本方案介绍了一种对比剂诱导的急性肾损伤大鼠模型，并分别和联合评估了对比剂给药后使用N-乙酰半胱氨酸和孟鲁司特的治疗效果。治疗方案与较轻的肾功能障碍、氧化应激、炎症反应及组织病理学损伤相关，但联合治疗并未持续优于单药治疗。
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摘要
摘要
对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）是碘化对比剂暴露后的重要并发症，其肾损害与氧化应激和炎症反应密切相关。本研究建立了一种CI-AKI的实验性大鼠模型，并评估了在给予对比剂后使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）、孟鲁司特或两者联合治疗的效果。成年雄性Wistar大鼠接受禁水处理后，依次静脉注射Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、吲哚美辛和碘海醇。治疗于碘海醇注射完成后1小时（即L-NAME给药后约1.5小时）开始，每日一次，连续3天。评估了肾功能指标、氧化应激参数、炎性细胞因子、肾损伤生物标志物以及肾脏组织病理学变化。未治疗的CI-AKI组表现出明显的肾功能障碍、不利的氧化应激与炎症状态，以及显著的组织病理学损伤。与未治疗的CI-AKI组相比，接受NAC、孟鲁司特或联合治疗的动物在生化和组织病理学指标上总体有所改善。联合治疗组的谷胱甘肽（GSH）水平最高，平均组织病理学损伤评分数值最低；然而，在各项评估指标中，联合治疗并未持续优于单药治疗。该实验方案为评估CI-AKI中对比剂使用后的干预措施提供了可控的临床前研究框架，研究结果提示有必要进一步实验探讨NAC与孟鲁司特的作用，但尚未证实其临床疗效或联合治疗的特异性优势。
引言
急性肾损伤（AKI）常使住院患者的病情复杂化，并导致发病率、死亡率以及医疗资源消耗增加。由于含碘对比剂在诊断性影像学检查和介入操作中被常规使用，对比剂暴露后肾功能恶化已成为重要的临床问题。目前的术语将对比剂相关急性肾损伤（CA-AKI）与对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）加以区分：前者涵盖对比剂使用后发生的任何AKI事件，而后者则指肾损伤被明确归因于对比剂本身。在可控的实验模型中，由于对比剂暴露可直接与肾损伤相关联，因此CI-AKI这一术语仍被广泛使用1,2。
患有慢性肾病、糖尿病、高龄、心力衰竭或其他心血管共病的患者尤其容易发生对比剂相关性急性肾损伤（CI-AKI）。许多患者的肾功能可自行恢复；然而，在较严重的情况下，可能出现持续性肾功能损害、需要肾脏替代治疗以及死亡风险增加。CI-AKI 还与住院时间延长和医疗资源消耗增加相关。这些不良后果凸显了持续开发针对对比剂相关性肾损伤的有效预防和治疗策略的必要性。1,3,4,5.
CI-AKI 的发生涉及多个相互关联的过程，包括肾灌注改变、髓质氧失衡、氧化应激、炎症反应以及直接的肾小管毒性。造影剂暴露使肾内血管张力向血管收缩方向偏移，同时削弱血管舒张反应，从而减少肾血流量。外髓质区域尤为脆弱，因为在生理状态下该区域的氧供应已受到限制。造影剂使用后氧输送进一步下降，可能因此引发缺氧性肾小管损伤2,6,7。
造影剂暴露后出现的肾组织缺氧伴随活性氧（ROS）生成增加，这在很大程度上导致了肾脏损伤。当ROS的产生超过内源性抗氧化能力时，可引发细胞脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，同时增强炎症信号传导。在实验和临床环境中，造影剂的使用均与氧化应激参数升高及抗氧化防御功能受损相关。参与这一反应的分子通路包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶依赖性自由基的形成以及核因子κB（NF-κB）的活化1,6,8,9。
炎症的作用表明，造影剂相关急性肾损伤（CI-AKI）不能仅用血流动力学紊乱来解释。最近的研究还发现，铁死亡、亚硝基化应激以及中性粒细胞胞外诱捕网在造影剂暴露后的肾损伤中发挥重要作用。对这些额外机制的认识拓宽了目前正在研究的用于预防和治疗CI-AKI的分子靶点范围1。
血清肌酐和尿量常用于识别造影剂相关急性肾损伤（CI-AKI），但两者通常仅在肾脏损伤发生后才发生变化。这一局限性促使人们开始评估更早期的指标，包括反映肾小管损伤的肾损伤分子-1（KIM-1）以及与肾小球滤过变化相关的胱抑素C。来自实验和临床研究的证据表明，这些生物标志物的改变可能在CI-AKI早期即可被检测到，因此有助于更早地评估肾损伤9,10,11。
对CI-AKI病理生理机制的深入理解推动了针对氧化应激和炎症通路的药物干预措施的研究。充分水化仍是主要的预防手段，而药物干预方法的报道效果在不同研究中存在差异。因此，目前尚无任何药物治疗方案被证实具有足够一致的有效性，可用于CI-AKI的常规临床预防1,4,12,13。
N-乙酰半胱氨酸（NAC）已被广泛评估作为一种限制对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）的药理学手段。其提出的肾脏保护作用与清除活性物质以及恢复谷胱甘肽储备有关。早期的临床支持来自一项针对慢性肾病患者的重要研究，该研究发现NAC可降低对比剂相关性肾功能障碍的发生率14。然而，后续的临床试验和证据综合研究结果不一致，部分研究报道有获益，而其他研究则显示无显著临床效应。因此，NAC在CI-AKI中的有效性仍不确定12,15,16,17。
孟鲁司特可选择性阻断半胱氨酰白三烯受体-1，长期以来用于治疗哮喘和过敏性疾病。实验证据还表明，该药物具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用。在多种肾脏损伤模型中，给予孟鲁司特与减轻脂质过氧化、增强内源性抗氧化防御能力、减轻组织病理学损伤以及缓解肾脏损伤相关18,19,20,21,22。
目前针对孟鲁司特在对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）中的研究证据仍有限。现有的实验结果表明，其肾脏保护作用可能涉及对氧化应激和炎症信号通路的调节。已有研究提出，孟鲁司特可能通过降低NADPH氧化酶4（NOX4）、p22phox和NF-κB的表达，从而减轻对比剂相关的肾损伤9。
NAC与孟鲁司特影响部分不同但存在重叠的肾损伤相关通路。NAC主要增强抗氧化防御，而孟鲁司特兼具抗炎与抗氧化作用。因此，联合使用这两种药物可能作用于造影剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）病理生理过程的多个环节；然而，在实验模型中尚未明确二者联用是否产生相加或协同效应。18,19,20,21,22.
既往研究主要评估了在造影剂暴露前给予的干预措施，而关于暴露后启动治疗的证据仍较为有限。特别是在实验性造影剂相关急性肾损伤（CI-AKI）模型中，造影剂暴露后联合使用孟鲁司特与N-乙酰半胱氨酸（NAC）的研究甚少。因此，本研究在CI-AKI大鼠模型中，评估了造影剂暴露后单独或联合给予孟鲁司特和NAC对肾功能、氧化应激参数与抗氧化防御、肾损伤及炎症生物标志物以及组织病理学改变的影响。
方案
所有涉及动物的实验操作均遵循国际公认的实验动物护理与使用指南，并符合《动物研究：In Vivo 实验报告》（ARRIVE）指南的要求。本实验方案已获土耳其克尔谢希尔阿希·埃夫兰大学动物实验地方伦理委员会批准（决议编号：2，会议编号：12，日期：2025年6月12日）。在整个研究过程中，尽可能减少动物的痛苦，并尽量减少使用动物的数量。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
化学品的准备
本研究使用了Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、吲哚美辛、碘海醇、孟鲁司特钠和N-乙酰半胱氨酸（NAC）。L-NAME溶液配制浓度为10 mg/mL，方法为将1 g L-NAME溶于100 mL无菌0.9%生理盐水中。该溶液于给药当天新鲜配制，且未在配制后次日继续使用。为建立实验性对比剂急性肾损伤（CI-AKI）模型，以10 mg/kg剂量静脉注射（IV）给予L-NAME。对于体重约为220 g的大鼠，计算给药量约为2.2 mg，对应给药体积约为0.22 mL。吲哚美辛以5%碳酸氢钠溶液配制成10 mg/mL的浓度，方法为将100 mg药物溶解至终体积10 mL。配制过程中涡旋振荡至肉眼观察均匀。实验过程中未测定所配制吲哚美辛溶液的最终pH值，因此无法追溯确定。实验记录中未记载针对所配制吲哚美辛溶液的特定无菌或过滤操作步骤，故无法追溯报告。未建立或评估正式的稳定性时间间隔；该溶液均为当天新鲜配制并当日使用。为诱导实验性CI-AKI模型，以10 mg/kg剂量静脉注射给予吲哚美辛。对于体重约为220 g的大鼠，计算给药量约为2.2 mg，对应给药体积约为0.22 mL。
所使用的市售碘海醇制剂，其浓度为每毫升含647 mg碘海醇，相当于每毫升含300 mg碘，使用时未进行额外稀释。注射时碘海醇的确切温度未记录。由于现有实验记录中无法可靠核实该制剂的特异性渗透压值，因此未予报告。为建立实验性对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）模型，采用静脉注射方式给予碘海醇，剂量为每千克体重3 g碘。对于一只体重约为220 g的大鼠，该剂量提供约0.66 g碘，相当于注射体积约为2.2 mL。
将孟鲁司特钠配制成0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）混悬液。每次给药当天新鲜配制，并在给药前立即涡旋振荡，以确保混悬颗粒均匀分布。根据每只动物在研究开始时记录的体重，使用以下公式单独计算所需孟鲁司特剂量：所需剂量（mg）= 体重（kg）× 10 mg/kg。对于体重约为220 g的动物，计算剂量约为2.2 mg，通过口服灌胃给予。每次给药前对混悬液进行目视检查，若发现有沉淀，则在使用前再次涡旋振荡。
治疗组所用的NAC直接来自其商业制剂，未经进一步稀释，腹腔注射剂量为100 mg/kg。每只动物所需剂量根据研究开始时记录的体重单独计算。对于一只约重220 g的动物，相当于约22 mg的NAC，给药体积约为0.15 mL。给药前对溶液进行目视检查，仅使用澄清且无可见颗粒的制剂。
每次配制完成后均在给药前进行目视检查。对L-NAME、吲哚美辛、碘海醇和NAC溶液检查是否出现变色或可见颗粒。在给药前立即对孟鲁司特混悬液进行涡旋振荡，并通过目视检查以确认其均匀性。任何未满足上述接受标准的制剂均不予使用。在所有化学品的配制和给药过程中均穿戴实验服、防护手套和护目用具。所有操作均符合机构实验室安全和生物安全要求。
动物选择、饲养、实验分组与随机化
从土耳其克尔谢希尔阿希·埃夫兰大学实验动物研究中心获取了30只成年雄性Wistar白化大鼠（8–12周龄；体重200–220 g）。选择雄性大鼠是为了与先前发表的实验性造影剂诱导急性肾损伤（CI-AKI）模型保持方法学上的一致性，并避免将动情周期阶段作为额外的生物学变量引入。本研究未将性别作为实验变量进行评估。该动物设施持有编号为184的繁殖/生产许可证，大鼠在该设施中繁殖并维持于标准实验室条件下。入组时，动物未记录有特定病原体阴性（SPF）状态或其他正式指定的微生物健康分类。每只大鼠单独饲养于尺寸为40 cm × 25 cm × 20 cm的聚碳酸酯笼中，笼底铺以粗切松木屑作为垫料。室温通过自动环境控制和通风系统维持在24 °C ± 2 °C，相对湿度维持在35% ± 10%。采用12小时光照/12小时黑暗循环，光照时间为07:00至19:00。在为期7天的适应期及随后的实验期间，未提供专门的环境丰富化措施。标准颗粒啮齿类饲料和自来水可自由获取，但在诱导CI-AKI前有明确规定的16小时禁水期除外。饲料成分为：24%粗蛋白、3.94%粗纤维、5.08%粗脂肪、8.8%粗灰分、1.44%赖氨酸、0.61%蛋氨酸、1.14%钙、0.89%磷和0.28%钠。所有动物在实验操作开始前均适应环境7天。在适应期和实验期间每日进行观察，以评估动物的一般状况、食物和水摄入量、活动能力、姿势、毛发外观以及任何痛苦迹象。为尽量减少选择偏倚，采用计算机生成的随机分配序列将动物分为五个实验组，每组分配6只大鼠。样本量通过G*Power 3.1.9.6版软件进行前瞻性功效分析确定。
样本量通过事先进行的统计功效分析确定，该分析针对包含五个实验组的固定效应单因素方差分析。假设效应量（f）为 0.65，Ⅰ类错误率（α）为 0.05，统计功效为 80%，计算得出所需的总样本量为 30 只动物，即每组 6 只动物。预先假设效应量（f = 0.65）代表五个组间比较中较大的总体效应。该计算旨在确定检测此类总体效应所需的样本量，并未专门设计用于检测各活性治疗组之间较小的两两差异。在所有分析中，单个动物被视为实验单位。
除常规饲养管理、每日健康监测和终末操作外，对照组动物未接受任何与实验方案相关的抓取或束缚、限水、静脉或腹腔注射、灌胃或溶剂给药。CI-AKI组包括在第8天建立CI-AKI模型且未接受任何治疗的动物。CI-AKI + 孟鲁司特组包括建立CI-AKI模型后接受孟鲁司特治疗的动物。CI-AKI + NAC组包括建立CI-AKI模型后接受NAC治疗的动物。CI-AKI + 孟鲁司特 + NAC组包括建立CI-AKI模型后接受孟鲁司特与NAC联合治疗的动物。对照组和未经治疗的CI-AKI组均未接受与治疗相匹配的假手术操作，具体而言，这些组中未实施假抓取、假灌胃、假治疗性注射或与治疗相匹配的溶剂给药。用于制备L-NAME、吲哚美辛和孟鲁司特的溶剂分别为0.9%生理盐水、5%碳酸氢钠溶液和0.5%羧甲基纤维素（CMC），具体如化学试剂制备部分所述。NAC直接使用其商业制剂，未进一步稀释，且未单独为NAC配制溶剂。在第8天，除对照组动物外，所有动物均经历16小时限水，随后依次静脉注射L-NAME（10 mg/kg）、吲哚美辛（10 mg/kg）和碘海醇（3 g碘/kg），以诱导对比剂诱导的急性肾损伤。在指定的治疗组中，孟鲁司特（10 mg/kg，灌胃）和/或NAC（100 mg/kg，腹腔注射）于第8天碘海醇给药完成后1小时（相当于L-NAME给药后约1.5小时）首次给药，并在第9天和第10天相同时段每日给药一次。
药物给药方案
CI-AKI 的建立依据已发表的实验方案，包括 16 小时的限水处理，随后依次静脉注射 L-NAME、吲哚美辛和碘海醇23,24,25。L-NAME 和吲哚美辛的剂量均为 10 mg/kg，而碘海醇的剂量为 3 g 碘/kg。孟鲁司特钠的治疗剂量为 10 mg/kg，NAC 的治疗剂量为 100 mg/kg。模型诱导剂量和治疗剂量的选择依据既往已发表的实验研究22,26,27，未进行初步的剂量范围探索或剂量优化研究。NAC 和孟鲁司特的剂量选择分别基于既往已发表的针对各单药的实验研究，并非来源于针对联合用药的剂量探索研究。所选剂量并不旨在代表药理学上等效的暴露水平，且未进行剂量-效应关系分析或正式的药物相互作用分析。在个体动物水平上，未采用预设的数值或实验室阈值来定义模型诱导成功。在研究终点，通过未治疗的 CI-AKI 组与对照组相比所观察到的特征性组织病理学改变，支持肾损伤模型的成功建立。第 8 天，除对照组外所有动物在诱导对比剂诱导的急性肾损伤前，均经历一次持续 16 小时的限水处理。在其余实验期间未重复进行限水。标准颗粒饲料在整个限水期间始终自由供应。在完成单次 16 小时限水后，所有限水实验组在给予第一种模型诱导剂 L-NAME 前，同时恢复自由饮用自来水，并持续至实验结束。各限水组的恢复饮水时间和条件保持一致。恢复饮水后，不限制饮水量，也不进行饮水量的定量测量。未测量限水 16 小时前后配对的体重；因此，无法计算与脱水相关的体重下降百分比。尿量未进行定量监测。恢复饮水后，开始诱导 CI-AKI。所有 L-NAME、吲哚美辛和碘海醇的依次静脉注射均通过连接无菌 5 mL 注射器的 26 G 针头经大鼠侧尾静脉进行。静脉注射前，将尾部在温水中加热数分钟，以利于侧尾静脉的可视化和扩张。每次静脉注射后，除各模型诱导剂的计算注射体积外，均用 0.5 mL 无菌 0.9% 生理盐水冲洗静脉。 此外 ，在整个注射和冲洗过程中，需肉眼观察注射部位是否出现肿胀、渗漏或渗出迹象。首先给予 L-NAME（10 mg/kg）。L-NAME 给药后 15 分钟，通过同一侧尾静脉静脉注射吲哚美辛（10 mg/kg）。吲哚美辛给药后 15 分钟，通过同一侧尾静脉以 3 g 碘/kg 的剂量静脉注射碘海醇。每只动物的碘海醇剂量及相应注射体积根据研究开始时记录的体重以及市售制剂中 300 mg 碘/mL 的碘浓度进行个体化计算。这相当于 10 mL/kg 的给药体积，因此对于体重为 200–220 g 的大鼠，注射体积约为 2.0–2.2 mL。本研究未预先规定单独的静脉给药最大容积限制；本研究中使用的最大单次静脉给药体积为碘海醇 10 mL/kg。碘海醇在约 1–2 分钟内缓慢注射。通过注射部位无可见肿胀、渗漏或渗出，确认静脉注射成功。未观察到部分渗出，也未因疑似渗出而需要重新注射或重复给药。碘海醇注射完成后 1 小时，开始向治疗组首次给予指定治疗。由于碘海醇注射在 L-NAME 给药后 30 分钟开始，并在约 1–2 分钟内完成，因此治疗开始时间约为 L-NAME 给药后 91–92 分钟（约 1.5 小时）。孟鲁司特钠（10 mg/kg）通过口服灌胃给予，而 NAC（100 mg/kg）通过腹腔注射给予。
采用22 G不锈钢喂养套管进行口服灌胃。每只动物均保持直立姿势，将喂养套管轻柔地经食管插入胃内。若遇到明显阻力，则应撤回套管并重新定位后再给药。在灌胃过程中及灌胃后立即观察动物是否发生反流。所有动物在灌胃过程中及灌胃后均未观察到反流或其他口服给药不完全的迹象，且无任何动物因怀疑给药失败而被排除。腹腔注射给药部位为腹部右下象限。进针角度约为30°–45°，给药前进行回抽以确认是否误入血管。在给药过程中及给药后立即肉眼监测注射部位是否有渗漏、出血或其他可见并发症。指定的治疗方案于第8、9、10天每天同一时间给药一次。因此，CI-AKI + 孟鲁司特组动物连续三天每天给予一次孟鲁司特，CI-AKI + NAC组动物连续三天每天给予一次NAC，CI-AKI + 孟鲁司特 + NAC组动物则按照相同的三天治疗方案，每天同时给予孟鲁司特和NAC。所有造模和治疗给药操作均由同一名研究人员完成。每只动物在研究开始时测量一次体重，在实验期间不再重复测量。每只动物所用造模剂及研究治疗药物的剂量和相应给药体积均根据研究开始时记录的体重 individually 计算。所有静脉注射、腹腔注射和口服灌胃操作均采用相同的标准技术，以尽量减少与给药相关的变异性。
安乐死操作、人道终点及样本采集
在整个实验过程中，每天观察一次动物的一般状况、食物和水的消耗、活动能力、姿势、毛发外观以及是否存在痛苦迹象。预先设定的安乐死终点包括明显的嗜睡、无法接触或摄取可获得的食物或水、异常姿势、活动能力下降、持续竖毛以及其他任何明显的痛苦表现。一旦动物出现上述任一情况，将立即实施安乐死；但在本研究期间，没有任何动物达到安乐死终点标准。在末次给药后第11天，即给药后24小时，通过腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）联合赛拉嗪（10 mg/kg）诱导深度麻醉。通过检查后肢足底回缩反射的消失来确认麻醉深度足够。在确认达到充分麻醉深度后，通过心脏穿刺从每只动物采集约3–5 mL血液。随后在动物仍处于深度麻醉状态下进行放血以完成安乐死。通过心搏和自主呼吸的完全消失来确认动物死亡。
用于血清生化检测的血液样本采集后置于不含抗凝剂的试管中，静置直至凝血完全。随后在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 10–15 分钟，分离血清并储存于 −80 °C，待后续分析。用于谷胱甘肽检测的样本则单独采集，使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的试管收集。由于此类样本已添加抗凝剂，因此按照相应的谷胱甘肽检测试剂盒说明，无需经历凝血步骤即进行处理。当分离所得血清清澈且无明显溶血迹象时，视为血清分离合格。
确认动物死亡后，进行正中腹切口开腹手术，仔细取出每只动物的双侧肾脏。清除标本周围的脂肪组织和结缔组织。右侧肾脏专门用于组织病理学检查，左侧肾脏则用于生化分析。左侧肾脏的混合组织未经分离肾皮质与髓质，直接进行分析。双侧肾脏独立处理，不同动物的标本在整个处理过程中始终保持分离，不进行混合。整个右侧肾脏置于10%中性缓冲甲醛溶液中固定，随后按组织病理学处理与评分部分所述方法进行组织处理。制备包含肾皮质及外髓质的切片，并进行检查。每份左侧肾脏标本单独标记，并在-80 °C下保存，直至进行匀浆及生化检测。切除后，检查大体组织完整性，并保留足够量的组织以满足后续组织病理学和生化分析的需求。
由于实验分组接受了不同的操作，负责模型诱导和给药的实验人员无法设盲。然而，进行生化与统计分析的研究人员以及负责组织病理学评估的病理学家均对分组信息保持盲态。所有纳入的动物均保留在研究中，并参与后续各项分析。生物样本、动物组织、含甲醛的固定液及其他化学废弃物均在佩戴适当个人防护装备的条件下进行处理。所有生物与化学废弃物的处置均符合机构生物安全与危险废物管理要求。
生化分析
生化检测使用从每只动物采集的血清、EDTA抗凝全血以及左肾组织匀浆进行。以下根据各参数所用的生物基质分别介绍实验步骤。血清用于检测尿素、血尿素氮（BUN）、肌酐、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）。其中，尿素、BUN和肌酐作为肾功能指标，而SOD活性和MDA浓度则作为氧化应激参数进行评估。血清中尿素和BUN的测定采用相同的酶法尿素酶–谷氨酸脱氢酶检测法。该方法中，尿素在尿素酶作用下水解生成氨，后者在谷氨酸脱氢酶存在下与2-氧代戊二酸及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）发生反应。所用分析方法为酶法尿素酶–谷氨酸脱氢酶动力学测定法。通过分光光度计动力学测定因NADH消耗引起的吸光度下降。血清肌酐浓度采用全自动生化分析仪进行比色测定。血清SOD活性也使用同一台全自动生化分析仪，通过市售试剂盒进行比色测定。SOD检测基于黄嘌呤–黄嘌呤氧化酶系统产生超氧自由基，并与2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四氮唑氯化物反应生成有色甲臜产物。终点吸光度在505 nm处测定，SOD活性以U/mL表示。血清MDA浓度通过硫代巴比妥酸反应进行比色测定。将血清样品与冷三氯乙酸混合以沉淀蛋白质，随后通过离心分离沉淀物。该离心步骤在4 °C下以7,500 × g离心5分钟完成。上清液与硫代巴比妥酸在90 °C反应60分钟，冷却后在532 nm处测定吸光度。MDA浓度根据相应的标准曲线计算，并以nmol/mL表示。谷胱甘肽（GSH）分析使用EDTA抗凝全血进行。用三氯乙酸沉淀蛋白质后，对去蛋白样品采用改良的Ellman法进行比色分析。将样品与5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）在pH 8.2的500 mM Tris缓冲液中混合。GSH的巯基与DTNB反应生成有色产物，在412 nm处记录吸光度。过氧化氢酶（CAT）活性采用两步比色法测定。首先将样品与已知量的过氧化氢共同孵育，过氧化氢酶将其转化为水和分子氧。酶反应终止后，使用显色试剂测定残留的过氧化氢。在405 nm处记录吸光度，CAT活性以U/mL表示。对于肾组织检测，每只动物的左肾作为混合组织使用，未分离皮质与髓质。如实验步骤所述，右肾仅用于组织病理学评估。属于各单个动物的样品均独立处理，任何阶段均未合并。每只大鼠的左肾组织在冰上用pH 7.4的50 mM磷酸盐缓冲液以1:10（w/v）的组织与缓冲液体积比进行匀浆。每只大鼠生成一份特异性的肾组织匀浆。该匀浆的不同等分试样用于不同的肾组织检测，确保所有参数均来自同一只动物。所得肾组织匀浆在4 °C下以14,000 × g离心10分钟。离心后，分别收集每只动物的上清液，并分装成若干等分试样用于计划中的肾组织分析。使用大鼠特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测肾组织上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、胱抑素C和KIM-1的浓度。检测按照制造商提供的操作规程进行。TNF-α、IL-1β、IL-6、胱抑素C和KIM-1的ELISA检测孵育条件相同。每项检测中，样品和ELISA试剂在37 °C孵育1小时；经过五次洗涤循环后，加入底物溶液A和B，并在37 °C孵育10分钟。简言之，将标准品和肾组织上清液加入抗体预包被的微孔板中，随后加入相应的生物素化检测抗体和链霉亲和素–辣根过氧化物酶偶联物。在规定孵育步骤后，使用全自动酶标洗板机去除未结合成分。然后加入底物溶液，再用酸性终止液终止显色反应。使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，并根据相应标准曲线计算待测物浓度。肾组织ELISA检测均设双复孔。对每种待测物，计算两个技术重复孔的均值，以获得单个动物水平的数值。来自同一只动物特异性匀浆的技术重复孔及不同等分试样不被视为独立观察值。所有生化检测均在标准化的特定检测条件下进行。血清、EDTA抗凝全血和肾组织样品根据相应分析方法的要求分别处理。执行生化分析的研究人员对分组情况设盲。实验单位为单个动物，而非每份血清样品、血液样品、肾脏标本、匀浆等分试样或技术重复孔。因此，每个实验组的统计分析中包含六个独立的动物水平观察值。
组织病理学处理与评分
将右肾标本按常规组织学方法进行处理，以备显微镜下评估。每只动物的整个右肾均置于10%中性缓冲甲醛溶液中，在室温下固定72小时。固定后，组织依次浸入50%、70%、80%、96%和100%乙醇中进行脱水，每种浓度各处理1小时。随后，标本先后浸入两缸二甲苯中，每缸30分钟，之后进行石蜡包埋。使用旋转式切片机从石蜡包埋块中切取包含肾皮质和外髓质的5 µm切片。
进行苏木精-伊红（HE）染色时，切片经脱蜡和再水化后，用苏木精染色5分钟，然后在流动的自来水下冲洗5分钟。使用酸性酒精进行分化，随后将切片在氨水溶液中蓝化1分钟，并用伊红复染2分钟。染色后的切片依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明，最后用盖玻片永久封片。
用于Masson三色染色的切片同样经过脱蜡和水化处理。随后在56 °C下进行媒染60分钟，再用流动的自来水冲洗10分钟。切片依次用Weigert铁苏木精染色10分钟、丽春红-酸性品红溶液染色15分钟、磷钨酸溶液处理10分钟，以及苯胺蓝溶液染色10分钟。经1%醋酸浸泡5分钟后，切片进行脱水、二甲苯透明处理，并用盖玻片封片。
在显微镜评估前，需分别对每种染色方法验证染色充分性。苏木精-伊红（HE）染色切片在细胞核细节和细胞质对比清晰可辨时视为合格；Masson 三色染色切片在结缔组织结构能够明确识别时予以接受。每只动物各检查三张 HE 染色切片和三张 Masson 三色染色切片。每张切片中随机选取五个显微视野，使用 40× 物镜进行评估。因此，每只动物每种染色方法共检查 15 个显微视野。所有显微镜检查均在所有动物及实验组间采用相同的物镜和标准化评估条件进行。Masson 三色染色切片用于定性评估间质胶原分布与沉积、细胞外基质积聚以及肾小管间质结构。这些切片不用于生成半定量 0–3 分的组织病理学损伤评分。代表性 HE 染色和 Masson 三色染色显微照片使用 40× 物镜拍摄，每张代表性图像均包含 100 µm 比例尺。这些显微照片仅用于图示说明，不作为组织病理学评分或统计分析中的独立观察单位。所有组织病理学评估均由一名经验丰富的病理学家完成，该评估者对实验分组信息保持盲态。采用单一名盲法评估者的目的是减少因观察者间差异导致的评估偏倚和变异。根据先前发表的肾脏损伤模型28,29改良的评分系统，对 HE 染色肾组织切片中的肾小管坏死、肾小管扩张、细胞变性和血管充血进行半定量评分。每个参数的评分范围为 0 至 3 分，分别对应无、轻度、中度和重度组织病理学损伤。对每只动物，其三张 HE 染色切片中每张切片各五个显微视野（共 15 个视野）的检查结果综合考虑，为每个组织病理学参数赋予一个 0–3 分的单一评分。因此，每只动物分别为肾小管坏死、肾小管扩张、细胞变性和血管充血各提供一个评分。组织学切片和显微视野被视为动物体内的亚样本，不作为独立观察单位。在每张切片内，显微视野从各动物及实验组间可比的肾皮质和外髓区域随机选取，以标准化解剖学取样。实验单位为单个动物，而非每个肾脏、组织学切片或显微视野。因此，每个实验组的统计分析中包含六个独立的动物水平观察值。表 3 中呈现的数值为各实验组六只动物个体动物水平评分计算所得的组均值。
统计学分析
统计分析使用统计分析软件进行。所有统计分析均以单个动物作为实验单位。每个实验组包含六只独立的动物（每组 n = 6）。技术重复、检测孔、组织切片和显微镜视野不被视为独立观测值，也不用于增加统计样本量。连续变量以均值 ± 标准差（SD）表示。采用Shapiro–Wilk检验对每个实验组内的数据正态性进行单独评估，采用Levene检验评估方差齐性。鉴于实验设计完全平衡且各组样本量相等，采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较。组间两两比较采用Duncan事后多重比较检验。通过箱线图的图形化检查及对单个观测值的审阅评估潜在离群值。未发现任何观测值代表测量误差或无效实验结果，且未基于统计学理由剔除任何数据点。以 p 值 < 0.05 为具有统计学显著性。
结果
血清肾功能标志物（尿素、血尿素氮和肌酐）
本研究的实验设计、动物分组、治疗方案及样本采集时间线详见 图1。各组间血清尿素、BUN 和肌酐水平的差异具有统计学意义（p = 0.003、p = 0.003 和 p = 0.002，分别）。对照组血清尿素平均水平为 67.43 mg/dL ± 53.11 mg/dL，在 CI-AKI 组中升高至 606.71 mg/dL ± 429.42 mg/dL。同样，BUN 水平从对照组的 31.51 mg/dL ± 24.82 mg/dL 升高至 CI-AKI 组的 268.63 mg/dL ± 190.84 mg/dL。血清肌酐水平也显著升高，从对照组的 0.60 mg/dL ± 0.05 mg/dL 升至 CI-AKI 组的 3.27 mg/dL ± 2.14 mg/dL。Duncan 事后比较分析显示，与未经治疗的 CI-AKI 组相比，各治疗组（CI-AKI + Montelukast 组、CI-AKI + NAC 组以及 CI-AKI + Montelukast + NAC 组）的血清尿素、BUN 和肌酐水平均显著降低（所有 p < 0.05）。血清肾功能标志物的数据见表1。
氧化应激参数与抗氧化酶活性
各组在 SOD、GSH、CAT 和 MDA 水平方面存在统计学显著差异（p = 0.044、p = 0.001、p = 0.003 和 p = 0.001，分别对应；表 1）。Duncan 事后分析显示，孟鲁司特组、NAC 组及联合治疗组的 GSH 水平均显著高于未经治疗的 CI-AKI 组（所有 p < 0.05）。联合治疗组的 GSH 水平也显著高于对照组（p < 0.05）。然而，联合治疗组与任一单药治疗组之间，以及两个单药治疗组之间均未观察到统计学显著差异（所有 p > 0.05）。SOD 水平在 CI-AKI 组中最低（92.23 U/mL ± 16.37 U/mL），而对照组为 147.81 U/mL ± 33.27 U/mL。GSH 水平在 CI-AKI 组中最低（66.05 mmol/L ± 24.72 mmol/L），在 CI-AKI + 孟鲁司特 + NAC 组中最高（172.44 mmol/L ± 60.48 mmol/L）。CAT 活性在对照组中最高（93.35 U/mL ± 18.75 U/mL），在 CI-AKI 组中最低（33.22 U/mL ± 17.07 U/mL）。关于 MDA 水平，CI-AKI 组中观察到最高值（54.13 nmol/mL ± 19.37 nmol/mL），而 CI-AKI + NAC 组中记录到最低值（21.53 nmol/mL ± 5.07 nmol/mL）。氧化应激参数和抗氧化酶活性的相关数据见表 1。
肾损伤及炎症生物标志物（KIM-1、胱抑素C、TNF-α、IL-1β 和 IL-6）
各组在肾组织中的胱抑素C（cystatin C）、IL-6、KIM-1、TNF-α 和 IL-1β 水平上均存在统计学显著差异（p < 0.001、p = 0.008、p = 0.027、p = 0.006 和 p < 0.001，分别对应；表2）。Duncan 事后比较分析显示，与未治疗的 CI-AKI 组相比，各治疗组（即 CI-AKI + Montelukast 组、CI-AKI + NAC 组以及 CI-AKI + Montelukast + NAC 组）的胱抑素C、IL-6、KIM-1、TNF-α 和 IL-1β 水平均显著降低（所有 p < 0.05）。对于 IL-1β，CI-AKI + Montelukast 组与 CI-AKI + NAC 组之间也存在统计学显著差异（p < 0.05）。CI-AKI 组的肾组织胱抑素C水平最高（18.43 ng/mL ± 1.06 ng/mL），而对照组（Control group）的值为 10.30 ng/mL ± 0.78 ng/mL。同样，IL-6 水平在 CI-AKI 组中最高（13.41 ng/L ± 2.14 ng/L），在对照组中最低（9.29 ng/L ± 2.70 ng/L）。KIM-1 水平在 CI-AKI 组中最高（3.07 ng/mL ± 0.36 ng/mL），对照组为 2.25 ng/mL ± 0.54 ng/mL。TNF-α 水平在 CI-AKI 组中最高（161.69 ng/L ± 26.14 ng/L），在对照组中最低（95.49 ng/L ± 16.98 ng/L）。IL-1β 水平在 CI-AKI 组中最高（9.28 ng/mL ± 0.68 ng/mL），最低值出现在 CI-AKI + Montelukast 组（7.34 ng/mL ± 0.57 ng/mL）。有关肾损伤及炎症生物标志物的数据详见表2。值得注意的是，尽管 CI-AKI + Montelukast + NAC 组中某些生化指标数值略高于 CI-AKI + Montelukast 组，但 Duncan 事后比较分析显示，这两个治疗组在所有检测的生化变量（包括氧化应激参数、肾损伤生物标志物和炎症生物标志物）之间均无统计学显著差异（p > 0.05）。
组织病理学评估
组织病理学发现
经HE染色的肾组织切片显示，对照组肾组织结构保持完整，肾小球和肾小管形态正常。相比之下，未治疗的造影剂诱导急性肾损伤（CI-AKI）组表现出明显的组织病理学改变，包括肾小管上皮损伤、广泛的细胞变性、肾小管扩张、管腔内细胞碎片以及血管充血。坏死性改变在近端肾小管节段尤为明显。在CI-AKI + 孟鲁司特组中，肾小管损伤的严重程度较未治疗的CI-AKI组减轻，但仍可见局灶性变性改变。同样，CI-AKI + N-乙酰半胱氨酸（NAC）组也显示出肾小管上皮完整性较好保留，坏死区域较少。在定性组织病理学检查中，CI-AKI + 孟鲁司特 + NAC联合治疗组的肾组织结构基本保持完整，皮质和髓质结构大部分保留，肾小管坏死、肾小管扩张、细胞变性及血管充血程度相对较轻。Masson三色染色切片显示，对照组间质胶原分布正常。在未治疗的CI-AKI组中，可见间质胶原沉积增加、肾小管间质结构紊乱以及细胞外基质积聚。与未治疗的CI-AKI组相比，各治疗组（包括联合治疗组）上述改变较轻微。代表性的HE染色和Masson三色染色肾组织切片如图2所示。
半定量组织病理学评分
半定量组织病理学评估显示，未治疗的造影剂诱导急性肾损伤（CI-AKI）组中，肾小管坏死、肾小管扩张、细胞变性和血管充血的评分最高，该组各项指标的平均评分分别为 2.67、2.83、2.67 和 2.50。这些接近 0–3 分量表上限的较高平均评分，与在同一组中通过定性组织病理学检查所观察到的广泛而严重的肾小管及血管改变一致。相比之下，对照组中所有参数均未见异常。所有治疗组的各项损伤评分均低于未治疗的 CI-AKI 组。CI-AKI + 孟鲁司特组的肾小管坏死、肾小管扩张、细胞变性和血管充血的平均评分分别为 1.33、1.50、1.17 和 1.00。CI-AKI + NAC 组的对应值分别为 1.17、1.17、0.83 和 0.83。数值上，CI-AKI + 孟鲁司特 + NAC 组的平均组织病理学损伤评分最低，肾小管坏死、肾小管扩张、细胞变性和血管充血的平均值分别为 0.50、0.67、0.50 和 0.17。详细的组织病理学评分数据见表 3。
所有生化和组织病理学分析的基础原始数据以及原始未裁剪的苏木精-伊红（HE）和马松三色染色组织学图像均作为补充文件1提供。
图1：实验设计与研究时间线。实验流程的示意图。30只成年雄性Wistar大鼠在经过7天的适应期后，被随机分为五组（每组n = 6）。对照组（Control group）不进行饮水限制、不诱导造影剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI），也不接受任何治疗。其余各组均接受一次16小时的限水处理，随后依次静脉注射L-NAME（10 mg/kg）、吲哚美辛（10 mg/kg）和碘海醇（3 g碘/kg），以诱导CI-AKI。在注射碘海醇后1小时，指定的治疗组分别在第8至10天每天一次给予孟鲁司特（10 mg/kg，经口灌胃）、N-乙酰半胱氨酸（NAC，100 mg/kg，腹腔注射）或两者联合用药，而未治疗的CI-AKI组则不接受任何治疗干预。所有组均于第11天实施终末操作并采集样本。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：实验各组典型的HE染色与Masson三色染色肾组织切片。 来自（A）对照组、（B）造影剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）组、（C）CI-AKI + 孟鲁司特组、（D）CI-AKI + N-乙酰半胱氨酸（NAC）组，以及（E）CI-AKI + 孟鲁司特 + NAC组的代表性HE染色与Masson三色染色肾组织切片。HE染色切片（上排）显示，对照组肾组织结构保持完整，而CI-AKI组则表现出明显的肾小管坏死（*）、肾小管扩张（+）、细胞变性（×）及血管充血（↑）。与未经治疗的CI-AKI组相比，各治疗组的代表性切片中这些组织病理学改变有所减轻。Masson三色染色切片（下排）显示，CI-AKI组间质胶原沉积增加且肾小管间质结构紊乱，而这些变化在各治疗组的代表性切片中表现较轻。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 变量 | 对照组 | CI-AKI组 | CI-AKI+M组 | CI-AKI+NAC组 | CI-AKI+NAC+M组 | p |
| UREA (mg/dL) | 67.43±53.11a | 606.71±429.42b | 105.89±28.63a | 243.14±135.99a | 293.61±212.05a | 0.003 |
| BUN (mg/dL) | 31.51±24.82a | 268.63±190.84b | 51.53±14.69a | 129.54±73.54a | 108.38±87.36a | 0.003 |
| Creatinine (mg/dL) | 0.60±0.05a | 3.27±2.14b | 0.61±0.12a | 1.53±1.17a | 1.28±0.55a | 0.002 |
| SOD (U/mL) | 147.81±33.27a | 92.23±16.37b | 130.96±42.19a | 137.87±31.95a | 141.71±30.27a | 0.044 |
| GSH (mmol/L) | 124.29±21.24b | 66.05±24.72a | 133.87±26.95bc | 139.31±30.10bc | 172.44±60.48c | 0.001 |
| CAT (U/mL) | 93.35±18.75c | 33.22±17.07a | 58.67±32.95ab | 52.64±19.97ab | 75.46±26.85bc | 0.003 |
| MDA (nmol/mL) | 23.42±13.48a | 54.13±19.37b | 22.40±14.81a | 21.53±5.07a | 37.01±9.29a | 0.001 |
| 每行中，具有相同上标字母的组间差异无统计学意义，而上标字母无共同字母的组间差异具有统计学意义（Duncan事后检验，p < 0.05）。 | ||||||
表1：各实验组的生化及氧化应激参数。 组间显著差异：尿素、BUN、肌酐（CREA）、SOD 和 MDA，CI-AKI 组与对照组、CI-AKI+M 组、CI-AKI+NAC 组及 CI-AKI+M+NAC 组比较；GSH，CI-AKI 组与其他所有组以及对照组与 CI-AKI+M+NAC 组比较；CAT，对照组与 CI-AKI 组、CI-AKI+M 组、CI-AKI+NAC 组比较，以及 CI-AKI 组与 CI-AKI+M+NAC 组比较。数据以均值 ± 标准差（n = 6）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接 Duncan 多重比较检验进行分析。无相同上标字母的数值间差异具有统计学意义（p < 0.05）。
| 变量 | 对照组 | CI-AKI组 | CI-AKI+M组 | CI-AKI+NAC组 | CI-AKI+NAC+M组 | p值 |
| 胱抑素C (ng/mL) | 10.30±0.78a | 18.43±1.06b | 10.90±1.13a | 11.00±0.59a | 11.13±0.84a | <0.001 |
| IL-6 (ng/L) | 9.29±2.70a | 13.41±2.14b | 10.24±0.86a | 10.66±0.83a | 10.85±1.63a | 0.008 |
| KIM-1 (ng/mL) | 2.25±0.54a | 3.07±0.36b | 2.39±0.60a | 2.45±0.33a | 2.45±0.17a | 0.027 |
| TNF-α (ng/L) | 95.49±16.98a | 161.69±26.14b | 110.26±38.12a | 119.42±35.35a | 127.76±15.13a | 0.006 |
| IL-1β (ng/mL) | 7.65±0.53ab | 9.28±0.68c | 7.34±0.57a | 8.24±0.73b | 8.11±0.72ab | <0.001 |
| 每行中，具有相同上标字母的组间差异无统计学意义，而上标字母无重叠的组间差异具有统计学意义（依据Duncan事后检验，p < 0.05）。 | ||||||
表2：各实验组肾损伤和炎症生物标志物水平。 组间差异显著：CI-AKI组与对照组、CI-AKI+M组、CI-AKI+NAC组及CI-AKI+M+NAC组相比，胱抑素C、IL-6、KIM-1和TNF-α水平差异显著；IL-1β在CI-AKI组与其他所有组之间，以及CI-AKI+M组与CI-AKI+NAC组之间差异显著。数据以均值±标准差（n = 6）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Duncan事后检验进行分析。无相同上标字母的数值间差异具有统计学意义（p < 0.05）。
| 组别 | 肾小管坏死 | 肾小管扩张 | 细胞变性 | 血管充血 |
| 对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CI-AKI组 | 2.67 | 2.83 | 2.67 | 2.5 |
| CI-AKI+M组 | 1.33 | 1.5 | 1.17 | 1 |
| CI-AKI+NAC组 | 1.17 | 1.17 | 0.83 | 0.83 |
| CI-AKI+NAC+M组 | 0.5 | 0.67 | 0.5 | 0.17 |
表3：实验组间肾组织病理损伤参数的比较。 基于苏木精-伊红（HE）染色的半定量组织病理学损伤评分以各组均值表示（每组 n = 6 只动物）。评分标准为：0 分（无损伤）、1 分（轻度）、2 分（中度）、3 分（重度损伤），分数越高表示组织病理学损伤越严重。
补充文件 1：支持本研究结果的数据。请点击此处下载该文件
讨论
本项实验性对比剂急性肾损伤（CI-AKI）研究评估了在对比剂暴露后使用孟鲁司特、NAC 或二者联合治疗对肾功能、氧化应激参数、炎症反应、肾损伤生物标志物及组织病理学结果的影响。对比剂暴露导致血清尿素、血尿素氮（BUN）和肌酐水平显著升高，并伴随氧化应激参数和炎症生物标志物的不良变化。KIM-1 和胱抑素 C 水平升高进一步提供了肾损伤的证据。
使用孟鲁司特、NAC 或二者联合进行造影后治疗，与多个评估指标的有利变化相关。然而，在生化指标方面，联合治疗并未持续优于孟鲁司特单药治疗。总体而言，这些观察结果支持氧化应激和炎症在造影剂相关急性肾损伤（CI-AKI）中的作用，并提示作用于这些过程的干预措施可能减轻肾损伤，但本研究未直接探讨其潜在的信号通路1,30。
在该实验性对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）模型中，给予对比剂后血清尿素、BUN 和肌酐水平显著升高，表明肾功能障碍已成功诱导。对比剂暴露可通过多种相互关联的机制损害肾功能，包括肾内血管收缩、髓质缺氧、氧化损伤以及肾小管细胞损伤。由此导致的肾灌注和肾小球滤过率下降可能限制氮代谢废物的排泄，从而使其在血液循环中的浓度升高。未经治疗的 CI-AKI 组所观察到的肾功能变化与既往实验研究中报道的结果一致1,30,31,32。
在未经治疗的CI-AKI组中，血清尿素和BUN存在较大的组内变异，表现为相对较大的标准差。这种离散性可能反映了个体间对致敏CI-AKI诱导方案的易感性存在生物学差异，包括对水分剥夺、一氧化氮和前列腺素通路抑制以及造影剂暴露的肾反应差异。动物之间肾功能储备和生理反应的微小差异也可能导致肾损伤严重程度的异质性。因此，较大的标准差应被解读为该实验模型中存在显著生物学变异的证据，而非测量误差。然而，由于每组动物数量较少，对分布特征及治疗相关差异程度的解读应持谨慎态度。
本研究中，NAC治疗组的血清尿素、BUN和肌酐数值均低于未经治疗的CI-AKI组，这一趋势与肾功能损害可能得到缓解的情况一致。NAC在CI-AKI中的应用已被广泛研究，但其对肾功能的影响在不同研究中报道结果不一14,15,16,17。其提出的机制包括清除活性物质、促进谷胱甘肽合成以及限制肾组织内的氧化损伤1。因此，NAC治疗后观察到的肾功能改善可能与其抗氧化特性有关，但本研究并未直接检验这一机制。
本研究中，孟鲁司特治疗组的血清尿素、BUN 和肌酐数值均低于未经治疗的造影剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）组，提示可能减轻了肾功能障碍。既往的实验研究，包括针对 CI-AKI 的研究，同样报道了使用孟鲁司特后血清肌酐和尿素水平降低9,18,19。联合治疗组的肾功能指标数值也低于未经治疗的 CI-AKI 组。然而，与联合治疗相比，孟鲁司特单药治疗组的尿素、BUN 和肌酐数值更低，Duncan 事后比较显示这两组之间无统计学显著差异（p > 0.05）。因此，对于这些肾功能指标而言，联合治疗并未显示出优于孟鲁司特单药治疗的效果。
氧化损伤被认为是对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）病理生理过程中的重要因素。对比剂暴露引起的髓质缺氧会促进过量活性氧（ROS）的生成，可能导致细胞脂质和线粒体损伤，损害肾小管上皮细胞，并增强炎症信号传导1,12,30。
未治疗的CI-AKI组表现出最高的MDA浓度，同时SOD和CAT活性以及GSH水平最低，表明造影剂暴露后氧化负荷与抗氧化防御之间存在失衡。其他CI-AKI实验模型中也报道了类似特征，即MDA升高伴随抗氧化能力下降18,19。这些发现支持氧化应激在肾损伤的发生和发展中起重要作用，而不仅仅是一种继发性后果1,30。
与未经处理的CI-AKI组相比，NAC和孟鲁司特治疗组通常表现出较低的MDA值以及较高的SOD、GSH和CAT值，这一模式提示氧化损伤得到缓解。NAC所提出的抗氧化作用包括中和活性物质以及维持细胞内谷胱甘肽的可利用性1,14孟鲁司特可能通过超越半胱氨酰白三烯受体阻断的作用机制限制肾脏氧化性损伤，包括抑制肾组织内的氧化反应18,33既往关于肾损伤的研究（包括CI-AKI模型）同样报道了孟鲁司特治疗后脂质过氧化减少及抗氧化防御能力改善的情况。9,19,27尽管联合治疗组也观察到了有益的氧化应激参数，但联合治疗的效果并未持续优于任一单药治疗。因此，这些结果并未证实联合使用NAC与孟鲁司特具有相加或协同的抗氧化作用。
KIM-1 和胱抑素 C 的检测结果为造影剂暴露后肾损伤提供了互补的证据。KIM-1 主要与肾小管上皮细胞损伤相关，而胱抑素 C 则用作反映肾小球滤过功能改变及肾损伤的指标；两者均已在实验性造影剂肾病（CI-AKI）模型中被评估为早期生物标志物1,10。在未经治疗的 CI-AKI 组中，这两种生物标志物水平达到最高，同时伴随传统肾功能参数的显著恶化。该模式与既往实验研究结果一致，即在造影剂诱导的肾损伤后，KIM-1 和胱抑素 C 水平均升高1,10。
与未治疗的CI-AKI组相比，治疗组的KIM-1和胱抑素C水平较低，这一模式提示肾损伤程度减轻。该生物标志物特征与治疗后观察到的血清尿素和肌酐浓度数值上降低的趋势相一致。既往实验研究已表明，孟鲁司特给药与CI-AKI及其他肾损伤模型中KIM-1表达降低、肾小管损伤程度减轻以及肾功能保护作用相关。9,18,19NAC 同样与更良好的急性肾损伤生物标志物谱相关，这种作用可能是通过限制氧化应激相关的细胞损伤实现的14,15,16,17然而，在联合治疗组与孟鲁司特单药治疗组之间，KIM-1 或胱抑素 C 的差异均无统计学意义（p > 0.05）。因此，目前的研究结果并未证明联合治疗具有额外的生物标志物优势。
氧化应激与炎症反应可能在造影剂相关急性肾损伤（CI-AKI）过程中相互促进。过量的活性氧（ROS）可激活促炎信号通路，随后导致TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，可能进一步加剧肾组织损伤1,12,13,30。
未治疗的CI-AKI组显示出最高的TNF-α、IL-1β和IL-6浓度，表明在接触造影剂后存在炎症反应。在实验性CI-AKI模型中，这些细胞因子的升高与肾小管损伤、炎性细胞浸润以及肾功能受损相关10,12,13。本研究观察到的炎症细胞因子谱与既往报道的造影剂使用后的实验结果一致1。
与未经治疗的CI-AKI组相比，NAC和孟鲁司特治疗组的TNF-α、IL-1β和IL-6水平较低，这一模式符合炎症反应受到抑制的表现。NAC所提出的抗炎活性可能部分源于氧化应激负担的减轻，从而限制了促炎性细胞因子的产生1,14,15,16,17。孟鲁司特可能通过半胱氨酰白三烯受体阻断以及其他炎症信号通路的调节来影响细胞因子的表达18,33。实验性肾损伤研究也发现，孟鲁司特治疗与NF-κB相关信号通路及促炎活性的降低有关9,19,27。因此，本研究中观察到的细胞因子谱与NF-κB通路及含NOD样受体家族吡啶结构域3（NLRP3）炎性小体等炎症相关通路的调节作用相一致。然而，NF-κB、NLRP3和NOX4并未被直接检测，因此生物标志物的结果仅能提供间接支持性证据，无法确定特定通路的激活或抑制状态。
联合治疗组的炎性细胞因子水平低于未经治疗的造影剂相关急性肾损伤（CI-AKI）组，但联合治疗并未持续产生比单用孟鲁司特更低的水平。在TNF-α、IL-1β或IL-6水平上，CI-AKI + 孟鲁司特组与CI-AKI + 孟鲁司特 + NAC组之间均未检测到具有统计学意义的差异（p > 0.05）。因此，当前结果未提供证据表明，在孟鲁司特治疗基础上加用NAC可带来额外的抗炎益处。
组织病理学评估进一步表明，造影剂的使用导致了显著的肾脏结构损伤。在CI-AKI组中观察到的肾小管坏死、肾小管扩张、细胞变性和血管充血等发现，是CI-AKI典型的组织病理学特征，且与肾灌注受损、氧化应激以及肾小管细胞损伤相关1,12,18,19。结合生化检测结果，这些组织病理学改变证实造影剂的使用导致了显著的肾组织损伤。蒙特鲁卡斯特和NAC治疗组所表现出的组织病理学损伤程度较轻，提示这些药物可能对肾组织具有保护作用。值得注意的是，联合治疗组在各治疗组中表现出数值上最低的组织病理学损伤评分。此外，对Masson三色染色切片的定性评估显示，与未治疗的CI-AKI组相比，各治疗组间质胶原沉积较少，肾小管间质结构保存更佳。鉴于观察期较短且Masson三色染色评估为定性性质，这些结果应被解读为在检测时间点上结构保存更优的证据，而非提示长期细胞外基质重塑发生改变的证据。
半定量组织病理学评估结果与定性观察一致，显示所有治疗组的损伤评分均低于未经治疗的造影剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）组。尽管联合治疗组的组织病理学损伤评分在数值上最低，但这一发现并未在各项生化指标结果中表现出一致的优越性。因此，根据本研究的设计，联合治疗所观察到的有利组织病理学结果不应被解读为具有相加或协同效应的证据。类似地，既往在CI-AKI及其他类型急性肾损伤的实验模型研究中也报道过，抑制氧化应激和炎症反应可减轻组织病理学损害，并有助于维持肾小管结构的完整性9,18,19,27。
在生化指标与组织病理学结果之间观察到明显的差异。尽管孟鲁司特单药治疗组的多项生化指标数值上优于联合治疗组，但这些差异并无统计学意义。相反，联合治疗组在数值上表现出最低的组织病理学损伤评分。这种部分分离现象可能反映了两种评估方法所捕捉到的生物学过程及时间动态的差异。组织病理学检查直接评估肾脏组织内的局部细胞和结构损伤，因此即使血清肾功能标志物及其他生化指标未表现出同等程度的改善，仍可能揭示在检测时间点上的组织水平保护作用。相比之下，生化指标提供的是间接的功能性或分子水平读数，可能受到肾脏功能储备、代偿机制、个体间生物学变异以及样本采集时间的影响。由于所有终点指标均在单一终末时间点进行评估，结构保护与生化恢复可能并未同步发生。因此，联合治疗组更优的组织病理学表现应被解读为不同评估方法之间的差异，而非整体疗效更优的证据。尽管组织病理学评估是在盲法条件下进行以尽量减少观察者偏倚，但所有组织切片均由一名病理学家评估，无法评价观察者间的变异。未来研究若纳入多位独立评估者，可进一步提高组织病理学结果的可靠性和可重复性。
该模型的可重复性依赖于多个操作步骤的一致执行。不同动物之间，应标准化禁水时间、L-NAME、吲哚美辛和碘海醇给药之间的预设时间间隔，以及碘海醇的缓慢静脉输注过程。尾静脉外渗可能降低有效对比剂剂量，并增加肾损伤严重程度的变异性；因此，给药期间应密切监测注射部位。当出现渗漏、外渗或注射过程中阻力明显时，在解读相应结果时应考虑对比剂给药不完全的可能性。剂量的一致性还可能受到灌胃过程中反流或孟鲁司特制剂重悬不充分的影响。对所有动物采用相同的标准操作流程，并在可行的情况下由同一名研究人员负责给药操作，有助于减少可避免的操作变异。
该方案可在相对较短的实验周期内建立CI-AKI模型，同时允许在同一动物模型中检测生化和组织病理学结果1,2,9.
本研究的一个优势在于，采用了功能、生化、炎症及组织病理学等多方面的互补指标来表征肾损伤。通过同时评估肾功能指标、氧化应激参数、炎症细胞因子、KIM-1、胱抑素C以及肾组织形态，可在同一实验中全面考察造影剂相关急性肾损伤（CI-AKI）的多个组成部分。纳入KIM-1和胱抑素C的检测，也使评估范围超越了传统的血清肌酐测量。对孟鲁司特和NAC分别及联合用药的测试，实现了不同治疗策略的直接比较；然而，研究结果并未在各项评估指标中一致显示出联合治疗优于单药治疗。此外，与仅通过造影剂暴露诱导的模型不同，本模型结合了肾血管收缩和髓质缺氧因素，从而构建出显著的肾损伤环境，便于评估治疗相关的生物学变化。
对比剂暴露与治疗开始之间1小时的时间间隔仅代表本实验方案中所考察的时间点，不应被解读为经过临床验证的治疗时间窗。尽管在已知对比剂暴露后尽快开始治疗可能与未来的转化研究相关，但目前的动物研究尚无法确定其在临床应用中的可行性或有效性。特别是最佳治疗启动时间、剂量、给药途径、治疗持续时间以及适用患者人群仍不明确。在考虑将对比剂暴露后的NAC或孟鲁司特用于临床之前，必须通过专门的转化研究和临床研究对这些因素进行深入探讨。
本研究存在若干局限性，应予以承认。研究结果来源于临床前动物模型，因此无法直接推广至临床实践。由于该实验方案结合了限水与一氧化氮及前列腺素通路抑制，所导致的肾损伤可能比患者接受造影剂后通常出现的损伤更为严重。因此，结果应结合这一敏感化的实验环境进行解读。尽管该模型可用于对潜在肾保护治疗的生物学反应进行可控评估，但它未能完全复制临床造影剂诱导急性肾损伤（CI-AKI）的全部异质性或严重程度谱系。因此，在本研究中观察到的治疗相关变化，在具有较轻或更多样化风险特征的患者中可能有所不同。在将这些效应的强度或临床相关性加以确定之前，尚需在更接近常见临床条件的、较温和的模型中进行重复验证，并继之以设计合理的临床研究。另一项局限性在于本研究仅纳入了雄性大鼠，因此未评估性别相关差异在CI-AKI易感性以及对乙酰半胱氨酸（NAC）和孟鲁司特反应中的潜在影响，目前的研究结果不应假定可推广至雌性动物。未来需要纳入两种性别的研究，以明确性别是否影响肾损伤的严重程度或对治疗的反应。
另一个局限性在于，缺乏与实验组在操作流程上相匹配的假手术对照组，以对应实验方案中的操作处理、固定、限水、注射、灌胃和溶剂给予等步骤。由于对照组未接受这些操作，因此无法完全排除操作应激以及与固定、反复抓取、注射、灌胃和溶剂暴露相关的非特异性效应，这些因素可能对对照组与实验组之间观察到的部分差异产生影响。在未来的研究中纳入适当匹配的假手术操作对照组和溶剂对照组，将有助于区分这些非特异性的操作相关效应与由造影剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）建模及治疗所特异性引起的效应。
尽管预先设定的样本量计算旨在对五个实验组之间假设的整体大效应提供80%的检验效能，但本研究并未专门针对单药治疗组与联合治疗组之间较小的成对差异进行效能设计。因此，本研究在检测此类治疗间差异方面可能效能有限，不应将无统计学意义的数值趋势解释为疗效等同的证据。需要更大样本量的研究来确定这些趋势是否代表可重复的治疗差异。
由于本研究仅评估了每种药物的单一剂量，因此无法确定NAC与孟鲁司特的最佳剂量组合，也无法表征剂量依赖性的协同或拮抗作用，更无法量化每种药物在联合治疗所观察到的效果中的相对贡献。因此，某种药物可能对特定结果产生更强的影响，但根据目前的研究设计尚无法确认这一点。未来需要开展包含多个剂量水平及正式药物相互作用分析的研究，以阐明剂量-反应关系并确定最佳的联合用药方案。
该研究评估了氧化应激和炎症的生化指标，但未直接检测相关的细胞内信号通路。因此，所观察到的生物标志物谱无法证明NF-κB、NLRP3或NOX4相关信号通路是否因治疗而被激活或抑制。未来需要采用分子生物学方法（包括蛋白质印迹法和定量聚合酶链式反应（qPCR））进一步研究，以明确这些通路在孟鲁司特和NAC的肾脏效应中所起的作用。
由于评估仅限于急性期，本研究未提供有关后续肾脏恢复或长期组织重塑的信息。因此，在检测时间点治疗组中观察到的相对有限的胶原沉积应被视为早期结构改变，而非证明已阻止慢性肾纤维化。该发现可能反而反映了初始肾脏损伤的减轻。需要纳入更晚评估时间点的纵向研究，以确定这些早期变化是否持续，以及它们是否影响长期肾功能或组织重塑。
总体而言，在该实验性对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）模型中，给予孟鲁司特和NAC（无论单独或联合使用）后，肾功能障碍、氧化应激、炎症反应及组织病理学损伤均有所减轻。然而，在所评估的各项指标中，联合治疗并未始终表现出优于单药治疗的效果。这些发现仅限于当前的临床前模型，提示需进一步开展实验研究，尚不能直接外推至临床实践。
综上所述，在该实验性对比剂诱导的急性肾损伤（CI-AKI）模型中，对比剂使用后给予孟鲁司特、NAC或二者的联合治疗，均表现出更为有利的生化和组织病理学结果。然而，在所评估的各项指标中，联合治疗方案并未持续优于单药治疗。由于这些观察结果来源于临床前动物实验研究，应将其视为进一步实验验证的基础，而非临床有效性或适用性的证据。尚需进一步研究以明确这些对比剂后治疗策略在临床CI-AKI中的潜在意义。
披露
作者声明不存在任何利益冲突。在撰写本文过程中，仅使用了人工智能辅助工具进行语言润色和语法校正。未使用任何人工智能工具生成、分析或解释数据，也未用于创建任何图表、表格或图形元素。作者对稿件内容承担全部责任。
作者贡献：
YS、CS 和 OK 参与了研究的构思与设计。YS 进行了实验操作和数据收集。OK 进行了组织病理学检查。YS 和 CS 进行了统计分析并解读了数据。YS 起草了 manuscript。所有作者均对 manuscript 进行了批判性修改，并批准了最终版本。
致谢
本研究由克尔谢希尔·阿希·埃夫兰大学科研项目协调单位资助（项目编号：TIP.A3.26.006）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自动洗板机 | Bio-Tek Instruments, USA | ELx50 | 用于ELISA板的自动化洗涤。 |
| 酶标仪 | Bio-Tek Instruments, USA | ELx800 | 用于ELISA吸光度测定。 RRID:SCR_028651 |
| 10%中性缓冲福尔马林 | Merck | 未记录 | 用于组织病理学的组织固定。 |
| 台式离心机 | Nüve | NF048 | 样本制备与离心。 |
| 羧甲基纤维素钠（CMC） | Sigma-Aldrich, USA | C5678 | 用于孟鲁司特混悬液的溶媒。 |
| CAT通用检测试剂盒 | Otto Scientific | Otto3051 | 使用迈瑞BS-400生化分析仪对血清中CAT活性进行比色法测定。 |
| 数显匀浆器 | Daihan Scientific | HG-15D | 组织匀浆处理。 |
| 伊红Y（微黄色） | Merck | 1.15935.0025 | 用于HE染色。 |
| 哈里斯苏木精溶液 | BSLAB | BS-002 | 用于HE染色。 |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich, USA | I7378 | 用于诱导造影剂相关急性肾损伤（CI-AKI）。 |
| 碘海醇（Omnipaque 300） | GE HealthCare | 未记录 | 用于诱导CI-AKI的造影剂。 |
| 盐酸氯胺酮（Ketalar） | Pfizer, USA | 未记录 | 采样前用于全身麻醉。 |
| 光学显微镜（尼康Eclipse） | Nikon | Ni-U | 用于组织病理学检查与成像。 RRID:SCR_024835 |
| L-NAME（Nω-硝基-L-精氨酸甲酯） | Sigma-Aldrich, USA | N5751 | 用于诱导CI-AKI。 |
| 马松三色染色试剂盒 | MOSLAB, Türkiye | BKMTO001 | 用于马松三色染色。 |
| 迈瑞生化分析仪 | Mindray | BS-400 | 用于生化分析。 |
| 孟鲁司特钠 | Sigma-Aldrich, USA | SML0101 | 通过灌胃法口服给药作为治疗手段。 |
| N-乙酰半胱氨酸（ASIST 300 mg/2 mL） | MAC  laç, Türkiye | 未记录 | 腹腔注射给药作为治疗手段。 |
| 大鼠胱抑素C ELISA试剂盒 | BT Lab, China | E0145Ra | 用于肾组织上清液中胱抑素C的ELISA检测。 |
| 大鼠IL-1β ELISA试剂盒 | BT Lab, China | E0119Ra | 用于肾组织上清液中IL-1β的ELISA检测。 |
| 大鼠IL-6 ELISA试剂盒 | BT Lab, China | E0135Ra | 用于肾组织上清液中IL-6的ELISA检测。 |
| 大鼠KIM-1 ELISA试剂盒 | BT Lab, China | E0549Ra | 用于肾组织上清液中KIM-1的ELISA检测。 |
| 大鼠TNF-α ELISA试剂盒 | BT Lab, China | E0764Ra | 用于肾组织上清液中TNF-α的ELISA检测。 |
| 不锈钢喂养针（22G口服灌胃套管） | Instech Laboratories, USA | 未记录 | 用于口服灌胃给药。 |
| 标准颗粒啮齿类动物饲料（Optima） | Optima, Türkiye | 未记录 | 批号58931。营养成分：粗蛋白24%，粗纤维3.94%，粗脂肪5.08%，粗灰分8.8%，赖氨酸1.44%，蛋氨酸0.61%，钙1.14%，磷0.89%，钠0.28%。 |
| 肌酐通用检测试剂盒 | Otto Scientific | OttoBC139 | 用于血清中肌酐的比色法测定。 |
| 谷胱甘肽（GSH）通用检测试剂盒 | Otto Scientific | Otto3053 | 采用改良的Ellman法对EDTA抗凝血中GSH进行比色法测定。 |
| 丙二醛（MDA）通用检测试剂盒 | Otto Scientific | Otto1001 | 使用ELx800酶标仪对血清中MDA进行比色法测定。 |
| 超氧化物歧化酶（SOD）通用检测试剂盒 | Otto Scientific | Otto3047 | 使用迈瑞BS-400生化分析仪对血清中SOD活性进行比色法测定。 |
| 尿素通用检测试剂盒 | Otto Scientific | OttoBC157 | 用于血清中尿素和血尿素氮（BUN）的比色法测定。 |
| 盐酸赛拉嗪（Rompun） | Bayer, Germany | 未记录 | 采样前用于全身麻醉。 |
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