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杨精胶囊通过上调lncRNA NONMMUT031883.2抑制QKI-5/p38 MAPK通路缓解小鼠生精功能障碍

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DOI：

10.3791/73166

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2026年8月28日

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

本研究评估了养精胶囊对环磷酰胺诱导的小鼠生精功能障碍的保护作用，并探讨了lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK信号通路的参与机制。

摘要

生精功能障碍是男性不育的重要原因，环磷酰胺（CP）可通过诱导精原细胞异常凋亡而损害生精过程。养精胶囊（YC）已被用于改善生殖功能，但其潜在的分子机制尚不明确。本研究在CP诱导的生精功能障碍小鼠模型及GC-1精原细胞中探讨了YC的保护作用。评估了精子数量与活力、雄性生育力、血清性激素水平以及睾丸和附睾的组织病理学变化。在GC-1细胞中检测了细胞活力、乳酸脱氢酶释放、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达。采用定量反转录聚合酶链反应、RNA pull-down实验、免疫荧光和蛋白质印迹法检测长链非编码RNA NONMMUT031883.2、Quaking-5（QKI-5）以及p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。YC以剂量依赖方式改善了CP处理小鼠的精子质量、血清性激素水平、生殖器官形态、睾丸组织病理学改变及生育能力。在GC-1细胞中，YC提高了细胞活力，并减轻了细胞损伤和凋亡。长链非编码RNA NONMMUT031883.2与QKI-5存在直接的物理相互作用，YC处理可上调NONMMUT031883.2的表达，同时降低QKI-5的表达和p38的磷酸化水平。YC处理可抑制因NONMMUT031883.2敲低所诱导的GC-1细胞凋亡，而QKI-5的过表达则削弱了YC的抗凋亡作用。这些结果表明，YC可缓解CP诱导的生精功能障碍，其保护作用是通过调控lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK信号通路实现的。

引言

生精功能障碍是指男性生殖系统中精子生成、成熟或功能异常所导致的生殖能力受损，其特征表现为精子数量减少、活力下降以及精子畸形率升高。1,2生精功能障碍的发病机制复杂，与遗传因素、自身免疫性疾病、环境毒素、化疗所致损伤以及生殖器官病变相关3-5。环磷酰胺（CP）等化疗药物可直接损伤睾丸生精小管，并诱导精原细胞凋亡，从而导致男性生精功能障碍6,7激素替代疗法、抗氧化剂补充以及辅助生殖技术目前被用作临床干预手段。然而，这些方法的疗效不稳定，且存在显著的不良反应。8,9,10因此，确定安全有效的干预措施并阐明其分子靶点，对于改善生精功能障碍患者的生育结局具有重要的临床意义。

中药因其多靶点特性和相对较低的毒性，在保护男性生殖功能和治疗生精功能障碍方面显示出潜在的应用价值11,12. 杨敬胶囊（YC）是一种由多种成分组成的中成药 地黄, 淫羊藿胎盘 Polygonatum sibiricum, 当归，以及其他中草药。它具有补肾益精、养血生髓、调节生殖功能的作用13既往研究表明，YC 可调节雄性动物的性激素水平，改善精子质量，修复睾丸组织损伤，并保护生殖系统免受化学物质诱导的损伤14,15精原细胞是精子发生的基础，而精原细胞的异常凋亡是生精功能障碍发生过程中的核心事件16. YC 还被报道可提高精原细胞的存活率，增加处于 S 期细胞的比例，并抑制细胞凋亡17然而，其在环磷酰胺诱导的生精功能障碍中的保护作用及具体分子机制仍不明确。

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸、不具备蛋白质编码能力的RNA分子18。lncRNA可通过染色体沉默、染色质修饰、基因组印记以及转录激活等机制调控基因表达19,20。RNA结合蛋白Quaking-5（QKI-5）通过调控下游基因的可变剪接，参与细胞增殖和凋亡等生理与病理过程21。p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路参与凋亡调控，并在男性生育力和睾丸发育中发挥重要作用22,23。先前研究表明，QKI-5过表达可在肝细胞癌细胞中激活p38 MAPK通路24。此外，lncRNA NONMMUT074098.2被证实可在精原细胞中与QKI-5结合，而QKI-5的敲低会抑制p38 MAPK通路并减少精原细胞的凋亡25。本研究采用环磷酰胺（CP）诱导的小鼠生精功能障碍模型，探讨益精冲剂（YC）是否通过调控lncRNA NONMMUT031883.2的表达及QKI-5/p38 MAPK信号轴，从而减少异常的精原细胞凋亡，缓解CP诱导的生精功能障碍（图1）。研究目的在于阐明益精冲剂在保护生精功能方面的分子机制，进一步拓展对其保护男性生殖功能药理作用的认识。

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图1实验设计示意图 上图总结了体内的 体外 在GC-1精原细胞中进行的实验。通过敲低lncRNA NONMMUT031883.2以诱导细胞凋亡和细胞损伤，随后敲低QKI-5以评估其对凋亡和细胞损伤的影响。下图面板总结了 体内 环磷酰胺（CP）诱导的小鼠生精功能障碍模型实验。小鼠接受养精胶囊治疗和/或长链非编码RNA NONMMUT031883.2或QKI-5干预。随后评估生育力、血清激素水平、睾丸和附睾组织、精子悬液、精子储量、精子质量及睾丸组织病理损伤。 请点击此处以查看此图的放大版本。

方案

所有动物实验均按照 ARRIVE 指南和美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。所有实验方案均经东南大学动物伦理委员会审查并批准（批准号：20230216022）。

1. 含YC血清的制备
打开两粒育精胶囊（YC；0.5 g/粒），称取内容物0.8 g，加入生理盐水至终体积10 mL，充分涡旋混匀，制成80 mg/mL的混悬液。将8周龄、体重22–25 g的雄性SPF级BALB/c小鼠饲养于 22 °C 在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，温度为，湿度为55%–60%，并提供食物和水 随意摄取经过1周的适应性饲养后，小鼠通过口服灌胃给予YC，剂量为800 mg/kg体重，体积为10 mL/kg，每日1次，连续5天。末次给药2小时后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，采集血液样本以制备含YC血清。血清在56 ℃灭活 56 °C 30分钟，经滤膜过滤 0.22 µm 膜，并于 −80 °C 直至使用。

2. 细胞培养与转染
小鼠GC-1精原细胞系在含有1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。所有细胞培养均在37 °C、5% CO₂（v/v）的气体环境中进行。

针对长链非编码RNA的特异性短发夹RNA（sh-lncRNA）、QKI-5过表达质粒（OE-QKI-5）、QKI-5小干扰RNA（si-QKI-5）及其相应的阴性对照（sh-NC、OE-NC和si-NC）均已完成合成与构建。根据转染试剂说明书，将GC-1细胞分别转染sh-lncRNA或sh-NC、si-QKI-5或si-NC、OE-QKI-5或OE-NC。转染后孵育48小时，通过检测lncRNA NONMMUT031883.2或QKI-5的表达水平评估转染效率。

对于sh-lncRNA + si-QKI-5 + 依托泊苷组，GC-1细胞先转染sh-lncRNA和si-QKI-5，随后用100 µM依托泊苷处理12 h26。在后续细胞活力检测中，GC-1细胞培养于添加了含5%、10%或20% YC血清的培养基中，分别命名为低剂量YC（L-YC）、中剂量YC（M-YC）和高剂量YC（H-YC）组。含YC血清的浓度（5%、10%和20% YC）是根据预实验的浓度梯度结果确定的。对于sh-lncRNA + H-YC + OE-NC组和sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5组，GC-1细胞先转染sh-lncRNA加OE-NC或sh-lncRNA加OE-QKI-5，持续48 h，然后暴露于20%含YC血清中培养24 h。

3. 细胞计数试剂盒-8 检测
将 GC-1 细胞以每孔 5 × 103 个细胞的密度接种至 96 孔板中，培养 24 小时。待细胞贴壁后，弃去原培养基，每孔加入含 YC 血清的完全培养基 100 µL，继续培养 6、12 或 24 小时。培养结束后，每孔加入 10 µL 细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8）试剂，在 37 °C 避光孵育 2 小时，使用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度。

4. 乳酸脱氢酶检测
转染 sh-NC 或 sh-lncRNA 48 小时后，收集 GC-1 细胞培养液，离心获取上清液。根据乳酸脱氢酶检测试剂盒说明书，将上清液与检测工作液轻轻混匀后转移至 96 孔板中。将 96 孔板置于 25 °C 避光孵育 30 分钟。使用酶标仪测定 490 nm 处的吸光度，计算乳酸脱氢酶释放量以评估细胞损伤程度。

5. 钙黄绿素 AM/碘化丙啶染色
在使用 sh-NC 或 sh-lncRNA 转染 48 小时后，采用钙黄绿素 AM/碘化丙啶（PI）染色法评估 GC-1 细胞的存活情况。将细胞以每孔 5 × 104 个细胞的密度接种至 12 孔板中，培养至细胞融合度达到 60%–70%。用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗细胞后，每孔加入 500 µL 钙黄绿素 AM/PI 染色液。细胞在 37 °C 避光孵育 30 分钟，随后在荧光显微镜下观察。使用图像分析软件计数活细胞与死细胞，并计算存活细胞的比例。

6. 流式细胞术
采用离心法收集 GC-1 细胞，并用磷酸盐缓冲液轻柔洗涤。将细胞沉淀重悬于 500 µL 结合缓冲液中，细胞密度为 5 × 105 个细胞/mL。随后每种加入 Annexin V-APC 和 PI 各 5 µL，充分混匀后于 25 °C 避光孵育 10 分钟。通过流式细胞术检测凋亡，APC 的激发/发射波长为 633/660 nm，PI 的激发/发射波长为 488/630 nm。使用流式细胞术分析软件评估细胞凋亡率。

7. Caspase-3 活性检测
经过指定处理后，收集约 1 × 106 个 GC-1 细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤并重悬。将细胞与 Caspase-3 活性检测试剂盒中的 100 µL 试剂 II 混合，在冰上裂解 15 分钟。离心后，取 50 µL 裂解物上清液，与 40 µL 试剂 I 和 10 µL 试剂 III 混合。混合物于 37 °C 孵育 2 小时。使用酶标仪在 405 nm 处测定吸光度，并根据试剂盒说明书评估 Caspase-3 活性。

8. RNA 拉下实验
根据长链非编码 RNA NONMMUT031883.2 的相应序列合成正义链和反义链，并用生物素标记。将细胞在冰上用免疫沉淀细胞裂解缓冲液裂解 30 分钟，离心收集含蛋白质的上清液。用 RNA 结合缓冲液洗涤链霉亲和素磁珠三次，然后将其在含有 1% 牛血清白蛋白的结合缓冲液中孵育 30 分钟。

将预处理的磁珠与生物素标记的探针混合，在 25 °C 下孵育 30 分钟。通过磁分离去除未结合的探针。然后加入细胞裂解液上清，混合物在 4 °C 下孵育 4 小时，以形成磁珠-RNA-蛋白质复合物。磁珠用洗涤缓冲液洗涤三次，以去除非特异性结合的蛋白质。通过磁分离去除洗涤缓冲液后，加入 2× SDS 上样缓冲液。样品在 95 °C 加热 10 分钟，通过磁分离收集上清，用于后续的 Western 印迹分析。

9. 构建小鼠生精功能障碍模型
经过5天适应性饲养后，将8周龄、体重为22–25 g的无特定病原体级雄性BALB/c小鼠，以环磷酰胺（CP）50 mg/kg剂量进行腹腔注射，每日1次，连续7天，以建立生精功能障碍模型14,27。造模成功的小鼠采用随机数字表法随机分为CP组、200 mg/kg YC组、400 mg/kg YC组、800 mg/kg YC组、800 mg/kg YC + sh-NC组和800 mg/kg YC + sh-lncRNA组，每组6只小鼠。

YC处理组的小鼠通过口服灌胃每日给予相应剂量的YC，持续30天13。对于800 mg/kg YC + sh-NC组和800 mg/kg YC + sh-lncRNA组，在成功建立模型后，小鼠通过吸入2%异氟烷进行麻醉。确认每只小鼠无足部回缩反射且呼吸频率稳定后，剃除手术部位毛发并用聚维酮碘消毒。在无菌条件下，于生殖器前方经皮肤和体壁做腹正中切口。通过仔细操作附睾脂肪垫暴露睾丸，注意避免血管损伤。使用显微操作器观察曲细精管，并用显微注射针缓慢注入1 µL腺病毒悬液（1 × 1010 TU/mL）28。注射后针头留置5分钟，然后缓慢拔出，用无菌棉签压迫止血。随后对侧睾丸采用相同操作。切口缝合后，小鼠术后置于加热垫上恢复。对照组小鼠每日通过灌胃和注射给予等体积的生理盐水。

10. 生育力评估
完成药物给药后，将每组的雄性小鼠与雌性BALB/c小鼠以1:2的比例自由交配7天。每天观察并记录雌性小鼠阴道栓形成情况。确认成功交配后，移除雄性小鼠，将雌性小鼠单独饲养直至自然分娩。每组获得9只怀孕雌性小鼠，并纳入分析。记录每窝平均产仔数，以评估各组雄性小鼠的生育能力。

实验周期结束后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死小鼠。该安乐死方法已获得东南大学动物伦理委员会批准（批准号：20230216022）。仔细分离睾丸和附睾，拍照并称重。睾丸和附睾指数按器官重量/体重计算。取每只小鼠的一侧附睾，剪碎后置于1 mL预热的磷酸盐缓冲液（37 °C）中，孵育20分钟以使精子游出29。将精子悬液轻轻混匀，取10 µL置于预热的血细胞计数板上，在光学显微镜下以200×倍率人工计数精子，结果以106/L表示。此外，前向运动精子数占总精子数的百分比定义为精子活力13。

11. 性激素水平的测定
采集各组小鼠眶静脉血液，于25 °C静置30 min。以3,000 × g离心10 min30后收集血清。采用相应的酶联免疫吸附检测试剂盒测定血清中睾酮、黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的水平。

12. RNA 稳定性检测
将 GC-1 细胞接种至 96 孔培养板中，转染 si-QKI-5 或 si-NC 后培养 48 小时。随后加入放线菌素 D 至终浓度为 5 µg/mL，于 0、3、6 和 9 小时收集细胞。提取总 RNA，经反转录后通过定量反转录聚合酶链反应检测长链非编码 RNA NONMMUT031883.2 的相对表达水平。以 0 小时的表达水平为 100%，计算各时间点的相对 RNA 水平。

13. 定量反转录聚合酶链式反应
GC-1 细胞和小鼠睾丸组织用磷酸盐缓冲液冲洗后裂解以提取总 RNA。使用 AMV 逆转录酶通过逆转录反应生成互补 DNA。采用实时荧光定量 PCR 系统和定量 PCR 试剂盒进行聚合酶链式反应扩增，以互补 DNA 作为扩增模板。lncRNA NONMMUT031883.2 的内参为 U6，GAPDH 作为 QKI-5的内参。相对目标基因表达量采用2⁻ΔΔCt法计算。−ΔΔCt 方法25. 分别从细胞质和细胞核组分中分离RNA，以确定长链非编码RNA NONMMUT031883.2的亚细胞定位。引物序列见于 表1.

基因上游引物 (5' 至 3')下游引物 (5' 至 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

表1：用于定量反转录聚合酶链式反应的引物序列。 列出了长链非编码RNA NONMMUT031883.2、QKI-5、U6和GAPDH的5′–3′方向的正向与反向引物序列。

14. 苏木精-伊红染色
将小鼠睾丸和附睾组织浸入4%多聚甲醛中，在4 °C下固定24小时。用磷酸盐缓冲液冲洗后，组织经梯度乙醇脱水，包埋于石蜡中，并切成5 µm厚切片。切片在60 °C下加热60分钟，并在二甲苯中脱蜡30分钟。

经过梯度乙醇水化后，切片用苏木精染色5分钟，用盐酸-乙醇分化液处理10秒，流水冲洗返蓝，再用1%伊红染色2分钟。随后，切片经95%乙醇和无水乙醇脱水，并在二甲苯中透明30分钟。空气干燥后，用中性树胶封片。在显微镜下观察睾丸和附睾的形态学变化。

15. 免疫荧光
小鼠睾丸石蜡切片经梯度乙醇脱蜡并水化后，在 pH 6.0 的柠檬酸缓冲液中进行微波介导的抗原修复。自然冷却至室温后，切片用 0.3% Triton X-100 孵育 10 分钟。随后在 25 °C 下用 5% 牛血清白蛋白封闭 60 分钟，磷酸盐缓冲液洗涤后，加入 Ki67 一抗，4 °C 过夜孵育。次日加入荧光标记的二抗免疫球蛋白 G，37 °C 避光孵育 60 分钟。磷酸盐缓冲液洗涤后，用 DAPI 复染 10 分钟，在荧光显微镜下观察切片。荧光强度采用图像分析软件进行分析。

对GC-1细胞进行免疫荧光染色时，将细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种于12孔板中，培养24小时。随后用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，0.3% Triton X-100透膜处理10分钟，5%牛血清白蛋白封闭后，于4 °C与抗QKI-5的一抗抗体孵育过夜。后续步骤同睾丸组织切片的处理方法所述。

16. TUNEL 染色
小鼠睾丸石蜡切片经脱蜡，梯度乙醇水化后，用 0.1% Triton X-100 孵育 5 分钟，以增加细胞膜通透性。加入不含 DNase 的 20 µg/mL 蛋白酶 K 工作液，均匀覆盖切片，37 °C 孵育 15 分钟。随后加入 TUNEL 检测液，37 °C 避光孵育 90 分钟。再用 DAPI 孵育 10 分钟，封片后使用抗荧光淬灭封片剂，于荧光显微镜下观察睾丸组织。

将GC-1细胞接种至12孔板中，用4%多聚甲醛固定30分钟。用0.1% Triton X-100透化处理5分钟后，加入TUNEL检测液，避光孵育60分钟。随后用DAPI染色10分钟，在荧光显微镜下观察细胞。

17. 蛋白质印迹
将小鼠睾丸组织和 GC-1 细胞在冰上用免疫沉淀细胞裂解缓冲液裂解 30 分钟，并通过超声处理破碎。离心后收集含蛋白的上清液，使用二辛可宁酸蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白上清液与 SDS 上样缓冲液混合，在沸水中加热 10 分钟。经凝胶电泳分离后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜，并用 5% 牛血清白蛋白封闭 2 小时31。

将膜在4 °C下与以下一抗孵育过夜：裂解型caspase-3（1:500）、Bcl-2（1:1000）、caspase-3（1:2000）、Bax（1:500）、QKI-5（1:1000）、磷酸化p38（1:1000）或p38（1:500）。次日，用含Tween 20的Tris缓冲盐水洗涤膜，随后在25 °C下与1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG孵育2小时。将增强型化学发光工作液加入膜表面，使用凝胶成像系统对蛋白条带进行成像。采用图像分析软件分析条带强度，并以GAPDH（1:3000）为内参对相对蛋白表达量进行归一化处理。

使用50 µg/mL的环己酰亚胺抑制蛋白质合成。为测定QKI-5的半衰期，分别在0、3、6和9小时收集细胞，并通过蛋白质印迹法检测QKI-5蛋白水平25。

18. 统计学分析
所有数据均使用统计学、绘图及图像分析软件进行统计分析和作图。采用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。实验数据以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析评估组间差异。当方差齐性时，采用LSD-t检验进行事后两两比较；当方差不齐时，则采用Dunnett’s T3检验。以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。

结果

敲低长链非编码RNA NONMMUT031883.2可诱导精原细胞凋亡
采用sh-lncRNA转染GC-1细胞以敲低长链非编码RNA NONMMUT031883.2的表达。与转染sh-NC的细胞相比，转染sh-lncRNA后，长链非编码RNA NONMMUT031883.2的转录水平显著降低，表明敲低效果成功（图2A）。在长链非编码RNA NONMMUT031883.2敲低后，GC-1细胞的活力显著下降（图2B），乳酸脱氢酶（LDH）释放量显著增加，提示细胞损伤加重（图2C）。Calcein-AM/PI染色结果显示，sh-lncRNA组中PI阳性GC-1细胞数量增加，存活细胞比例减少（图2D、E）。GC-1细胞的凋亡率在长链非编码RNA NONMMUT031883.2敲低后显著升高（图2F, G）。sh-lncRNA组的TUNEL阳性率也显著升高，进一步表明细胞凋亡增加（图2H、I）。此外，长链非编码RNA NONMMUT031883.2的敲低显著提高了GC-1细胞中caspase-3的活性（图2J）。在sh-lncRNA组中，Bax表达显著升高，Bcl-2表达降低，cleaved caspase-3/caspase-3比值显著上升（图2K、L）。上述结果表明，敲低长链非编码RNA NONMMUT031883.2可诱导GC-1细胞发生凋亡。所有定量数据均来自n = 6的实验重复。

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图2：lncRNA NONMMUT031883.2 沉默诱导精原细胞凋亡。（A）qRT-PCR 检测 GC-1 细胞中 lncRNA NONMMUT031883.2 的表达水平。（B）lncRNA NONMMUT031883.2 沉默后，采用 CCK-8 试剂盒检测 GC-1 细胞的活力。（C）lncRNA NONMMUT031883.2 沉默后，检测 GC-1 细胞乳酸脱氢酶（LDH）的释放情况。（D, E）采用钙黄绿素-AM/碘化丙啶（PI）染色法检测 GC-1 细胞存活状态（20×；比例尺：100 µm）。（F, G）流式细胞术分析 lncRNA NONMMUT031883.2 沉默后的细胞凋亡情况。（H, I）采用末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）法检测 GC-1 细胞凋亡（40×；比例尺：50 µm）。（J）lncRNA NONMMUT031883.2 沉默后 caspase-3 活性的检测。（K, L）转染 sh-lncRNA 后，通过 Western blot 检测 Bcl-2、Bax、caspase-3 和裂解型 caspase-3 的表达水平。数据以均值 ± 标准差表示；n = 6。***p < 0.001，与 sh-NC 组相比。请点击此处查看该图的放大版本。

长链非编码RNA NONMMUT031883.2与QKI-5相互作用
为阐明精原细胞凋亡的分子机制，检测了长链非编码RNA（lncRNA）NONMMUT031883.2与QKI-5之间的相互作用。通过分离核与细胞质组分后，qRT-PCR分析显示，lncRNA NONMMUT031883.2主要定位于GC-1细胞的细胞核中（图3A）。免疫荧光分析表明，QKI-5也主要富集于细胞核内，为lncRNA NONMMUT031883.2与QKI-5之间的相互作用提供了空间基础（图3B）。为评估QKI-5是否调控lncRNA的稳定性，在使用放线菌素D处理后测定lncRNA NONMMUT031883.2的半衰期。结果显示，敲低QKI-5对lncRNA转录本的半衰期无明显影响（图3C）。在使用环己酰亚胺抑制蛋白质合成后，敲低lncRNA NONMMUT031883.2并未改变QKI-5蛋白的表达水平（图3D、E）。随后通过qRT-PCR评估了靶向lncRNA NONMMUT031883.2的生物素标记反义探针的捕获效率。该反义探针可有效富集目标lncRNA，因此被用于后续的RNA pull-down实验（图3F）。RNA pull-down结合Western blotting结果显示，lncRNA NONMMUT031883.2与QKI-5之间存在特异性的直接物理相互作用（图3G、H）。上述结果表明，lncRNA NONMMUT031883.2与QKI-5在GC-1细胞核内共定位并发生特异性相互作用。图3C以及图3D、F的定量数据来自n = 3的实验重复，其余定量数据来自n = 6的实验重复。

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图3： 长链非编码RNA NONMMUT031883.2 与 QKI-5 相互作用。(A) 在GC-1细胞中通过qRT-PCR分析长链非编码RNA NONMMUT031883.2在细胞核和细胞质中的分布情况。 (B) 在GC-1细胞中通过免疫荧光分析QKI-5的亚细胞定位（40×；比例尺，50 µm）。 (C) 在放线菌素D处理及敲低QKI-5后，通过qRT-PCR分析长链非编码RNA NONMMUT031883.2的半衰期（n = 3）。 (D, E) 在环己酰亚胺处理及敲低长链非编码RNA NONMMUT031883.2后，通过Western blot分析QKI-5蛋白的表达水平（n = 3）。 (F) 通过qRT-PCR验证靶向长链非编码RNA NONMMUT031883.2的生物素标记反义探针的富集效率。 (G, H) RNA pull-down与Western blot分析长链非编码RNA NONMMUT031883.2与QKI-5之间的相互作用。数据以均值±标准差表示；n = 6。 请点击此处查看该图的放大版本。

QKI-5 沉默通过抑制 p38 MAPK 通路抑制精原细胞凋亡
本研究探讨了 QKI-5 及其下游 p38 MAPK 通路在精原细胞凋亡中的作用。在转染 si-QKI-5 后，GC-1 细胞中 QKI-5 蛋白水平显著降低，证实敲低成功（图 4A，B）。长链非编码 RNA NONMMUT031883.2 的沉默显著提高了 p-p38/p38 比值，而同时进行 QKI-5 沉默则降低了该比值，表明 p38 MAPK 通路的激活受到抑制（图 4C，D）。QKI-5 沉默缓解了由 lncRNA NONMMUT031883.2 沉默引起的 GC-1 细胞损伤，而使用凋亡诱导剂依托泊苷处理则显著降低了细胞活力（图 4E）。QKI-5 沉默显著降低了 GC-1 细胞的凋亡率，而依托泊苷处理则明显促进凋亡（图 4F，G）。转染 si-QKI-5 还显著降低了半胱天冬酶-3（caspase-3）活性，而依托泊苷处理则提高了 caspase-3 活性（图 4H）。QKI-5 沉默降低了 Bax 表达，升高了 Bcl-2 表达，并显著降低剪切型 caspase-3/caspase-3 比值，而依托泊苷处理则逆转了这些表达模式（图 4I，J）。这些结果表明，QKI-5 沉默通过抑制 p38 MAPK 通路，抑制 GC-1 精原细胞的凋亡。所有定量数据均来自 n = 6 的实验重复。

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图4： QKI-5 沉默通过抑制 p38 MAPK 通路抑制精原细胞凋亡。（A, B）转染 si-NC 或 si-QKI-5 后 GC-1 细胞中 QKI-5 表达的 Western 印迹分析。（C, D）磷酸化 p38（p-p38）和总 p38 表达的 Western 印迹分析。（E）不同处理组 GC-1 细胞活力的 CCK-8 分析。（F, G）经依托泊苷处理后细胞凋亡的流式细胞术分析。（H）不同处理组中 Caspase-3 活性检测。（I, J）GC-1 细胞中 Bax、Bcl-2、caspase-3 和裂解型 caspase-3 表达的 Western 印迹分析。数据以均值 ± 标准差表示；n = 6。***p < 0.001，与 si-NC 或 sh-NC 组相比；###p < 0.001，与 sh-lncRNA 组相比；&&&p < 0.001，与 sh-lncRNA + si-QKI-5 组相比。请点击此处查看本图的放大版本。

YC 抑制精原细胞凋亡 通过 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 信号通路
GC-1细胞经含YC血清处理6、12和24小时后，细胞活力随YC浓度升高和作用时间延长而逐渐增强。因此，后续实验选用这些浓度，并以24小时为处理时间。图 5A）。YC 处理 24 小时显著提高了 GC-1 细胞中 lncRNA NONMMUT031883.2 的转录水平（图5B）并增强了其与 QKI-5 的结合能力（图 5C，D）。经 YC 处理后，GC-1 细胞中 QKI-5 的表达及 p-p38/p38 比值显著降低，提示 p38 MAPK 通路受到抑制（图5E，F）。YC处理还显著降低了细胞凋亡率（图 5G，H），降低的半胱天冬酶-3活性（图 5I)，Bcl-2 表达增加，以及 Bax 表达和 cleaved caspase-3/caspase-3 比值降低（图5J，K).

为进一步评估通路特异性，将 GC-1 细胞转染 OE-NC 或 OE-QKI-5。OE-QKI-5 转染细胞中 QKI-5 蛋白表达显著升高，证实过表达成功（图 5L、M）。敲低 lncRNA NONMMUT031883.2 显著降低细胞活力，而 YC 处理可逆转此效应。QKI-5 过表达则减弱了 YC 的细胞保护作用（图 5N）。YC 处理还减少了由 lncRNA NONMMUT031883.2 破坏所诱导的细胞凋亡（图 5O、P），降低 caspase-3 活性（图 5Q），下调 Bax 表达，上调 Bcl-2 表达，并降低 cleaved caspase-3/caspase-3 比值（图 5R、S）。相反，QKI-5 过表达减弱了 YC 的抗凋亡作用。这些结果表明，YC 上调 lncRNA NONMMUT031883.2 的表达，并促进其与 QKI-5 的结合，从而抑制 p38 MAPK 通路，抑制 GC-1 细胞的凋亡。所有定量数据均来自 n = 6 的实验。

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图5YC 抑制精原细胞凋亡 通过 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 信号通路。（A） CCK-8法检测GC-1细胞经含养精胶囊（YC）血清作用6、12和24小时后的细胞活力 (B) YC处理24小时后GC-1细胞中lncRNA NONMMUT031883.2表达的qRT-PCR分析 （C，D） YC处理后lncRNA NONMMUT031883.2与QKI-5结合的RNA pull-down分析 （E，F） YC 处理后 QKI-5、p-p38 和 p38 表达的 Western blot 分析 （G，H） YC处理后GC-1细胞凋亡的流式细胞术分析 (I) YC处理后caspase-3活性 （J，K） YC处理后Bcl-2、Bax、caspase-3及cleaved caspase-3表达的Western印迹分析 （L，M） 转染OE-NC或OE-QKI-5后QKI-5表达的Western blot分析 (N) GC-1细胞活力的CCK-8分析 （O，P） QKI-5 过表达后 GC-1 细胞凋亡的流式细胞术分析 (Q) QKI-5 过表达后 Caspase-3 活性变化 (R, S) QKI-5 过表达后 Bax、Bcl-2、caspase-3 和活化 caspase-3 表达的 Western 印迹分析。数据以均值表示 ± 标准差；n = 6。***p < 0.001 与对照组相比； ###p < 0.001 对比 sh-lncRNA； &&&p < 0.001 对比 sh-lncRNA + H-YC + OE-NC。 请点击此处以查看此图的放大版本。

YC 改善环磷酰胺诱导的小鼠生精功能障碍
在生精功能障碍小鼠模型中评估了 YC 的保护作用。环磷酰胺（CP）组小鼠的睾丸和附睾出现明显萎缩、体积减小、色泽暗淡。经不同剂量 YC 治疗后，生殖器官的形态、饱满度和颜色逐渐改善（图 6A）。睾丸和附睾的相对重量显著增加，其中以 800 mg/kg YC 组效果最为显著（图 6B、C）。

CP组的精子畸形率显著升高，常见异常包括头部畸形、尾部卷曲和结构损伤。精子数量和活力也明显降低。经YC治疗后，精子形态得到改善（图6D），精子数量增加（图6E），精子活力显著增强（图6F）。交配实验显示，CP组的生育力和产仔数明显下降，而YC治疗可改善生育力（图6G）。CP组血清睾酮、促卵泡激素和黄体生成素水平也显著降低，YC治疗后则明显升高（图6H–J）。这些结果表明，YC可改善生精功能障碍小鼠的生殖器官萎缩、精子质量、生育力及性激素分泌。图6G的定量数据来自n = 9，其余定量数据来自n = 6。

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图6YC 改善 CP 诱导的小鼠生精功能障碍。（A-C） 对照组、环磷酰胺（CP）组和YC治疗组生殖器官的形态学 （A）， 睾丸指数 （B） 附睾指数 （C）。（D-F） 精子形态学 (D) (40×；比例尺， 50 µm), 精子密度 (E)， 和精子活力 (F). (G) 通过交配实验评估雄性生育力（n = 9）。 （H-J） 采用酶联免疫吸附测定试剂盒检测血清中卵泡刺激素（FSH）、睾酮和黄体生成素（LH）水平。数据以均值表示 ± 标准差；n = 6。***p < 0.001 与对照组相比；#p < 0.05，##p < 0.01，以及 ###p < 0.001 与 CP 相比。 请点击此处以查看此图的放大版本。

YC 改善生精功能障碍小鼠的睾丸组织病理损伤
通过组织学染色评估 YC 对睾丸组织损伤的修复作用。苏木精-伊红染色显示，对照组具有完整的组织结构、清晰的细胞层以及充足的细胞数量。相比之下，CP 组显示出明显的生精小管萎缩和结构紊乱、细胞数量减少以及附睾管腔塌陷。经 YC 治疗后，睾丸和附睾的损伤减轻，生精小管结构逐渐恢复，细胞排列趋于有序且数量增加（图 7A，B）。

与CP组相比，YC处理后睾丸组织中TUNEL阳性细胞的比例显著升高，随后显著降低（图7C，D）。CP组中Bax表达水平以及cleaved caspase-3/caspase-3比值明显升高，而Bcl-2表达则下降；YC处理逆转了这些表达模式（图7E，F）。免疫荧光分析显示，CP组中Ki67荧光强度明显减弱，而经YC处理后显著增强，提示生精细胞增殖能力得到恢复（图7G，H）。这些结果表明，YC可减轻CP诱导的睾丸和附睾组织的组织病理学损伤，抑制过度的细胞凋亡，并促进生精细胞的增殖。所有定量数据均来自n = 6的样本量。

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图7：YC 改善 CP 诱导的小鼠睾丸组织病理损伤。（A, B）经 YC 处理后睾丸（A）和附睾（B）的苏木精-伊红（HE）染色结果（20×；比例尺，100 µm）。（C, D）小鼠睾丸组织中细胞凋亡的 TUNEL 分析（40×；比例尺，50 µm）。（E, F）YC 处理后睾丸组织中 Bax、Bcl-2、caspase-3 和裂解型 caspase-3 表达的 Western blot 分析。（G, H）小鼠睾丸组织中 Ki67 表达的免疫荧光分析（40×；比例尺，50 µm）。数据以均值 ± 标准差表示；n = 6。***p < 0.001，与对照组比较；p < 0.001，与 CP 组比较。请点击此处查看该图的放大版本。

YC 改善小鼠生精功能障碍和睾丸病理损伤 通过 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 信号通路
lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 通路在 YC 作用中的参与进一步得到评估。CP 组小鼠睾丸组织中 lncRNA NONMMUT031883.2 的表达显著降低，而 QKI-5 的表达以及 p-p38/p38 比值明显升高（图8A-D）。经YC处理后，lncRNA NONMMUT031883.2的表达升高，而QKI-5的表达及p-p38/p38比值降低。

为了进一步评估通路特异性，使用sh-lncRNA在小鼠中敲低lncRNA NONMMUT031883.2。lncRNA NONMMUT031883.2的表达水平显著降低，证实敲低成功（图8E）。在敲低lncRNA NONMMUT031883.2后，睾丸组织中QKI-5的水平未发生显著变化，但p-p38/p38水平显著升高（图8F，G）。sh-lncRNA处理减弱了800 mg/kg YC的作用，导致睾丸组织中lncRNA NONMMUT031883.2的表达降低（图8H），同时p-p38/p38水平升高（图8I，J）。在CP诱导后，YC处理显著提高了精子数量和活力，而lncRNA NONMMUT031883.2的敲低减弱了这些效应（图8K，L）。YC处理还提高了CP组中睾酮、卵泡刺激素和黄体生成素的水平，而lncRNA敲低则减弱了这些效应（图8M-O）。

苏木精-伊红染色显示，YC可改善环磷酰胺（CP）诱导的睾丸损伤，包括生精小管萎缩和生精细胞排列紊乱。长链非编码RNA NONMMUT031883.2的敲低减弱了这些保护作用（图8P）。经YC处理后，Bax表达水平以及cleaved caspase-3/caspase-3比值降低，而Bcl-2表达升高。NONMMUT031883.2敲低逆转了YC对凋亡相关蛋白的上述影响（图8Q、R）。这些结果表明，YC通过上调lncRNA NONMMUT031883.2、下调QKI-5并抑制p38 MAPK通路，从而改善CP诱导后的精子质量并减轻睾丸组织损伤。所有定量数据均来自n = 6的实验样本。

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图8YC可改善生精功能并减轻睾丸组织病理损伤 通过 lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK 信号通路。（A） 小鼠睾丸组织中长链非编码RNA NONMMUT031883.2表达的qRT-PCR分析 （B-D） YC处理后小鼠睾丸组织中QKI-5、p-p38和p38表达的Western印迹分析 (E) sh-lncRNA 处理后小鼠睾丸组织中 lncRNA NONMMUT031883.2 沉默的 qRT-PCR 验证 （F，G） 小鼠lncRNA NONMMUT031883.2敲低后，睾丸组织中QKI-5和p-p38/p38水平的Western印迹分析 (H) YC处理及sh-lncRNA给药后小鼠睾丸组织中lncRNA NONMMUT031883.2表达的qRT-PCR分析 （I，J） 小鼠睾丸组织中 p-p38 和 p38 表达的 Western blot 分析 （K，L） 精子计数（K）和精子活力 (L) 在不同处理组中。 （M-O 采用酶联免疫吸附测定试剂盒检测血清中卵泡刺激素（FSH）、睾酮和黄体生成素（LH）水平。 (P) CP处理小鼠睾丸组织的HE染色（20×；比例尺， 100 µm). （Q，R） 小鼠睾丸组织中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和caspase-3表达的Western blot分析。数据以均值表示 ± 标准差；n = 6。***p < 0.001 与对照组相比；p < 0.001 对照 CP；p < 0.001 与 800 mg/kg YC + sh-NC。 请点击此处以查看此图的放大版本。

数据可用性：
支持本研究发现的原始数据作为补充文件1提供。

补充文件 1：原始数据。 本 Excel 文件包含图 2–8 中定量分析所依据的原始数值数据。请点击此处下载该文件。

讨论

化疗引起的获得性生精功能障碍是男性不育的重要原因32,33,34。然而，其具体的分子机制尚未完全阐明。本研究结果表明，养精胶囊（YC）可剂量依赖性地改善环磷酰胺（CP）诱导的雄性小鼠性激素异常、睾丸组织病理学损伤及生育力下降。这些改善作用与上调lncRNA NONMMUT031883.2表达以及抑制QKI-5/p38 MAPK通路活性相关，提示YC可能通过该信号轴减轻精原细胞的异常凋亡。

环磷酰胺（CP）的生殖毒性已被广泛报道。其代谢产物丙烯醛可在睾丸组织中蓄积，并通过氧化应激、DNA损伤等途径诱导生殖细胞凋亡。精原细胞作为精子发生过程的起始细胞，对CP的细胞毒性作用尤为敏感35,36。Cao et al. 研究发现，在接受CP化疗后出现无精子症患者的睾丸组织中，DNA损伤检查点信号通路显著富集，而与精子发育相关的基因显著下调，生精小管的结构完整性遭到破坏37。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，通过维持线粒体膜完整性发挥作用38。Bax是一种促凋亡蛋白，其表达上调可促进细胞色素c从线粒体释放至胞质，激活caspase级联反应，从而诱导细胞凋亡39,40。Saleh et al. 证实，CP暴露可导致小鼠生精小管萎缩和间质水肿，伴随Bcl-2表达下调和Bax表达上调，最终导致精子数量减少和运动能力下降41。因此，抑制CP诱导的过度精原细胞凋亡可能是保护化疗后生殖功能的重要靶点。在本研究中，YC干预以剂量依赖方式减轻了CP引起的血清性激素分泌异常，修复了生精小管损伤，并改善了精子活力和雄性生育力。YC还上调了睾丸组织中Bcl-2的表达，下调了Bax的表达，降低了cleaved caspase-3/caspase-3比值以及TUNEL阳性细胞数量。体外实验中，含YC血清显著减少了GC-1细胞的凋亡，提高了细胞活力，进一步支持其对精原细胞凋亡的抑制作用。

长链非编码RNA（lncRNA）在生理性与病理性过程中发挥重要的调控作用，包括精子发生及生殖细胞凋亡42,43。lncRNA表达异常可通过调控氧化应激和凋亡通路损害睾丸生精功能，是男性不育的重要分子机制之一44。Wang et al. 研究发现，lncRNA DNM3OS可调控miR-214-5p/E2F2轴，导致精原细胞活性降低以及凋亡和衰老增加，最终促进非梗阻性无精症的发生45。先前的研究也表明，在精原细胞中敲低lncRNA NONMMUT074098.2可诱导细胞凋亡25。这些研究提示，lncRNA是精原细胞凋亡和精子发生过程中的重要调控因子。在本研究中，敲低lncRNA NONMMUT031883.2可诱导精原细胞凋亡。在环磷酰胺诱导后，该lncRNA在小鼠睾丸组织中的表达显著下调，而益气生精方（YC）干预部分恢复了其表达水平。此外，YC干预减轻了由lncRNA NONMMUT031883.2敲低所引起的异常精原细胞凋亡，提示YC的保护作用可能与其对这一lncRNA的调控有关。

QKI-5 是一种属于 STAR 蛋白家族的 RNA 结合蛋白，通过调控靶 mRNA 的剪接、稳定性和翻译效率，参与多种生理与病理过程46,47。先前的研究表明，QKI-5 在生殖系统中是一种重要的调控因子，其异常表达可通过激活下游 p38 MAPK 通路促进生殖细胞凋亡并损害精子功能25。Li et al. 发现，抑制 p38 MAPK 通路的激活可减轻环磷酰胺（CP）诱导的大鼠睾丸组织损伤，并恢复血睾屏障功能48。这些结果提示，QKI-5/p38 MAPK 轴可能是调控精原细胞凋亡的重要通路，也是治疗生精功能障碍的潜在靶点。在本研究中，经 CP 诱导后，小鼠睾丸组织中 QKI-5 表达和 p38 磷酸化水平显著升高，而 YC 干预则降低了 QKI-5 表达及 p38 MAPK 通路的激活。长链非编码 RNA（lncRNA）NONMMUT031883.2 可直接与 QKI-5 结合，而 QKI-5 的表达并不影响该 lncRNA 的稳定性，提示 lncRNA NONMMUT031883.2 可能通过直接相互作用调控 QKI-5 的功能。敲低 QKI-5 可减轻 lncRNA NONMMUT031883.2 敲低对 GC-1 细胞造成的损伤，而过表达 QKI-5 则削弱了 YC 对 GC-1 细胞的保护作用。Li et al. 报道，lncRNA NONMMUT074098.2 通过与 QKI-5 结合调控生殖细胞凋亡25。本研究结果表明，lncRNA NONMMUT031883.2 同样可与 QKI-5 结合，并参与调控精原细胞凋亡。综上所述，这些数据提示 YC 可能通过上调 lncRNA NONMMUT031883.2 的表达，抑制 QKI-5/p38 MAPK 通路，减少异常的精原细胞凋亡，从而缓解 CP 诱导的生精功能障碍。然而需要注意的是，YC 是一种多组分中药复方制剂，可能作用于多个靶点。其他机制，如 YC 组分的直接抗氧化作用、对其他信号通路的调节，或独立于 lncRNA-QKI-5 轴的表观遗传调控，也不能排除，可能共同参与了所观察到的保护效应。

应承认本研究存在若干局限性。本研究仅在小鼠模型和GC-1细胞系中进行，缺乏使用不育症患者临床样本的验证。精子发生是一个复杂的过程，小鼠完整的精子发生周期约为35天49,50。本研究所采用的30天YC干预方案未覆盖完整的精子发生周期。因此，未来有必要采用≥35天的干预方案，以系统评估YC在整个精子发生周期中的治疗效果。此外，lncRNA NONMMUT031883.2与QKI-5结合后所引发的精确分子事件，例如QKI-5剪接活性及其亚细胞定位的变化，以及对下游剪接靶标的识别与调控，仍有待进一步探索。尽管YC处理可上调lncRNA NONMMUT031883.2的表达，但其上游转录因子及表观遗传调控机制尚不明确。未来研究需结合启动子分析和染色质免疫沉淀实验，以阐明YC诱导lncRNA NONMMUT031883.2表达的分子基础。此外，未来还应评估YC在化疗相关男性不育患者中的作用，并检测睾丸组织或精液中lncRNA NONMMUT031883.2的表达水平，以确定其作为诊断或治疗标志物的潜在临床价值。

综上所述，YC 上调 lncRNA NONMMUT031883.2 的表达，并抑制 QKI-5/p38 MAPK 通路的活化，从而减少小鼠精原细胞凋亡和睾丸损伤，缓解生精功能障碍。这些发现阐明了 YC 对抗生精功能障碍保护作用的分子机制，拓展了当前对 lncRNA NONMMUT031883.2 和 QKI-5/p38 MAPK 通路在调控精子发生过程中作用的认识。lncRNA NONMMUT031883.2 和 QKI-5 可能成为治疗男性生精功能障碍的潜在治疗靶点。

披露

作者声明不存在任何经济或非经济利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82374257）、江苏省中医院第四批高峰学术人才培育计划（项目编号：k2026yrc74）以及江苏省中医药和中西医结合科研项目（项目编号：CYTF2026019）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
放线菌素DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559用于RNA稳定性检测的转录抑制剂
AMV逆转录酶Takara, Tokyo, Japan2621用于合成互补DNA的酶
Annexin V-APC/PI检测试剂盒BioLab Technology, Beijing, ChinaKFS191用于流式细胞术分析细胞凋亡的试剂盒
抗荧光淬灭封片剂MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042用于荧光保存的封片介质
Bax一抗Affinity Biosciences, OH, USAAF0120用于检测Bax蛋白的一抗
BCA试剂盒Macklin, Shanghai, ChinaB917925用于蛋白质浓度测定的试剂盒
Bcl-2一抗Affinity Biosciences, OH, USAAF0769用于检测Bcl-2蛋白的一抗
牛血清白蛋白BioLab Technology, Beijing, ChinaBTN131070封闭试剂
Calcein/PI检测试剂盒Beyotime, Shanghai, ChinaC2015M用于活细胞/死细胞染色的试剂盒
Caspase-3活性检测试剂盒BioLab Technology, Beijing, ChinaQN2866用于检测caspase-3活性的试剂盒
Caspase-3一抗Abcam, MA, USAab184787用于检测caspase-3蛋白的一抗
CCK-8试剂MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301用于细胞活力评估的试剂
cleaved caspase-3一抗Abcam, MA, USAab32042用于检测切割型caspase-3蛋白的一抗
环己酰亚胺Macklin, Shanghai, ChinaH823111用于蛋白质稳定性检测的蛋白质合成抑制剂
环磷酰胺MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420用于诱导生精功能障碍
DAPI试剂Beyotime, Shanghai, ChinaC1006细胞核复染试剂
DMEM培养基Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302GC-1细胞培养用培养基
ECL工作液Solarbio, Beijing, ChinaSW2030用于蛋白条带化学发光检测的底物
依托泊苷MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629诱导细胞凋亡的试剂
流式细胞仪BD Biosciences, CA, USABD FACSCalibur用于细胞凋亡分析的仪器
FlowJo软件BD Biosciences, CA, USAv10.8用于流式细胞术数据分析的软件
荧光显微镜Leica, Heidelberg, GermanyDM3000用于荧光成像的仪器
荧光标记二抗IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB22303用于免疫荧光检测的二抗
卵泡刺激素ELISA试剂盒Huamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871m用于检测血清卵泡刺激素的试剂盒
GAPDH一抗Affinity Biosciences, OH, USAT0004用于Western blotting的上样对照抗体
GC-1细胞Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302小鼠精原细胞系
凝胶成像系统Jinpeng Analysis Instrument, Shanghai, ChinaJP-2880用于凝胶和印迹可视化成像的系统
凝胶成像系统Invitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500用于Western blot化学发光成像的系统
羊抗兔IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB23303用于Western blotting的二抗
苏木精溶液BioLab Technology, Beijing, ChinaYT165用于组织学分析的细胞核染色剂
盐酸乙醇分化液Beyotime, Shanghai, ChinaC0163S苏木精染色用分化试剂
ImageJ软件National Institutes of Health, USA1.54h用于图像定量分析的软件
免疫沉淀细胞裂解液Beyotime, Shanghai, ChinaP0013用于免疫沉淀和蛋白提取的裂解缓冲液
Ki67一抗Affinity Biosciences, OH, USAAF0198用于检测Ki67蛋白的一抗
LDH细胞毒性检测试剂盒Beyotime, Shanghai, ChinaC0016用于检测乳酸脱氢酶释放和细胞损伤的试剂盒
光学显微镜Olympus, Tokyo, JapanCKX53用于精子计数和形态学观察
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001转染试剂
酶标仪Molecular Devices, CA, USASpectraMax Mini用于吸光度测量的仪器
小鼠黄体生成素ELISA试剂盒Huamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770m用于检测血清黄体生成素的试剂盒
小鼠睾酮ELISA试剂盒Huamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101m用于检测血清睾酮的试剂盒
中性树胶BioLab Technology, Beijing, ChinaQN1253用于组织切片封片的介质
p38一抗Affinity Biosciences, OH, USAAF6456用于检测总p38蛋白的一抗
多聚甲醛MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333用于细胞和组织固定的固定剂
PARIS试剂盒Invitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921用于核与胞质RNA分离的试剂盒
PCR系统ABI, CA, USAABI PRISM 7300实时PCR仪器
p-p38一抗Affinity Biosciences, OH, USAAF3455用于检测磷酸化p38蛋白的一抗
蛋白酶K溶液Beyotime, Shanghai, ChinaST532TUNEL染色前用于组织通透的试剂
PVDF膜Millipore, MA, USAISEQ00010用于Western blotting中蛋白转膜的膜
QKI-5一抗Abcam, MA, USAab126742用于检测QKI-5蛋白的一抗
RNA结合缓冲液Invitrogen, Carlsbad, CA, USA65040D用于RNA-蛋白结合反应的缓冲液
SDS上样缓冲液Beyotime, Shanghai, ChinaP0286用于SDS-PAGE上样的样品缓冲液
链霉亲和素磁珠MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208用于捕获生物素标记RNA探针的磁珠
TB Green FAST qPCR试剂盒Takara, Tokyo, JapanCN830S用于定量PCR的试剂盒
Triton X-100Macklin, Shanghai, ChinaT824275通透试剂
TRIzol试剂Invitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CN用于总RNA提取的试剂
TUNEL检测液Beyotime, Shanghai, ChinaC1086用于检测DNA断裂的试剂
二甲苯Macklin, Shanghai, ChinaX821391用于脱蜡和组织透明的试剂

参考文献

  1. Bhattacharya I, Sharma SS, Majumdar SS. Etiology of male infertility: an update. Reprod Sci. 2024;31(4):942-965.
  2. Dong S, et al. Testicular aging, male fertility and beyond. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1012119.
  3. Wang X, et al. Decoding the pathogenesis of spermatogenic failure in cryptorchidism through single-cell transcriptomic profiling. Cell Rep Med. 2024;5(9):101709.
  4. Stallmeyer B, et al. Inherited defects of piRNA biogenesis cause transposon de-repression, impaired spermatogenesis, and human male infertility. Nat Commun. 2024;15(1):6637.
  5. Szlachcikowska D, Koszła O, Sołek P, Tabęcka-Łonczyńska A. Non-canonical apoptosis mediates oxaliplatin-induced disruption of spermatogenic cells: implications for male fertility. Chem Biol Interact. 2026;431:112009.
  6. Chi YN, et al. Geniposide attenuates spermatogenic dysfunction via .inhibition of endoplasmic reticulum stress in male mice. Chem Biol Interact. 2022;366:110144.
  7. Guo XB, et al. Protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes against the reproductive toxicity of cyclophosphamide is associated with the p38 MAPK/ERK and AKT signaling pathways. Asian J Androl. 2021;23(4):386-391.
  8. Lamb DJ. Chromosome defects and male factor infertility. Fertil Steril. 2025;123(6):933-942.
  9. Kathrins M, Niederberger C. Diagnosis and treatment of infertility-related male hormonal dysfunction. Nat Rev Urol. 2016;13(6):309-323.
  10. Piechka A, et al. Molecular mechanisms of cellular dysfunction in testes from men with non-obstructive azoospermia. Nat Rev Urol. 2024;21(2):67-90.
  11. Li Z, et al. The role of Cistanches Herba and its ingredients in improving reproductive outcomes: a comprehensive review. Phytomedicine. 2024;129:155681.
  12. Jiang X, et al. Shenling Baizhu San improves spermatogenic dysfunction in hyperuricemia mice by regulating Sirt3/Nrf2 to inhibit testicular ferroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;340:119310.
  13. Deng W, Sun D, Cai B, Jin B. Yangjing capsule improves oligoasthenozoospermia by promoting nitric oxide production through the PLCγ1/AKT/eNOS pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1056091.
  14. Zhao H, et al. Yangjing Capsule ameliorates spermatogenesis in male mice exposed to cyclophosphamide. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:980583.
  15. Jin B, et al. Yangjing Capsule improves testicular angiogenesis by activating the VEGFA/eNOS signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:1957267.
  16. Guo W, et al. Chlorocholine chloride exposure induced spermatogenic dysfunction via .iron overload caused by AhR/PERK axis-dependent ferritinophagy activation. Ecotoxicol Environ Saf. 2024;274:116193.
  17. Wang Z, et al. Yangjing Capsule extract promotes proliferation of GC-1 Spg cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:640857.
  18. Zhang P, et al. LncRNA-mediated adipogenesis in different adipocytes. Int J Mol Sci. 2022;23(13).
  19. Núñez-Martínez HN, Recillas-Targa F. Emerging functions of lncRNA loci beyond the transcript itself. Int J Mol Sci. 2022;23(11).
  20. Herman AB, Tsitsipatis D, Gorospe M. Integrated lncRNA function upon genomic and epigenomic regulation. Mol Cell. 2022;82(12):2252-2266.
  21. Wang JZ, et al. QKI-5 regulates the alternative splicing of the cytoskeletal gene ADD3 in lung cancer. J Mol Cell Biol. 2021;13(5):347-360.
  22. Zeng Y, et al. Nickel induces blood-testis barrier damage through ROS-mediated p38 MAPK pathways in mice. Redox Biol. 2023;67:102886.
  23. Luo D, He Z, Yu C, Guan Q. Role of p38 MAPK signaling in testis development and male fertility. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6891897.
  24. Xia C, et al. LncRNA CCAT1 enhances chemoresistance in hepatocellular carcinoma by targeting QKI-5. Sci Rep. 2022;12(1):7826.
  25. Li K, et al. A long noncoding RNA binding to QKI-5 regulates germ cell apoptosis via .the p38 MAPK signaling pathway. Cell Death Dis. 2019;10(10):699.
  26. Zhou X, et al. ANKRD49 inhibits etoposide-induced intrinsic apoptosis of GC-1 cells by modulating NF-κB signaling. Mol Cell Biochem. 2019;457(1-2):21-29.
  27. Fang C, et al. Integrative proteomics and metabolomics approach to identify the key roles of icariin-mediated protective effects against cyclophosphamide-induced spermatogenesis dysfunction in mice. Front Pharmacol. 2022;13:1040544.
  28. Li K, et al. Adeno-associated-virus-mediated delivery of CRISPR-CasRx induces efficient RNA knockdown in the mouse testis. Theranostics. 2024;14(10):3827-3842.
  29. Yi H, et al. Retinoic acid mitigates NSC319726-induced spermatogenesis dysfunction through cuproptosis-independent mechanisms. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):26.
  30. Guo Y, Wang A, Liu X, Li E. Effects of resveratrol on reducing spermatogenic dysfunction caused by high-intensity exercise. Reprod Biol Endocrinol. 2019;17(1):42.
  31. Beeraka NM, et al. Ginsenoside Rh4 suppresses Notch3 and PI3K/Akt signaling to inhibit the growth and metastasis of gastric cancer cells. J Cancer Biomol Ther. 2025;2(1):145-156.
  32. Li P, et al. Proteomic analysis of cisplatin-induced spermatogenesis defects in mice. Ann Med. 2026;58(1):2612816.
  33. Wang Z, et al. Melatonin ameliorates paclitaxel-induced spermatogenesis and fertility defects in mice. J Cell Mol Med. 2022;26(4):1219-1228.
  34. Abdi M, et al. Cyclophosphamide-induced infertility and the impact of antioxidants. Am J Reprod Immunol. 2024;92(6):e70014.
  35. Özbilgin MK, Demirören S, Üçöz M, Oztatlici M. Cyclophosphamide suppresses spermatogenesis in the testes of mice through downregulation of miR-34b and miR-34c. Andrologia. 2021;53(7):e14071.
  36. Poojary KK, et al. Curcumin nanocrystals attenuate cyclophosphamide-induced testicular toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2021;433:115772.
  37. Cao J, et al. Single-cell map of human azoospermic testes caused by cyclophosphamide chemotherapy. Sci Data. 2024;11(1):163.
  38. Dong Y, et al. New insights into polycyclic aromatic hydrocarbons: Phenanthrene targets ribosomes to induce neuronal apoptosis. Aquat. Toxicol. 2026;298:107884.
  39. Wang Y, et al. Interplay between elemental imbalance-related PI3K/Akt/mTOR-regulated apoptosis and autophagy in arsenic (III)-induced jejunum toxicity of chicken. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2018;25(19):18662-18672.
  40. Liu H, et al. Integrating network toxicology, transcriptomics and experimental validation to elucidate the potential mechanisms of fluoride-induced neurotoxicity in zebrafish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2026;306:110549.
  41. Saleh DO, et al. Cyclophosphamide-induced testicular injury: the role of chrysin in mitigating iron overload and ferroptosis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(5):5475-5489.
  42. Dong S, et al. Loss of lncRNAs 1700101O22Rik and 1700027A15Rik causes sperm malformation and subfertility. Andrology. 2025;13(5):1223-1235.
  43. Liu W, et al. A novel meiosis-related lncRNA, Rbakdn, contributes to spermatogenesis by stabilizing Ptbp2. Front Genet. 2021;12:752495.
  44. Sun TC, et al. LncRNAs induce oxidative stress and spermatogenesis by regulating endoplasmic reticulum genes and pathways. Aging (Albany NY). 2021;13(10):13764-13787.
  45. Hua R, et al. DNM3OS enhances the apoptosis and senescence of spermatogonia associated with nonobstructive azoospermia by providing miR-214-5p and decreasing E2F2 expression. Anal Cell Pathol (Amst). 2023;2023:1477658.
  46. Wang S, et al. Quaking 5 suppresses TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition and cell invasion in lung adenocarcinoma. EMBO Rep. 2021;22(6):e52079.
  47. Chen X, et al. The emerging roles of the RNA-binding protein QKI in cardiovascular development and function. Front Cell Dev Biol. 2021;9:668659.
  48. Li J, et al. Qiangjing tablets repair blood-testis barrier dysfunction in rats by regulating oxidative stress and the p38 MAPK pathway. BMC Complement Med Ther. 2022;22(1):133.
  49. Tang Z, et al. MRE11 is essential for the long-term viability of undifferentiated spermatogonia. Cell Prolif. 2024;57(9):e13685.
  50. Jiao Y, Feng Z, Zhang T, Chen X. Impact of Vitamin D(3) Supplementation on Androgens and Semen Parameters in Infertile Men: A Systematic Review and Meta-Analysis Based on Prospective Randomised Controlled Trials. Arch. Esp. 2025;78(6):772-781.

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