本研究评估了养精胶囊对环磷酰胺诱导的小鼠生精功能障碍的保护作用，并探讨了lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK信号通路的参与机制。
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摘要
摘要
生精功能障碍是男性不育的重要原因，环磷酰胺（CP）可通过诱导精原细胞异常凋亡而损害生精过程。养精胶囊（YC）已被用于改善生殖功能，但其潜在的分子机制尚不明确。本研究在CP诱导的生精功能障碍小鼠模型及GC-1精原细胞中探讨了YC的保护作用。评估了精子数量与活力、雄性生育力、血清性激素水平以及睾丸和附睾的组织病理学变化。在GC-1细胞中检测了细胞活力、乳酸脱氢酶释放、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达。采用定量反转录聚合酶链反应、RNA pull-down实验、免疫荧光和蛋白质印迹法检测长链非编码RNA NONMMUT031883.2、Quaking-5（QKI-5）以及p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。YC以剂量依赖方式改善了CP处理小鼠的精子质量、血清性激素水平、生殖器官形态、睾丸组织病理学改变及生育能力。在GC-1细胞中，YC提高了细胞活力，并减轻了细胞损伤和凋亡。长链非编码RNA NONMMUT031883.2与QKI-5存在直接的物理相互作用，YC处理可上调NONMMUT031883.2的表达，同时降低QKI-5的表达和p38的磷酸化水平。YC处理可抑制因NONMMUT031883.2敲低所诱导的GC-1细胞凋亡，而QKI-5的过表达则削弱了YC的抗凋亡作用。这些结果表明，YC可缓解CP诱导的生精功能障碍，其保护作用是通过调控lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK信号通路实现的。
引言
生精功能障碍是指男性生殖系统中精子生成、成熟或功能异常所导致的生殖能力受损，其特征表现为精子数量减少、活力下降以及精子畸形率升高。1,2生精功能障碍的发病机制复杂，与遗传因素、自身免疫性疾病、环境毒素、化疗所致损伤以及生殖器官病变相关3-5。环磷酰胺（CP）等化疗药物可直接损伤睾丸生精小管，并诱导精原细胞凋亡，从而导致男性生精功能障碍6,7激素替代疗法、抗氧化剂补充以及辅助生殖技术目前被用作临床干预手段。然而，这些方法的疗效不稳定，且存在显著的不良反应。8,9,10因此，确定安全有效的干预措施并阐明其分子靶点，对于改善生精功能障碍患者的生育结局具有重要的临床意义。
中药因其多靶点特性和相对较低的毒性，在保护男性生殖功能和治疗生精功能障碍方面显示出潜在的应用价值11,12. 杨敬胶囊（YC）是一种由多种成分组成的中成药 地黄, 淫羊藿胎盘 Polygonatum sibiricum, 当归，以及其他中草药。它具有补肾益精、养血生髓、调节生殖功能的作用13既往研究表明，YC 可调节雄性动物的性激素水平，改善精子质量，修复睾丸组织损伤，并保护生殖系统免受化学物质诱导的损伤14,15精原细胞是精子发生的基础，而精原细胞的异常凋亡是生精功能障碍发生过程中的核心事件16. YC 还被报道可提高精原细胞的存活率，增加处于 S 期细胞的比例，并抑制细胞凋亡17然而，其在环磷酰胺诱导的生精功能障碍中的保护作用及具体分子机制仍不明确。
长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸、不具备蛋白质编码能力的RNA分子18。lncRNA可通过染色体沉默、染色质修饰、基因组印记以及转录激活等机制调控基因表达19,20。RNA结合蛋白Quaking-5（QKI-5）通过调控下游基因的可变剪接，参与细胞增殖和凋亡等生理与病理过程21。p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路参与凋亡调控，并在男性生育力和睾丸发育中发挥重要作用22,23。先前研究表明，QKI-5过表达可在肝细胞癌细胞中激活p38 MAPK通路24。此外，lncRNA NONMMUT074098.2被证实可在精原细胞中与QKI-5结合，而QKI-5的敲低会抑制p38 MAPK通路并减少精原细胞的凋亡25。本研究采用环磷酰胺（CP）诱导的小鼠生精功能障碍模型，探讨益精冲剂（YC）是否通过调控lncRNA NONMMUT031883.2的表达及QKI-5/p38 MAPK信号轴，从而减少异常的精原细胞凋亡，缓解CP诱导的生精功能障碍（图1）。研究目的在于阐明益精冲剂在保护生精功能方面的分子机制，进一步拓展对其保护男性生殖功能药理作用的认识。
图1实验设计示意图 上图总结了体内的 体外 在GC-1精原细胞中进行的实验。通过敲低lncRNA NONMMUT031883.2以诱导细胞凋亡和细胞损伤，随后敲低QKI-5以评估其对凋亡和细胞损伤的影响。下图面板总结了 体内 环磷酰胺（CP）诱导的小鼠生精功能障碍模型实验。小鼠接受养精胶囊治疗和/或长链非编码RNA NONMMUT031883.2或QKI-5干预。随后评估生育力、血清激素水平、睾丸和附睾组织、精子悬液、精子储量、精子质量及睾丸组织病理损伤。 请点击此处以查看此图的放大版本。
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方案
所有动物实验均按照 ARRIVE 指南和美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。所有实验方案均经东南大学动物伦理委员会审查并批准（批准号：20230216022）。
1. 含YC血清的制备
打开两粒育精胶囊（YC；0.5 g/粒），称取内容物0.8 g，加入生理盐水至终体积10 mL，充分涡旋混匀，制成80 mg/mL的混悬液。将8周龄、体重22–25 g的雄性SPF级BALB/c小鼠饲养于 22 °C 在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，温度为，湿度为55%–60%，并提供食物和水 随意摄取经过1周的适应性饲养后，小鼠通过口服灌胃给予YC，剂量为800 mg/kg体重，体积为10 mL/kg，每日1次，连续5天。末次给药2小时后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，采集血液样本以制备含YC血清。血清在56 ℃灭活 56 °C 30分钟，经滤膜过滤 0.22 µm 膜，并于 −80 °C 直至使用。
2. 细胞培养与转染
小鼠GC-1精原细胞系在含有1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。所有细胞培养均在37 °C、5% CO₂（v/v）的气体环境中进行。
针对长链非编码RNA的特异性短发夹RNA（sh-lncRNA）、QKI-5过表达质粒（OE-QKI-5）、QKI-5小干扰RNA（si-QKI-5）及其相应的阴性对照（sh-NC、OE-NC和si-NC）均已完成合成与构建。根据转染试剂说明书，将GC-1细胞分别转染sh-lncRNA或sh-NC、si-QKI-5或si-NC、OE-QKI-5或OE-NC。转染后孵育48小时，通过检测lncRNA NONMMUT031883.2或QKI-5的表达水平评估转染效率。
对于sh-lncRNA + si-QKI-5 + 依托泊苷组，GC-1细胞先转染sh-lncRNA和si-QKI-5，随后用100 µM依托泊苷处理12 h26。在后续细胞活力检测中，GC-1细胞培养于添加了含5%、10%或20% YC血清的培养基中，分别命名为低剂量YC（L-YC）、中剂量YC（M-YC）和高剂量YC（H-YC）组。含YC血清的浓度（5%、10%和20% YC）是根据预实验的浓度梯度结果确定的。对于sh-lncRNA + H-YC + OE-NC组和sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5组，GC-1细胞先转染sh-lncRNA加OE-NC或sh-lncRNA加OE-QKI-5，持续48 h，然后暴露于20%含YC血清中培养24 h。
3. 细胞计数试剂盒-8 检测
将 GC-1 细胞以每孔 5 × 103 个细胞的密度接种至 96 孔板中，培养 24 小时。待细胞贴壁后，弃去原培养基，每孔加入含 YC 血清的完全培养基 100 µL，继续培养 6、12 或 24 小时。培养结束后，每孔加入 10 µL 细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8）试剂，在 37 °C 避光孵育 2 小时，使用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度。
4. 乳酸脱氢酶检测
转染 sh-NC 或 sh-lncRNA 48 小时后，收集 GC-1 细胞培养液，离心获取上清液。根据乳酸脱氢酶检测试剂盒说明书，将上清液与检测工作液轻轻混匀后转移至 96 孔板中。将 96 孔板置于 25 °C 避光孵育 30 分钟。使用酶标仪测定 490 nm 处的吸光度，计算乳酸脱氢酶释放量以评估细胞损伤程度。
5. 钙黄绿素 AM/碘化丙啶染色
在使用 sh-NC 或 sh-lncRNA 转染 48 小时后，采用钙黄绿素 AM/碘化丙啶（PI）染色法评估 GC-1 细胞的存活情况。将细胞以每孔 5 × 104 个细胞的密度接种至 12 孔板中，培养至细胞融合度达到 60%–70%。用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗细胞后，每孔加入 500 µL 钙黄绿素 AM/PI 染色液。细胞在 37 °C 避光孵育 30 分钟，随后在荧光显微镜下观察。使用图像分析软件计数活细胞与死细胞，并计算存活细胞的比例。
6. 流式细胞术
采用离心法收集 GC-1 细胞，并用磷酸盐缓冲液轻柔洗涤。将细胞沉淀重悬于 500 µL 结合缓冲液中，细胞密度为 5 × 105 个细胞/mL。随后每种加入 Annexin V-APC 和 PI 各 5 µL，充分混匀后于 25 °C 避光孵育 10 分钟。通过流式细胞术检测凋亡，APC 的激发/发射波长为 633/660 nm，PI 的激发/发射波长为 488/630 nm。使用流式细胞术分析软件评估细胞凋亡率。
7. Caspase-3 活性检测
经过指定处理后，收集约 1 × 106 个 GC-1 细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤并重悬。将细胞与 Caspase-3 活性检测试剂盒中的 100 µL 试剂 II 混合，在冰上裂解 15 分钟。离心后，取 50 µL 裂解物上清液，与 40 µL 试剂 I 和 10 µL 试剂 III 混合。混合物于 37 °C 孵育 2 小时。使用酶标仪在 405 nm 处测定吸光度，并根据试剂盒说明书评估 Caspase-3 活性。
8. RNA 拉下实验
根据长链非编码 RNA NONMMUT031883.2 的相应序列合成正义链和反义链，并用生物素标记。将细胞在冰上用免疫沉淀细胞裂解缓冲液裂解 30 分钟，离心收集含蛋白质的上清液。用 RNA 结合缓冲液洗涤链霉亲和素磁珠三次，然后将其在含有 1% 牛血清白蛋白的结合缓冲液中孵育 30 分钟。
将预处理的磁珠与生物素标记的探针混合，在 25 °C 下孵育 30 分钟。通过磁分离去除未结合的探针。然后加入细胞裂解液上清，混合物在 4 °C 下孵育 4 小时，以形成磁珠-RNA-蛋白质复合物。磁珠用洗涤缓冲液洗涤三次，以去除非特异性结合的蛋白质。通过磁分离去除洗涤缓冲液后，加入 2× SDS 上样缓冲液。样品在 95 °C 加热 10 分钟，通过磁分离收集上清，用于后续的 Western 印迹分析。
9. 构建小鼠生精功能障碍模型
经过5天适应性饲养后，将8周龄、体重为22–25 g的无特定病原体级雄性BALB/c小鼠，以环磷酰胺（CP）50 mg/kg剂量进行腹腔注射，每日1次，连续7天，以建立生精功能障碍模型14,27。造模成功的小鼠采用随机数字表法随机分为CP组、200 mg/kg YC组、400 mg/kg YC组、800 mg/kg YC组、800 mg/kg YC + sh-NC组和800 mg/kg YC + sh-lncRNA组，每组6只小鼠。
YC处理组的小鼠通过口服灌胃每日给予相应剂量的YC，持续30天13。对于800 mg/kg YC + sh-NC组和800 mg/kg YC + sh-lncRNA组，在成功建立模型后，小鼠通过吸入2%异氟烷进行麻醉。确认每只小鼠无足部回缩反射且呼吸频率稳定后，剃除手术部位毛发并用聚维酮碘消毒。在无菌条件下，于生殖器前方经皮肤和体壁做腹正中切口。通过仔细操作附睾脂肪垫暴露睾丸，注意避免血管损伤。使用显微操作器观察曲细精管，并用显微注射针缓慢注入1 µL腺病毒悬液（1 × 1010 TU/mL）28。注射后针头留置5分钟，然后缓慢拔出，用无菌棉签压迫止血。随后对侧睾丸采用相同操作。切口缝合后，小鼠术后置于加热垫上恢复。对照组小鼠每日通过灌胃和注射给予等体积的生理盐水。
10. 生育力评估
完成药物给药后，将每组的雄性小鼠与雌性BALB/c小鼠以1:2的比例自由交配7天。每天观察并记录雌性小鼠阴道栓形成情况。确认成功交配后，移除雄性小鼠，将雌性小鼠单独饲养直至自然分娩。每组获得9只怀孕雌性小鼠，并纳入分析。记录每窝平均产仔数，以评估各组雄性小鼠的生育能力。
实验周期结束后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死小鼠。该安乐死方法已获得东南大学动物伦理委员会批准（批准号：20230216022）。仔细分离睾丸和附睾，拍照并称重。睾丸和附睾指数按器官重量/体重计算。取每只小鼠的一侧附睾，剪碎后置于1 mL预热的磷酸盐缓冲液（37 °C）中，孵育20分钟以使精子游出29。将精子悬液轻轻混匀，取10 µL置于预热的血细胞计数板上，在光学显微镜下以200×倍率人工计数精子，结果以106/L表示。此外，前向运动精子数占总精子数的百分比定义为精子活力13。
11. 性激素水平的测定
采集各组小鼠眶静脉血液，于25 °C静置30 min。以3,000 × g离心10 min30后收集血清。采用相应的酶联免疫吸附检测试剂盒测定血清中睾酮、黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的水平。
12. RNA 稳定性检测
将 GC-1 细胞接种至 96 孔培养板中，转染 si-QKI-5 或 si-NC 后培养 48 小时。随后加入放线菌素 D 至终浓度为 5 µg/mL，于 0、3、6 和 9 小时收集细胞。提取总 RNA，经反转录后通过定量反转录聚合酶链反应检测长链非编码 RNA NONMMUT031883.2 的相对表达水平。以 0 小时的表达水平为 100%，计算各时间点的相对 RNA 水平。
13. 定量反转录聚合酶链式反应
GC-1 细胞和小鼠睾丸组织用磷酸盐缓冲液冲洗后裂解以提取总 RNA。使用 AMV 逆转录酶通过逆转录反应生成互补 DNA。采用实时荧光定量 PCR 系统和定量 PCR 试剂盒进行聚合酶链式反应扩增，以互补 DNA 作为扩增模板。lncRNA NONMMUT031883.2 的内参为 U6，GAPDH 作为 QKI-5的内参。相对目标基因表达量采用2⁻ΔΔCt法计算。−ΔΔCt 方法25. 分别从细胞质和细胞核组分中分离RNA，以确定长链非编码RNA NONMMUT031883.2的亚细胞定位。引物序列见于 表1.
| 基因 | 上游引物 (5' 至 3') | 下游引物 (5' 至 3') |
| QKI-5 | CTGTCATGCCAAACGGAAC | GATGGACACGCATATCGTG |
| GAPDH | AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA |
| lncRNA NONMMUT031883.2 | CCACTGTGGCACATTGAAGTA | TTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT |
| U6 RNA | CTCGCTTCGGCAGCACA | AACGCTTCACGAATTTGCGT |
表1：用于定量反转录聚合酶链式反应的引物序列。 列出了长链非编码RNA NONMMUT031883.2、QKI-5、U6和GAPDH的5′–3′方向的正向与反向引物序列。
14. 苏木精-伊红染色
将小鼠睾丸和附睾组织浸入4%多聚甲醛中，在4 °C下固定24小时。用磷酸盐缓冲液冲洗后，组织经梯度乙醇脱水，包埋于石蜡中，并切成5 µm厚切片。切片在60 °C下加热60分钟，并在二甲苯中脱蜡30分钟。
经过梯度乙醇水化后，切片用苏木精染色5分钟，用盐酸-乙醇分化液处理10秒，流水冲洗返蓝，再用1%伊红染色2分钟。随后，切片经95%乙醇和无水乙醇脱水，并在二甲苯中透明30分钟。空气干燥后，用中性树胶封片。在显微镜下观察睾丸和附睾的形态学变化。
15. 免疫荧光
小鼠睾丸石蜡切片经梯度乙醇脱蜡并水化后，在 pH 6.0 的柠檬酸缓冲液中进行微波介导的抗原修复。自然冷却至室温后，切片用 0.3% Triton X-100 孵育 10 分钟。随后在 25 °C 下用 5% 牛血清白蛋白封闭 60 分钟，磷酸盐缓冲液洗涤后，加入 Ki67 一抗，4 °C 过夜孵育。次日加入荧光标记的二抗免疫球蛋白 G，37 °C 避光孵育 60 分钟。磷酸盐缓冲液洗涤后，用 DAPI 复染 10 分钟，在荧光显微镜下观察切片。荧光强度采用图像分析软件进行分析。
对GC-1细胞进行免疫荧光染色时，将细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种于12孔板中，培养24小时。随后用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，0.3% Triton X-100透膜处理10分钟，5%牛血清白蛋白封闭后，于4 °C与抗QKI-5的一抗抗体孵育过夜。后续步骤同睾丸组织切片的处理方法所述。
16. TUNEL 染色
小鼠睾丸石蜡切片经脱蜡，梯度乙醇水化后，用 0.1% Triton X-100 孵育 5 分钟，以增加细胞膜通透性。加入不含 DNase 的 20 µg/mL 蛋白酶 K 工作液，均匀覆盖切片，37 °C 孵育 15 分钟。随后加入 TUNEL 检测液，37 °C 避光孵育 90 分钟。再用 DAPI 孵育 10 分钟，封片后使用抗荧光淬灭封片剂，于荧光显微镜下观察睾丸组织。
将GC-1细胞接种至12孔板中，用4%多聚甲醛固定30分钟。用0.1% Triton X-100透化处理5分钟后，加入TUNEL检测液，避光孵育60分钟。随后用DAPI染色10分钟，在荧光显微镜下观察细胞。
17. 蛋白质印迹
将小鼠睾丸组织和 GC-1 细胞在冰上用免疫沉淀细胞裂解缓冲液裂解 30 分钟，并通过超声处理破碎。离心后收集含蛋白的上清液，使用二辛可宁酸蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白上清液与 SDS 上样缓冲液混合，在沸水中加热 10 分钟。经凝胶电泳分离后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜，并用 5% 牛血清白蛋白封闭 2 小时31。
将膜在4 °C下与以下一抗孵育过夜：裂解型caspase-3（1:500）、Bcl-2（1:1000）、caspase-3（1:2000）、Bax（1:500）、QKI-5（1:1000）、磷酸化p38（1:1000）或p38（1:500）。次日，用含Tween 20的Tris缓冲盐水洗涤膜，随后在25 °C下与1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG孵育2小时。将增强型化学发光工作液加入膜表面，使用凝胶成像系统对蛋白条带进行成像。采用图像分析软件分析条带强度，并以GAPDH（1:3000）为内参对相对蛋白表达量进行归一化处理。
使用50 µg/mL的环己酰亚胺抑制蛋白质合成。为测定QKI-5的半衰期，分别在0、3、6和9小时收集细胞，并通过蛋白质印迹法检测QKI-5蛋白水平25。
18. 统计学分析
所有数据均使用统计学、绘图及图像分析软件进行统计分析和作图。采用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。实验数据以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析评估组间差异。当方差齐性时，采用LSD-t检验进行事后两两比较；当方差不齐时，则采用Dunnett’s T3检验。以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。
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结果
敲低长链非编码RNA NONMMUT031883.2可诱导精原细胞凋亡
采用sh-lncRNA转染GC-1细胞以敲低长链非编码RNA NONMMUT031883.2的表达。与转染sh-NC的细胞相比，转染sh-lncRNA后，长链非编码RNA NONMMUT031883.2的转录水平显著降低，表明敲低效果成功（图2A）。在长链非编码RNA NONMMUT031883.2敲低后，GC-1细胞的活力显著下降（图2B），乳酸脱氢酶（LDH）释放量显著增加，提示细胞损伤加重（图2C）。Calcein-AM/PI染色结果显示，sh-lncRNA组中PI阳性GC-1细胞数量增加，存活细胞比例减少（图2D、E）。GC-1细胞的凋亡率在长链非编码RNA NONMMUT031883.2敲低后显著升高（
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讨论
化疗引起的获得性生精功能障碍是男性不育的重要原因32,33,34。然而，其具体的分子机制尚未完全阐明。本研究结果表明，养精胶囊（YC）可剂量依赖性地改善环磷酰胺（CP）诱导的雄性小鼠性激素异常、睾丸组织病理学损伤及生育力下降。这些改善作用与上调lncRNA NONMMUT031883.2表达以及抑制QKI-5/p38 MAPK通路活性相关，提示YC可能通过该信号轴减轻精原细胞的异常凋亡。
环磷酰胺（CP）的生殖毒性已被广泛报道。其代谢产物丙烯醛可在睾丸组织中蓄积，并通过氧化应激、DNA损伤等途径诱导生殖细胞凋亡。精原细胞作为精子发生过程的起始细胞，对CP的细胞毒性作用尤为敏感35,36。Cao et al. 研究发现，在接受CP化疗后出现无精子症患者的睾丸组织中，...
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披露
作者声明不存在任何经济或非经济利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82374257）、江苏省中医院第四批高峰学术人才培育计划（项目编号：k2026yrc74）以及江苏省中医药和中西医结合科研项目（项目编号：CYTF2026019）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 放线菌素D | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-17559 | 用于RNA稳定性检测的转录抑制剂 |
| AMV逆转录酶 | Takara, Tokyo, Japan | 2621 | 用于合成互补DNA的酶 |
| Annexin V-APC/PI检测试剂盒 | BioLab Technology, Beijing, China | KFS191 | 用于流式细胞术分析细胞凋亡的试剂盒 |
| 抗荧光淬灭封片剂 | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-K1042 | 用于荧光保存的封片介质 |
| Bax一抗 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF0120 | 用于检测Bax蛋白的一抗 |
| BCA试剂盒 | Macklin, Shanghai, China | B917925 | 用于蛋白质浓度测定的试剂盒 |
| Bcl-2一抗 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF0769 | 用于检测Bcl-2蛋白的一抗 |
| 牛血清白蛋白 | BioLab Technology, Beijing, China | BTN131070 | 封闭试剂 |
| Calcein/PI检测试剂盒 | Beyotime, Shanghai, China | C2015M | 用于活细胞/死细胞染色的试剂盒 |
| Caspase-3活性检测试剂盒 | BioLab Technology, Beijing, China | QN2866 | 用于检测caspase-3活性的试剂盒 |
| Caspase-3一抗 | Abcam, MA, USA | ab184787 | 用于检测caspase-3蛋白的一抗 |
| CCK-8试剂 | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-K0301 | 用于细胞活力评估的试剂 |
| cleaved caspase-3一抗 | Abcam, MA, USA | ab32042 | 用于检测切割型caspase-3蛋白的一抗 |
| 环己酰亚胺 | Macklin, Shanghai, China | H823111 | 用于蛋白质稳定性检测的蛋白质合成抑制剂 |
| 环磷酰胺 | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-17420 | 用于诱导生精功能障碍 |
| DAPI试剂 | Beyotime, Shanghai, China | C1006 | 细胞核复染试剂 |
| DMEM培养基 | Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, China | SNLM-302 | GC-1细胞培养用培养基 |
| ECL工作液 | Solarbio, Beijing, China | SW2030 | 用于蛋白条带化学发光检测的底物 |
| 依托泊苷 | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-13629 | 诱导细胞凋亡的试剂 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences, CA, USA | BD FACSCalibur | 用于细胞凋亡分析的仪器 |
| FlowJo软件 | BD Biosciences, CA, USA | v10.8 | 用于流式细胞术数据分析的软件 |
| 荧光显微镜 | Leica, Heidelberg, Germany | DM3000 | 用于荧光成像的仪器 |
| 荧光标记二抗IgG | Servicebio, Wuhan, China | GB22303 | 用于免疫荧光检测的二抗 |
| 卵泡刺激素ELISA试剂盒 | Huamei Biotech, Wuhan, China | CSB-E06871m | 用于检测血清卵泡刺激素的试剂盒 |
| GAPDH一抗 | Affinity Biosciences, OH, USA | T0004 | 用于Western blotting的上样对照抗体 |
| GC-1细胞 | Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, China | SNL-302 | 小鼠精原细胞系 |
| 凝胶成像系统 | Jinpeng Analysis Instrument, Shanghai, China | JP-2880 | 用于凝胶和印迹可视化成像的系统 |
| 凝胶成像系统 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | iBright CL1500 | 用于Western blot化学发光成像的系统 |
| 羊抗兔IgG | Servicebio, Wuhan, China | GB23303 | 用于Western blotting的二抗 |
| 苏木精溶液 | BioLab Technology, Beijing, China | YT165 | 用于组织学分析的细胞核染色剂 |
| 盐酸乙醇分化液 | Beyotime, Shanghai, China | C0163S | 苏木精染色用分化试剂 |
| ImageJ软件 | National Institutes of Health, USA | 1.54h | 用于图像定量分析的软件 |
| 免疫沉淀细胞裂解液 | Beyotime, Shanghai, China | P0013 | 用于免疫沉淀和蛋白提取的裂解缓冲液 |
| Ki67一抗 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF0198 | 用于检测Ki67蛋白的一抗 |
| LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime, Shanghai, China | C0016 | 用于检测乳酸脱氢酶释放和细胞损伤的试剂盒 |
| 光学显微镜 | Olympus, Tokyo, Japan | CKX53 | 用于精子计数和形态学观察 |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3000001 | 转染试剂 |
| 酶标仪 | Molecular Devices, CA, USA | SpectraMax Mini | 用于吸光度测量的仪器 |
| 小鼠黄体生成素ELISA试剂盒 | Huamei Biotech, Wuhan, China | CSB-E12770m | 用于检测血清黄体生成素的试剂盒 |
| 小鼠睾酮ELISA试剂盒 | Huamei Biotech, Wuhan, China | CSB-E05101m | 用于检测血清睾酮的试剂盒 |
| 中性树胶 | BioLab Technology, Beijing, China | QN1253 | 用于组织切片封片的介质 |
| p38一抗 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF6456 | 用于检测总p38蛋白的一抗 |
| 多聚甲醛 | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-Y0333 | 用于细胞和组织固定的固定剂 |
| PARIS试剂盒 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | AM1921 | 用于核与胞质RNA分离的试剂盒 |
| PCR系统 | ABI, CA, USA | ABI PRISM 7300 | 实时PCR仪器 |
| p-p38一抗 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF3455 | 用于检测磷酸化p38蛋白的一抗 |
| 蛋白酶K溶液 | Beyotime, Shanghai, China | ST532 | TUNEL染色前用于组织通透的试剂 |
| PVDF膜 | Millipore, MA, USA | ISEQ00010 | 用于Western blotting中蛋白转膜的膜 |
| QKI-5一抗 | Abcam, MA, USA | ab126742 | 用于检测QKI-5蛋白的一抗 |
| RNA结合缓冲液 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 65040D | 用于RNA-蛋白结合反应的缓冲液 |
| SDS上样缓冲液 | Beyotime, Shanghai, China | P0286 | 用于SDS-PAGE上样的样品缓冲液 |
| 链霉亲和素磁珠 | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-K0208 | 用于捕获生物素标记RNA探针的磁珠 |
| TB Green FAST qPCR试剂盒 | Takara, Tokyo, Japan | CN830S | 用于定量PCR的试剂盒 |
| Triton X-100 | Macklin, Shanghai, China | T824275 | 通透试剂 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 15596018CN | 用于总RNA提取的试剂 |
| TUNEL检测液 | Beyotime, Shanghai, China | C1086 | 用于检测DNA断裂的试剂 |
| 二甲苯 | Macklin, Shanghai, China | X821391 | 用于脱蜡和组织透明的试剂 |
参考文献
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