稀释后，在 213 nm 波长下使用紫外-可见分光光度计进行分析，依据比尔-朗伯定律建立标准曲线以定量未包封药物。包封率（% EE）按如下公式计算：

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体外释放研究

采用透析袋扩散法评估了NANOXURIA中羟基脲（HU）的体外释放曲线，该方法是评价药物控释行为的常用技术。将透析袋（截留分子量12–14 kDa）在蒸馏水中预浸泡12小时，以确保充分水化并去除防腐剂。将透析袋一端牢固封闭，然后小心加入2 mL相当于12 mg HU的NANOXURIA制剂。另一端紧密打结，防止泄漏。将透析袋浸入盛有50 mL水作为释放介质的烧杯中。实验体系保持在37 ± 0.5 °C以模拟体温，并使用磁力搅拌器以50 rpm的速度搅拌，确保介质均匀混合并减少边界层效应。在预定的时间点（0.5、1、2、4、6、12和24小时），从释放介质中取出2 mL样品，并立即补充等体积新鲜预热的水，以维持沉降条件。收集的样品通过0.45 µm的一次性注射器滤器过滤，以去除任何微粒物质，确保分析时溶液澄清。膜滤器可截留微粒，而允许溶解的HU通过。由于HU具有良好的水溶性，游离药物保留在滤液中，从而确保滤器截留物代表的是微粒而非游离药物。过滤后的样品使用紫外-可见分光光度计在213 nm波长处测定HU含量，该波长对应于HU的最大吸收峰（λmax）。通过建立标准曲线以准确定量HU的浓度。

细胞培养

本研究采用购自美国模式培养物集存库（ATCC）的转移性人乳腺癌细胞系 MCF-7。细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）以支持细胞生长和存活，以及1%青霉素-链霉素溶液以防止培养过程中微生物污染的 RPMI 1640 培养基中。细胞随后在37 °C、加湿的 CO₂ 培养箱中孵育，培养基 pH 值维持在7.4。选择这些条件旨在确保细胞毒性研究期间细胞的最佳生长、增殖及实验结果的可靠性。

细胞活力检测（MTT法）

采用MTT法评估不同NANOXURIA制剂诱导细胞死亡的能力16,21。简言之，将MCF-7细胞以1 × 104个细胞/mL的密度接种于96孔板中，在CO₂培养箱中孵育24小时，以确保细胞充分贴壁和生长。未处理的细胞作为阴性对照，仅含培养基的孔作为空白对照。孵育后，弃去原培养基，更换为含不同浓度待测制剂的新鲜培养基，最高浓度达200 µg/mL。处理后的培养板在标准培养条件下继续孵育72小时。处理结束后，每孔加入20 µL MTT试剂（5 mg/mL），再孵育4小时，使代谢活跃的细胞内形成甲臜结晶。随后加入100 µL二甲基亚砜（DMSO）以溶解结晶，形成紫色溶液。使用酶标仪（SpectroStar Nano）在570 nm波长处测定吸光度。根据所测得的吸光度值，以未处理对照组为基准计算细胞活力（%）。

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稳定性研究

在受控的储存条件下，对NANOXURIA的稳定性进行了为期3个月的系统性评估，以评价其长期使用的适用性。每种NANOXURIA制剂均分装至密封的琥珀色玻璃容器中，以最大限度减少光照和湿气暴露。容器分别储存在25 ± 2 °C的恒定室温条件以及4 ± 2 °C的冷藏条件下。在预设的时间点（1、2和3个月）定期取样，评估其物理和理化稳定性。在制剂制备完成后立即进行基线测量，并将其作为0个月（初始状态）的数据。物理稳定性评估包括目视检查外观变化，如是否出现团聚、沉淀、相分离、颜色改变（例如由微白色变为黄色）、稠度变化（如黏度或质地）以及气味变化（例如因脂质氧化导致的酸败味）。对于理化稳定性，检测了关键的表征参数，包括粒径、多分散指数（PDI）和泽塔电位（ZP）。

统计学分析

本研究中，所有实验结果均以均值±标准差（SD）（n = 3）表示，以反映数据的集中趋势和变异性。采用配对t检验对制剂进行评估，并采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验来比较不同制剂间的差异。当p值＜0.05时，认为差异具有统计学显著性。统计分析使用GraphPad Prism 10版本完成。

结果

理化性质

NANOXURIA 制剂的理化性质，包括粒径、多分散指数（PDI）、zeta 电位（ZP）、形态和包封率（EE），如表 2所示。通过透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）进行的形态学评估，结合粒径分布和zeta电位分布图，见图 1、图 2 和图 3。不同表面活性剂组合的PDI比较见图 4。

释放研究

NANOXURIA 制剂的体外释放研究旨在评估不同制剂在24 h内对药物释放曲线的影响（图5）。NX-CS 的释放速度最快，0.5 小时时达到 55.90%，24 小时时达到 104.05%（数值 >100% 可能反映了实验变异性或完全释放伴随轻微高估。释放曲线在 0.5 至 6 小时内呈近似线性增长，随后趋于平稳。NX-CT 表现出最缓慢且最可控的释放，0.5 小时时为 46.18%，24 小时时达到 82.99%，在 2–12 小时期间出现平台期（54.51% 至 59.38%），之后再次上升。NX-ST 表现出中等释放曲线，0.5 小时时为 54.05%，12 小时时达到峰值 90.63%，24 小时时略微下降至 86.23%。总体而言，累积释放顺序为：NX-CS > NX-ST > NX-CT。NX-CS和NX-ST表现出更强的初始突释效应，而NX-CT则呈现延迟释放。释放动力学显示，NX-CS为快速释放，NX-CT为持续释放，NX-ST为双相释放。

细胞毒性检测

的 体外 细胞毒性 NANOXURIA 采用 MTT 法评估了各制剂对 MCF-7 乳腺癌细胞的作用， 表3 详细说明 IC₅₀ 值。NX-ST 表现出最高的细胞毒性，其估计的 IC₅₀ 225 的 ± 21.47 µg/mL （外推值），表明其具有更强的抗癌活性。相比之下，NX-CS 和 NX-CT 表现出较低的细胞毒性，其 IC₅₀ 超出的数值 300 µg/mL游离羟基脲（HU）的细胞毒性最低，其IC₅₀ 的 722.57 µg/mL. 由于IC₅₀ NX-CS 和 NX-CT 的数值仅报告为超出 300 µg/mL，它们彼此之间的细胞毒性以及相对于游离 HU 的细胞毒性722.57 µg/mL) 无法根据现有数据确定；只有 NX-ST 可明确被判定为比游离 HU 具有更高的细胞毒性。这些结果表明，与游离药物相比，NLC 制剂显著增强了 HU 的抗癌活性。

理化参数与细胞毒性的统计学相关性

所有研究参数均相互关联，如图6所示。统计分析显示，HU负载的NLCs（NX-ST、NX-CT、NX-CS）在zeta电位、包封率（EE）和细胞毒性（IC₅₀）方面存在显著差异[F(2,12) = 6.45，p = 0.014]，但在粒径或PDI方面无显著差异[F(2,12) = 1.27，p = 0.31]。NX-ST表现出最佳的细胞毒性，同时具有中等水平的包封率，而NX-CS和NX-CT虽具有更高的包封率，但细胞毒性较弱。对于IC50值超过测试浓度范围上限（>300 µg/mL）的情况，在探索性相关性分析中统一赋值为300 µg/mL。探索性Spearman相关性分析显示zeta电位与IC₅₀之间呈正相关（ρ = 0.866，p = 0.333）。因此，zeta电位负值较小的制剂倾向于表现出更高的IC₅₀值，而带更强负电荷的NX-ST制剂则表现出更强的细胞毒活性。

稳定性研究

粒径稳定性

在 25 °C 条件下，所有 NANOXURIA 制剂的粒径在为期三个月的储存期间均有所增加，并呈现出不同的变化趋势（图 7）。NX-ST 初始粒径为 110 nm（1 个月），在前两个月内保持相对稳定（106.4 nm），但在第三个月增至 150.6 nm。NX-CT 初始粒径为 91.9 nm，在两个月内逐渐增加至 102.2 nm，第三个月时急剧上升至 168.3 nm。NX-CS 的变化最为显著，粒径从最初的 67.3 nm 增加至第三个月的 171.06 nm。总体而言，所有制剂在 25 °C 下均表现出粒径增长，增长幅度顺序为：NX-CS > NX-CT > NX-ST。

在4 °C条件下，NANOXURIA制剂相较于25 °C表现出更优的稳定性，在三个月的储存期间粒径增长较小（图7）。NX-ST保持了相对稳定的粒径，储存一个月时为110 nm，两个月时为102 nm，三个月时为120.96 nm。NX-CT的粒径随时间逐渐增加，从一个月时的91.9 nm增至两个月时的116.7 nm，三个月时达到128.5 nm。NX-CS的粒径变化最小，初始为67.3 nm，两个月时为74.75 nm，三个月时为89.3 nm。总体而言，在4 °C下粒径增长趋势为：NX-CT > NX-ST > NX-CS，表明在冷藏条件下稳定性更佳。

PDI 稳定性

在25 °C条件下，NANOXURIA制剂的PDI在为期三个月的储存期间表现出不同的趋势（图8）。NX-ST在整个研究期间保持了相对稳定的PDI值，表明其粒径分布一致。NX-CT在第二个月PDI升高至0.342，随后在第三个月下降至0.248。NX-CS的PDI随时间推移持续升高，表明其粒径均一性逐渐下降。总体而言，NX-ST表现出最稳定的分布，NX-CT呈现短暂的波动性，而NX-CS则表现出逐渐增加的异质性。

在4 °C下，NANOXURIA制剂的PDI在三个月的储存期间表现出不同的变化趋势（图8）。NX-ST的PDI值相对稳定，第一个月为0.347，第二个月下降至0.269，第三个月略有上升至0.349。NX-CT的PDI从第一个月的0.221逐步增加至第三个月的0.331，表明颗粒均匀性逐渐下降。NX-CS的PDI也随时间呈上升趋势，表明其均一性降低。总体而言，NX-ST保持了最稳定的粒径分布，而NX-CT和NX-CS则表现出逐渐增加的异质性。

Zeta 电位稳定性

在25 °C条件下，NANOXURIA制剂的zeta电位（ZP）在三个月的储存期间表现出明显不同的趋势（图9）。NX-ST在第一个月的初始ZP为−46.43 mV，第二个月下降至−39.37 mV，第三个月回升至−52.33 mV。NX-CT的负值呈逐渐增强趋势，从第一个月的−30.76 mV增至第二个月的−35.66 mV，第三个月达到−37.13 mV。NX-CS的ZP负值从初始的−30.03 mV增加至第二个月的−39.6 mV，第三个月达到−52.47 mV。总体而言，所有制剂的ZP值随时间推移均呈下降趋势，其中NX-ST和NX-CS的绝对值变化幅度大于NX-CT。

在4 °C条件下，NANOXURIA制剂的Zeta电位（ZP）在三个月的储存期间表现出不同的变化趋势（图9）。NX-ST在整个研究期间始终保持较高的负Zeta电位值。NX-CT的Zeta电位负值逐渐增加，起始值为−30.76 mV，到第三个月时负值略有增强。NX-CS的Zeta电位负值则略有下降，从最初的−30.03 mV降至三个月后的−28.8 mV。

数据可用性：

支持本研究结果的数据可在文章内获取。本研究期间生成和分析的原始数据集可在补充文件中获取

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图1NX-ST的形态学与理化表征 (A) 扫描电子显微镜（SEM）图像。B) 透射电子显微镜（TEM）图像。 (C) 粒径分布（108.3 nm；PDI = 0.336）（n = 1）。 (D) Zeta电位分布（−48.8 mV）（n = 1）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图2：NX-CT的形态学及理化表征。（A） 扫描电镜图像。 （B） 透射电镜图像。 （C）粒径分布（91.87 nm；PDI = 0.235）（n = 1）。 （D） Zeta电位分布（−31.3 mV）（n = 1）。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3NX-CS的形态学与理化表征 (A扫描电镜图像。 (B) 透射电子显微镜图像。 (C) 粒径分布（74.72 nm；PDI = 0.244）（n = 1）。 (D) Zeta电位分布（−36.8 mV）（n = 1）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图4：不同表面活性剂组合的NANOXURIA制剂之间的PDI比较。 显示了NX-ST、NX-CT和NX-CS制剂的PDI值。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：NANOXURIA 制剂体外羟基脲释放情况。显示 NX-CS、NX-CT 和 NX-ST 在 24 小时内的累积羟基脲释放量。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：NANOXURIA不同制剂在理化参数与细胞毒性方面的比较。 雷达图比较了NX-ST、NX-CS和NX-CT在粒径、PDI、zeta电位（ZP）、包封率（EE）以及IC₅₀方面的表现。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：储存温度和时间对NANOXURIA粒径的影响。（A）在25 °C下储存期间的粒径。（B）在4 °C下储存期间的粒径。（C）在2个月和3个月时，4 °C与25 °C条件下的粒径比较。请点击此处查看该图的放大版本。

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图8：储存温度和时间对NANOXURIA PDI的影响。（A）在25 °C下储存期间的PDI。（B）在4 °C下储存期间的PDI。（C）在2个月和3个月时，4 °C与25 °C之间的PDI比较。请点击此处查看该图的放大版本。

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图9：储存温度和时间对NANOXURIA ζ电位的影响。（A）在25 °C下储存期间的ζ电位。（B）在4 °C下储存期间的ζ电位。（C）在2个月和3个月时，4 °C与25 °C之间的ζ电位比较。请点击此处查看该图的放大版本。

配方吐温-80 (µL)*十二烷基硫酸钠 (SDS) (mg)克雷莫佛 EL (µL)#
NX-ST50100-
NX-CT50-100
NX-CS-50100
密度 (g/ml) = (1.07*, 1.05#)

表1：NANOXURIA制剂的表面活性剂组成。 使用的吐温-80、十二烷基硫酸钠（SDS）和Cremophor EL的量用于制备NX-ST、NX-CT和NX-CS制剂。

配方粒径 (d.nm) (n = 3) (± SD)PDI (n = 3) (± SD)ZP (mV) (n = 3) (± SD) 包封率 (%) (n = 3) (± SD)
NX-ST110 ± 1.9970.347 ± 0.011-46.433 ± 8.40478.189 ± 3.49
NX-CT91.947 ± 0.2150.221 ± 0.015-30.767 ± 0.47384.638 ± 5.0
NX-CS67.377 ± 7.1580.302 ± 0.091-30.033 ± 5.86286.626 ± 4.676

表2：NANOXURIA制剂的理化表征。 NX-ST、NX-CT和NX-CS在25 °C下的粒径、多分散系数（PDI）、zeta电位（ZP）和包封率（EE）。数据以均值±标准差表示（n = 3）。

制剂IC50 (µg/mL)IC50 (µM)
NX-ST225 ± 21.472960
NX-CS>300-
NX-CT>300-
HU722.579500

表3：NANOXURIA制剂与游离羟基脲的体外细胞毒性。 NX-ST、NX-CS、NX-CT及游离羟基脲（HU）对MCF-7细胞的IC₅₀值，以µg/mL和µM表示。

补充文件1：载羟基脲纳米结构脂质载体表征的原始数据与计算结果。 该文件包含NX-ST、NX-CT和NX-CS三种制剂的基础实验数据与计算结果，包括粒径、多分散系数、Zeta电位、包封率、药物释放测定以及制剂间的比较分析。请点击此处下载该文件。

讨论

提出的方法与主要发现

本研究采用热均质法制备了NANOXURIA。以硬脂酸作为固体脂质，制备温度维持在约70 °C，接近硬脂酸的熔点（~69.3 °C），以确保脂质完全熔化并实现高效均质，同时尽量减少HU及表面活性剂不必要的热暴露22。表面活性剂体系的选择依据其亲水-亲油平衡值（HLB）、生物相容性以及适用于纳米结构脂质载体（NLC）制备的特性。通过初步处方试验确定能够形成粒径小、多分散系数（PDI）低且稳定的纳米分散体系的表面活性剂浓度，同时避免浓度过高而对稳定性或细胞相容性产生不利影响。在进行粒径分析前，将制剂用高纯度水适当稀释，以尽量减少多重散射效应，从而避免对粒径及其分布的准确测定造成干扰23。

三种制剂NX-ST、NX-CT和NX-CS主要在表面活性剂组成上有所不同。NX-ST含有T80和SDS，NX-CT含有Cremophor EL和T80，NX-CS含有Cremophor EL和SDS。该制剂策略可评估非离子型和离子型表面活性剂及其浓度对载药NLCs理化特性的影响。结果表明，不同制剂在粒径、PDI、ZP、包封率、药物释放行为及细胞毒性方面均存在显著差异，说明表面活性剂的选择是决定NLC性能的重要因素。

不同制剂间的粒径差异显著（p < 0.05），其大小顺序为 NX-CS < NX-CT < NX-ST。粒径是决定纳米载体性能的重要因素，因为较小的颗粒可能提供更大的表面积，并影响分散稳定性、细胞相互作用、生物分布以及药物释放行为24,25。NX-CS 制备得到的颗粒最小，这可能与 Cremophor EL 的高乳化效率以及十二烷基硫酸钠（SDS）的中等浓度有关。Cremophor EL 可通过降低界面张力促进形成更小的液滴，而 SDS 则有助于实现静电稳定。与 NX-ST 相比，NX-CS 中使用的 SDS 浓度较低，可能在提供足够界面稳定作用的同时，避免了高浓度 SDS 所带来的过度界面效应26,27,28。

NX-CT 产生中等粒径的颗粒。Cremophor EL 与 T80 的组合提供了两种具有互补界面和空间稳定特性的非离子型表面活性剂。Cremophor EL 具有较强的乳化能力，而 T80 可在颗粒周围形成空间位阻屏障，减少颗粒聚集。29,30,31由于不含离子型表面活性剂，因此在颗粒形成过程中避免了强烈的电荷介导相互作用。相比之下，NX-ST 的颗粒尺寸最大。尽管 SDS 是一种强效乳化表面活性剂，但其在 NX-ST 中的相对较高浓度可能改变了界面环境及颗粒生长行为。T80 可提供空间位阻稳定作用，但 T80 与较高浓度 SDS 的联合作用可能在乳化与稳定之间产生了较 NX-CS 更不利的平衡。

形态学研究进一步支持了纳米级脂质载体的形成。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）显示，颗粒主要呈球形至近球形，所观察到的形态与动态光散射（DLS）测定的粒径基本一致。显微镜测量与DLS测量之间的差异是预期之内的，因为SEM观察的是干燥状态下的颗粒，而DLS测量的是颗粒及其相关的水合层和表面活性剂层的流体动力学直径。因此，显微镜与DLS的综合结果支持了纳米结构脂质载体（NLC）系统的成功制备。

PDI 提供了有关颗粒群体均匀性的额外信息。NX-CT 表现出最窄的粒径分布，而 NX-ST 的平均 PDI 最高。NX-CS 的平均 PDI 处于中间水平，但在重复测量之间表现出更大的变异性。特别是，NX-CS 的重复测量值表明，其制剂的变异性高于 NX-ST 和 NX-CT。总体 PDI 趋势为 NX-CT < NX-CS < NX-ST，尽管报告的差异无统计学意义（p > 0.05）。NX-CT 相对较低的 PDI 可能与 Cremophor EL 和 T80 共同提供的空间位阻稳定作用有关。这两种表面活性剂均为非离子型，可在不引入强静电相互作用的情况下稳定颗粒界面。Cremophor EL 有助于乳化，而 T80 提供空间保护，可能促进形成更均一的颗粒群体32,33。NX-ST 较高的 PDI 可能反映了其较高 SDS 浓度的影响。SDS 提供静电排斥作用，但表面活性剂浓度的变化也可能改变胶束化和界面组织结构，从而导致粒径异质性34,35,36。NX-CS 表现出介于中间的 PDI 特征，这与 Cremophor EL 和较低 SDS 浓度的共同作用一致37。

不同制剂的表面电荷也存在差异。NX-ST 的负 Zeta 电位（ZP）最高，这与其中含有较高浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）一致，其次是 NX-CT 和 NX-CS。含 SDS 体系具有更高的负表面电荷是可预期的，因为 SDS 是一种阴离子表面活性剂。因此，ZP 值表明 SDS 对纳米脂质载体（NLCs）的表面电荷贡献显著，而非离子型表面活性剂则主要起到空间稳定作用。ZP 的变化趋势为 NX-ST > NX-CT > NX-CS（p < 0.05）。然而，这些差异不应仅归因于表面活性剂的组成，因为游离表面活性剂残留、离子强度以及脂质-表面活性剂结构的变化也可能影响测得的 ZP38,39,40。

包封率进一步证明了组分对羟基脲（HU）保留的影响。所有制剂均表现出相对较高的包封率（>75%），表明羟基脲成功地被纳入NLC体系中。NX-CS的包封率最高，其次是NX-CT和NX-ST，各制剂之间差异显著（p < 0.05）。Cremophor EL可能有助于实现有效的界面稳定和药物保留，而NX-CS中适中的SDS浓度可能在提供额外稳定性的同时，避免了NX-ST中较高SDS浓度可能带来的破坏作用41,42,43。然而，由于羟基脲具有亲水性，不太可能完全溶解于脂质基质中。相反，羟基脲可能以精细分散的药物形式存在，分布于脂-水界面，或容纳于结构不完整的脂质基质及富含表面活性剂的界面区域中。

释放曲线表现出与制剂相关的特性，在24小时时，HU的累积释放量顺序为 NX-CS > NX-ST > NX-CT 。NX-CS表现出相对较快的释放，具有初始突释效应，随后趋于平台期，符合 一级动力学特征；而NX-CT则表现出最慢且最可控的释放，接近 零级动力学特征；NX-ST呈现中间型的 双相释放曲线 。释放行为可能首先由HU从颗粒表面及富含表面活性剂的界面区域扩散所主导，随后是包埋药物通过脂质基质的较慢扩散过程。NX-CS较快的释放可能与其较小的粒径、更大的比表面积以及Cremophor EL与SDS的协同作用有关，其中SDS可增加界面亲水性，而Cremophor EL有助于药物增溶 。相比之下，NX-CT中Cremophor EL与T80的组合可能形成更稳定的界面屏障，限制药物的初始扩散，从而实现更持久的释放；而NX-ST的中间型双相释放模式则可归因于SDS促进释放与T80介导稳定作用之间的相互抗衡 。这些解释与表面活性剂在调节脂质基质与释放介质之间相互作用中的预期作用一致41,44,45,46,47,48。实验中采用水作为释放介质以建立基础扩散行为，但其无法模拟生物体液中的离子组成和生理条件。生理缓冲液中的电解质可能改变双电层结构、表面活性剂排列、颗粒聚集状态以及膜通透性，从而可能影响释放动力学。

细胞毒性实验结果表明，游离 HU 与 NLC 制剂之间存在显著差异， 游离的 HU，其 IC 值最高₅₀ 且NX-ST表现出最强的细胞毒性活性。 下丘脑下部₅₀ NLC制剂所观察到的数值表明，将羟脲（HU）引入脂质载体中改变了其对MCF-7细胞的体外活性。NX-ST表现出的显著强效反应可能反映了其组分的协同作用 SDS/T80 表面活性剂系统、相对较高的负 ZP 值以及中间型双相释放曲线，这些因素共同可能影响 HU 在细胞界面的药物可及性及细胞对释放 HU 的时间依赖性暴露49,50有趣的是，NX-CS 较小的粒径和较高的包封率并未转化为更强的细胞毒性，这表明仅凭粒径和药物包封率并不能决定其生物活性；相反，细胞相互作用、药物释放行为、表面活性剂效应以及药物的可利用性可能共同影响其生物学效应。51,52,53NX-CT和NX-CS相较于NX-ST的细胞毒性较低，因此不应简单地将其解释为制剂性能较差，尤其是NX-CT表现出最可控的释放特性。

储存研究显示 良好的物理稳定性，因为在整个储存期间，任何配方均未观察到明显的团聚、沉淀、相分离、变色、黏度或质地变化，以及异常/酸败气味。 然而，理化稳定性数据提供了更为细致的图景。在 25 °C粒径和/或PDI的增加表明胶体系统发生了渐进性变化，不同制剂之间的变化程度和统计学显著性存在差异。NX-ST得益于SDS提供的强静电作用，而NX-CT主要依赖于Cremophor EL和T80的空间位阻稳定作用，对粒子特性的变化更为敏感。尽管NX-CS同时具备静电和空间位阻双重稳定机制，但在储存期间仍表现出一定变化，说明两种稳定机制的存在并不能完全阻止NLC系统随时间发生的结构重组。 储存于 4 °C 通常提供了更好的理化稳定性，这与分子运动性降低和脂质结构变化减缓一致；NX-CS 在颗粒尺寸稳定性方面表现出相对更优的性能，而 NX-ST 则保持了相对稳定的特性。然而，NX-CT 的多分散系数（PDI）持续出现渐进性变化，表明仅靠空间稳定化可能不足以实现长期储存。 储存期间ZP的变化进一步提示脂质-表面活性剂界面可能发生随时间依赖的重组，可能与表面活性剂解吸、脂质再结晶及与HU相关的结构变化有关，但这些关联尚未被直接证实47,48,54. 

领域进展

其他抗癌药物（包括吉非替尼、卡培他滨和伊马替尼）的NLC制剂此前已显示出相较于游离药物更优的递送效果14,15,16，但关于不同表面活性剂组合如何影响载药羟基脲NLC的理化性质及细胞毒性特征的比较数据仍较为有限43,44,55。本研究通过在单一NLC平台上系统比较三种表面活性剂体系，提供了直接且内部对照的比较结果，阐明了表面活性剂的离子特性与浓度如何共同影响一种小分子、高度亲水性药物的粒径、胶体稳定性、药物保留能力及体外抗癌活性——相较于疏水性药物载荷，该类药物在NLC文献中的报道较少51,54,56,57。本研究结果进一步拓展了既往关于羟基脲在脂质和白蛋白纳米载体中包封的研究53,58，并鉴定出一种与最强体外细胞毒性增强效应相关的表面活性剂组合（T80–SDS）。

研究局限性

本研究存在若干局限性，在解读研究结果时应予以考虑。首先，生物学评价仅限于MCF-7乳腺癌细胞中的单一体外MTT实验；尽管羟基脲（HU）在临床上用于慢性髓系白血病和镰状细胞病的治疗，但目前的数据尚不足以支持针对这些疾病的特异性结论，仍需在相关的白血病模型（例如K562细胞）中以及体内实验中进一步验证。其次，对于所观察到的理化性质和细胞毒性差异（如表面活性剂解吸、脂质再结晶、细胞摄取改变）所提出的机制性解释尚未被直接证实，应视为假设；需借助DSC、XRD和Cryo-TEM23,41等技术，并结合细胞摄取和释放动力学研究，以提供实证支持。第三，体外释放实验是在水中而非生理缓冲液中进行的，而后者被认为是预测体内性能的关键步骤59。第四，未对制备过程中HU的化学稳定性进行直接定量，也未专门评估储存期间药物向水相泄漏的情况；鉴于HU具有较高的水溶性，泄漏现象可能发生，应予以检测。最后，该制剂拟用于肠外给药，本文所提出的机制性解释应视为探索性的，有待进一步表征，这与更广泛的NLC文献一致，强调需进行严格的理化验证32。

替代方法

在该领域的未来研究中，可采用多种替代性的表征与验证策略以增强研究的严谨性。固态表征技术（如差示扫描量热法（DSC）、X射线衍射（XRD））以及冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）有助于阐明羟基脲（HU）在脂质基质中的物理状态，并直接验证为解释所观察到的稳定性趋势而提出的表面活性剂解吸及脂质再结晶机制36,60,61。在生理缓冲液或模拟生物体液中而非仅在水中进行释放测试，将更准确地预测药物在体内的释放行为；而对细胞摄取进行直接定量分析（例如通过荧光标记结合流式细胞术）则可验证NX-ST增强细胞毒性的摄取机制假说，而非仅依据zeta电位进行间接推断62,63,64。在另一种具有临床相关性的细胞系（如慢性髓系白血病细胞K562）中进行确证性测试，并在正式的加速稳定性条件下进行评估，将进一步推动当前体外研究结果向临床可用制剂的转化。

重要性与潜在应用

这些发现对于改进羟基脲递送系统的广泛努力具有重要意义，因为其临床应用目前受到快速清除、生物利用度差异大以及剂量相关毒性的限制。通过证明表面活性剂组分可被调节以利于形成更小、更稳定且包封效率更高的颗粒（NX-CS、NX-CT），或增强体外细胞毒活性（NX-ST）41,65本研究为根据特定应用所优先考虑的递送特性，在不改变HU分子本身的前提下，选择或进一步优化NLC组分提供了实用基础。此类可调控的纳米载体平台也可能适用于其他具有类似递送限制的小分子亲水性药物。

未来方向

未来的研究应优先开展以下工作：利用固态分析和成像技术对本文提出的物理化学机制进行定量验证；在生理相关条件下进行药物释放测试；直接测量细胞摄取及其与细胞毒性的关系；在更多具有临床相关性的细胞系中进行测试，并最终推进至体内模型研究；开展正式的加速稳定性试验和长期稳定性研究，以支持货架期的确定；以及量化羟基脲（HU）的化学稳定性及储存相关的泄漏情况。解决上述问题将有助于明确本文所发现的物理化学优势是否能够转化为具有实际意义的治疗获益。

结论

本研究通过开发纳米结构脂质载体（NANOXURIA），解决了羟基脲（HU）治疗中的关键局限性，包括因快速清除导致的递送效率低下、生物利用度不稳定以及剂量相关毒性等问题。研究结果表明，表面活性剂组成和储存条件对制剂的理化稳定性、细胞毒性表现及整体递送效率具有重要影响。在所测试的配方中，NX-ST表现出更优的性能，其细胞毒性活性达到游离HU的3.2倍，表明其细胞摄取和药物递送能力显著增强。这种疗效的提升归因于其均衡的颗粒特性、可控的药物释放行为以及有效的静电稳定作用。

相比之下，主要依赖非离子表面活性剂的制剂表现出相对较低的稳定性和性能，凸显了联合稳定机制的重要性。储存条件显著影响制剂的行为：25 °C 促进颗粒生长和异质性，而 4 °C 更有利于保持稳定性、均匀性和表面电荷。

总体而言，本研究通过证明合理设计的NLC系统可在不改变药物本身的情况下增强羟基脲（HU）的递送效果，填补了已识别的研究空白。研究结果强调，最佳的脂质-表面活性剂组合以及适当的储存条件对于实现稳定、高效且具有临床相关性的药物递送系统至关重要。

披露

所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

作者谨向沙特阿拉伯吉赞大学研究生院与科学研究院长办公室表示感谢，感谢其通过项目编号 JU-RSP2026 对本研究工作的资助。作者还诚挚感谢沙特阿拉伯吉赞大学药学院为本项目提供的必要资源，这些资源有力地支持了本研究的顺利完成。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Amicon Ultra-2 mL 离心滤膜（3 kDa 截留分子量）Millipore, 爱尔兰UFC200324
碳支持铜网（透射电镜样品载网）N/A
Cremophor EL（非离子型表面活性剂，蓖麻油衍生物，纯度 ≥98%）MedChemExpress, NJ, 美国HY-Y1890
透析袋（12–14 kDa 截留分子量）Spectrum Laboratories, CA, 美国08-670-3BB
二甲基亚砜（DMSO）Fisher Chemicals, 英国10162090
胎牛血清（FBS）Gibco, Paisley, 英国10270-106
场发射扫描电子显微镜（FE-SEM），Apreo 2Thermo Fisher-FEI, 美国1229000
匀浆器，HG 15DWiseTis, 德国DH.WHG02020
羟基脲（HU）（纯度 ≥99%）Sudair Pharma, 利雅得, 沙特阿拉伯21L001
MCF-7 人乳腺癌细胞系美国典型培养物保藏中心（ATCC），美国HTB-22
酶标仪，SpectroStar NanoBMG LABTECH, Ortenberg, 德国601-101
MTT 试剂（5 mg/mL）Invitrogen Corporation, San Diego, CA, 美国M6494
青霉素-链霉素溶液Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 美国P4333
RPMI 1640 培养基Gibco, Grand Island, NY, 美国11875093
芝麻油当地商家，Jazan, 沙特阿拉伯N/A
十二烷基硫酸钠（SDS）（阴离子型表面活性剂，纯度 90%）PanReac AppliChem, Darmstadt, 德国28312
硬脂酸（纯度 95–106%）Himedia, 孟买, 印度GRM1425
注射器滤器（0.45 µm）Merck, 南非SLHV033RS
透射电子显微镜（TEM），TalosThermo Fisher, 美国N/A
吐温-80（T80）（非离子型表面活性剂，油酸含量 ≥58%）Loba Chemie, 孟买, 印度货号 Art. No. 06420
紫外-可见分光光度计Shimadzu, 京都, 日本220-92961-01
Zetasizer Nano ZS90Malvern Panalytical, Malvern, 英国ZEN3690

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