本研究比较了乙醇和甲吡唑在甲氨蝶呤预处理的大鼠甲醇中毒模型中的肾保护作用，该模型旨在减少叶酸依赖性的甲酸清除。通过肾功能指标、肾脏损伤生物标志物、炎症标志物、氧化还原相关生物标志物以及组织病理学结果来评估肾脏结局。
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摘要
摘要
甲醇中毒可导致代谢性酸中毒、器官损伤和死亡，其中肾损伤可预测不良预后。本研究在甲氨蝶呤预处理的大鼠甲醇中毒模型中比较了乙醇与甲吡唑的疗效。将30只雄性Wistar大鼠随机分为五组：对照组、甲氨蝶呤（MTX）组、MTX + 甲醇组、MTX + 甲醇 + 甲吡唑组以及MTX + 甲醇 + 乙醇组（每组n = 6）。在第1至7天，通过口服灌胃给予甲氨蝶呤，剂量为0.3 mg/kg/天。三个甲醇暴露组于第8天通过口服灌胃给予3 g/kg甲醇。甲吡唑在甲醇给药后4小时以15 mg/kg剂量腹腔注射，随后在12、24和36小时分别给予10 mg/kg。乙醇在甲醇给药后4小时单次口服灌胃给药，剂量为0.5 g/kg。样本于第10天采集。本研究未预先设定主要终点指标。评估了肾功能、肾脏匀浆损伤指标、炎症生物标志物、血液来源的氧化还原相关生物标志物以及组织病理学结果。方差分析（ANOVA）显示，各组在肾脏匀浆中胱抑素C（p = 0.003）、白细胞介素-6（IL-6；p = 0.013）、肾损伤分子-1（KIM-1；p = 0.017）、血清尿素（p = 0.017）和血清肌酐（p < 0.001）方面存在显著差异。Duncan事后检验显示，两种解毒剂组的上述参数值均低于MTX + 甲醇组。两种解毒剂组之间未发现显著的生化差异。组织病理学评分在解毒剂组中也较低。尽管甲吡唑表现出更有利的趋势性结果，但现有数据尚不足以确立其优于乙醇。异方差性、多重检验、解毒剂方案不一致、缺乏毒代动力学和酸碱平衡参数测量以及随访时间较短等因素限制了结果的解释。未来的研究应包括甲醇和甲酸的直接测定、肾细胞质醇脱氢酶活性检测、与肾脏生化结局的相关性分析、更长的随访时间以及可比的解毒剂治疗方案。
引言
甲醇中毒是一种全球范围内与高发病率和死亡率相关的重要毒理学急症，尤其常见于饮用非法或非正规生产的含醇饮料后。尽管甲醇本身的毒性相对较低，但它主要在肝脏中经由乙醇脱氢酶（ADH）代谢为甲醛，并进一步转化为甲酸；甲酸的蓄积可导致高阴离子间隙代谢性酸中毒、视神经病变以及多器官损伤1,2甲醛是一种短寿命的中间产物，而甲酸蓄积则被认为是通过抑制线粒体细胞色素氧化酶、导致细胞缺氧和氧化应激而引发毒性的主要因素3。早期诊断、纠正代谢性酸中毒、解毒治疗以及血液透析是降低死亡率的主要治疗手段。2.
甲醇中毒的临床表现通常在一段潜伏期后变得明显。患者可能出现恶心、呕吐、腹痛以及轻度中枢神经系统抑制，随后可发展为高阴离子间隙代谢性酸中毒、呼吸困难、意识状态改变以及视觉症状1,2。视觉模糊、畏光、瞳孔散大、视盘水肿，以及在严重情况下出现的永久性失明，是甲酸介导的线粒体细胞色素氧化酶抑制所导致的最具特征性的毒性效应1,2。目前的治疗策略包括支持治疗；使用碳酸氢钠纠正代谢性酸中毒；补充亚叶酸或叶酸；使用乙醇或甲吡唑抑制醇脱氢酶；在部分严重病例中，采用血液透析以加速甲醇和甲酸盐的清除3,4。由于甲吡唑具有更可预测的药代动力学、更简便的给药方案以及更低的不良反应风险，其正日益被视为一线解毒剂；然而，由于乙醇具有更高的可及性和更低的成本，仍是一种重要的替代选择4,5,6,7。
尽管视神经和中枢神经系统损伤传统上被认为是甲醇毒性的主要表现，但肾脏正越来越被认识到是一个具有临床意义的靶器官8,9,10。在特定于甲醇中毒的队列中，急性肾损伤（AKI）与更严重的代谢性酸中毒、呼吸衰竭、多器官功能衰竭、机械通气、体外治疗、更长的住院时间以及更高的院内死亡率相关；容量不足、脓毒症、横纹肌溶解和急性胰腺炎也被确定为与AKI发生相关的因素8,10。在Chang等人报道的队列中，多变量分析显示AKI仍独立地与院内死亡率相关；然而，回顾性观察性研究设计并不能证明AKI本身导致了死亡8。因此，在甲醇中毒中，AKI应被理解为疾病严重程度更高和预后更差的标志。相比之下，Wang等人进行的系统综述更广泛地评估了毒性醇类中毒后的肾脏结局，主要包括甲醇和乙二醇；因此，其结论并非 exclusively 针对甲醇9。该综述发现了显著的短期死亡率，并指出了关于长期肾功能恢复、持续透析以及标准化肾脏结局报告方面的重要证据空白9。
甲醇毒性与急性肾损伤（AKI）之间的关系可能是多因素共同作用的结果。毒性代谢产物的蓄积可能通过抑制线粒体功能、导致细胞缺氧、严重代谢性酸中毒以及氧化还原失衡等机制发挥作用；而在临床队列中观察到的系统性因素——包括容量不足、血流动力学障碍、横纹肌溶解、脓毒症、呼吸衰竭及多器官功能障碍——可能进一步加重肾脏损害1,2,3,8,10。这些通路为甲醇中毒与肾损伤之间提供了生物学和临床上合理的关联。肾脏代谢紊乱可能由循环中甲酸暴露、线粒体抑制、代谢性酸中毒以及全身性血流动力学应激所引起。然而，由于本研究未直接检测肾组织内甲醇、甲醛和甲酸的浓度、肾醇脱氢酶（ADH）活性及线粒体功能，因此酒精和醛类在肾组织内的代谢作用仍不明确。
在甲醇毒性实验研究中，一个主要的方法学挑战是大鼠代谢甲酸的速度比人类快。尽管甲酸蓄积是人类甲醇毒性的主要决定因素，但由于大鼠具有高效的叶酸依赖性甲酸代谢能力，要在大鼠中实现类似的甲酸蓄积及相应的器官损伤更为困难。因此，在甲醇毒性实验模型中常使用抑制叶酸代谢的试剂11,12。通过甲氨蝶呤（MTX）预处理可降低大鼠体内叶酸依赖性的甲酸清除率，从而提高其对甲醇毒性的易感性11,12。甲氨蝶呤本身并不引起甲醇毒性，因此该模型并不能完全复制人类甲醇中毒的所有特征。由于甲氨蝶呤可能独立影响肾脏、氧化应激及炎症反应等结局指标，实验中设立了仅使用甲氨蝶呤的对照组，以明确预处理相关的变化。在上述局限性下，该模型仍为在相同甲氨蝶呤预处理和甲醇暴露方案条件下，比较各实验组间肾脏结局模式，并在生化、炎症、氧化应激和组织病理学水平上评估这些结局，提供了一个可控的临床前研究平台。
抑制乙醇脱氢酶是甲醇中毒解毒治疗的核心。临床上最常用于此目的的两种药物是乙醇和甲吡唑（4-甲基吡唑）。由于乙醇对乙醇脱氢酶（ADH）的亲和力高于甲醇，因此可通过竞争性抑制减少毒性代谢产物的生成；而甲吡唑是一种强效且特异性的ADH抑制剂，可直接阻止甲醇转化为甲醛和甲酸5,6。然而，关于这两种解毒剂在临床疗效、安全性、给药便利性及器官保护作用方面的比较，目前尚无完全一致的共识。许多医疗中心认为甲吡唑具有优势，因其剂量方案标准化、无需监测血药浓度、不引起中枢神经系统抑制，且药代动力学特性更为可预测；相比之下，乙醇治疗可能存在的缺点包括低血糖、肝毒性、精神状态改变以及需要严密监测6,7。相反，大规模临床对比研究提示，这两种解毒剂在降低死亡率和改善临床结局方面的作用可能相似。Zakharov 等人的研究在评估群体性中毒事件时发现，使用甲吡唑与乙醇治疗的患者在生存率方面无显著差异5。
尽管急性肾损伤（AKI）在甲醇中毒中具有重要的预后意义8,9,10，但相较于眼部和神经毒性，肾脏损伤受到的关注明显较少，且乙醇与甲吡唑对肾脏的相对影响仍缺乏充分表征。因此，有必要开展一项以肾脏为重点的评估，结合常规肾功能检测、早期肾小管损伤生物标志物、炎性细胞因子、氧化还原相关参数以及组织病理学分析，以明确这两种解毒策略是否与不同的肾脏结局模式相关。此外，这种经甲氨蝶呤预处理的对照大鼠模型，可在明确的实验条件下促进对候选解毒剂、靶向肾脏干预措施及支持性治疗的临床前评价。该模型的研究价值在于在急性实验环境下进行比较评估，而非直接复制人类甲醇中毒的临床和代谢复杂性。
啮齿类动物与人类在甲醇代谢方面的差异，以及使用药理学预处理以减少叶酸依赖性甲酸清除的方法学局限性，仍然是重要的方法学限制。此外，在实验条件下诱导的急性毒性可能无法充分反映临床实践中遇到的暴露时间差异和合并症情况。因此，该动物模型的研究结果应被视为初步的临床前证据，不应直接用于支持人类的治疗决策。在得出临床推论之前，需要通过设计合理的临床研究加以验证。在此背景下，关键的知识空白在于：在甲氨蝶呤预处理的大鼠模型中，乙醇与甲吡唑是否在常规肾功能指标、肾小管损伤生物标志物、炎症细胞因子、氧化还原相关参数及组织病理学方面表现出不同的肾脏结局模式。研究假设为：使用乙醇或甲吡唑抑制乙醇脱氢酶将与肾损伤减轻相关，并且在不同治疗组之间在各项评估结局领域可能存在差异。肾保护作用在操作上被定义为相较于MTX + 甲醇组更有利的肾脏结局模式。该模式包括：血清尿素和肌酐浓度较低；肾脏中肾损伤分子-1（KIM-1）、胱抑素C、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平较低；血清丙二醛（MDA）浓度较低；血清超氧化物歧化酶（SOD）活性较高，血液还原型谷胱甘肽（GSH）水平较高，血液过氧化氢酶（CAT）活性较高；以及肾小管变性、肾小管坏死、肾小球损伤、血管充血、间质性炎症和纤维化的组织病理学评分较低。肾保护作用未被计算为单一的综合评分；而是综合评估上述互补领域的各项独立结局。因此，本研究旨在比较乙醇与甲吡唑在此模型中对肾功能、肾小管损伤、炎症、氧化还原状态及肾脏组织病理学的影响。
方案
所有实验程序均经克尔谢希尔阿希·埃夫兰大学动物实验地方伦理委员会批准（批准决定编号：1，会议编号：12，批准日期：2025年6月12日），并依照国家和国际关于实验动物护理与使用的指南进行。在整个研究过程中采取了措施，以尽量减少动物的疼痛和痛苦，并使用最少数量的动物。
化学试剂的配制
甲氨蝶呤（Methotrexate）用作预处理试剂，以促进实验性甲醇中毒模型的建立。由于大鼠体内叶酸依赖的甲酸氧化能力比人类更强，因此采用甲氨蝶呤预处理以降低甲酸清除率，增加对甲醇毒性的敏感性；该处理作为模型增敏干预手段，而非甲醇暴露的替代方法11,12。甲氨蝶呤以500 mg/5 mL的制剂形式提供，相当于储备浓度为100 mg/mL。使用无菌0.9%氯化钠溶液将该制剂稀释，获得终工作浓度为0.06 mg/mL的溶液。工作液以5 mL/kg的剂量经口灌胃给药，相当于甲氨蝶呤（MTX）剂量为0.3 mg/kg。对于实验开始时体重为200–220 g的大鼠，每日给药体积为每只动物1.00至1.10 mL，并根据实验开始时记录的体重 individually 计算。在为期7天的甲氨蝶呤预处理期间，不再重新测量体重。甲氨蝶呤每日给药一次，连续给药7天（研究第1–7天），甲醇在完成甲氨蝶呤预处理方案后的第8天给予。该给药方案与既往发表的经口灌胃甲氨蝶呤预处理模型一致13。
甲醇（纯度≥99.8%）在给药当天新鲜配制，通过无菌蒸馏水稀释配成20%（v/v）的水溶液工作液。工作液的配制方法为：将1体积甲醇与4体积无菌蒸馏水混合。根据既往报道的甲氨蝶呤预处理大鼠甲醇中毒模型，于研究第8天通过口服灌胃向第3–5组大鼠单次给予3 g/kg剂量的甲醇。甲醇给药前未实施禁食或禁水。给药体积根据每只动物的体重 individually 计算，20%甲醇溶液的给药体积约为18.9 mL/kg。对于体重约为220 g的大鼠，该剂量相当于0.66 g甲醇，最终灌胃体积约为4.2 mL。选择此甲醇暴露方案是为了与既往发表的甲氨蝶呤预处理大鼠急性甲醇毒性模型保持可比性13,14,15。
将甲醇脱氢酶抑制剂福美司坦工作液用无菌0.9%氯化钠溶液配制，终浓度为10 mg/mL。在给予甲醇后4小时，以15 mg/kg剂量经腹腔注射给予负荷剂量，随后在12、24和36小时分别以10 mg/kg剂量经腹腔注射给予维持剂量。在10 mg/mL的工作浓度下，负荷剂量的给药体积为1.5 mL/kg，每次维持剂量的给药体积为1.0 mL/kg。对于研究起始体重约为220 g的大鼠，负荷剂量约为0.33 mL，每次维持剂量约为0.22 mL。所有给药体积均根据研究开始时记录的体重计算得出。福美司坦的负荷剂量和维持剂量参照已确立的甲醇中毒治疗建议进行选择1,6。
乙醇被用作解毒对照治疗。将无水乙醇（纯度≥99.8%）与无菌蒸馏水按1体积无水乙醇与4体积无菌蒸馏水混合，稀释成终浓度为20%（v/v）的水溶液工作液。在甲醇给药后4小时，通过口服灌胃给予单次剂量乙醇，剂量为0.5 g/kg；未给予维持剂量的乙醇。给药体积约为3.2 mL/kg。对于研究开始时体重约为220 g的大鼠，对应的终末灌胃体积约为0.70 mL。给药体积根据研究开始时记录的体重计算得出。乙醇的浓度、剂量、给药途径和给药时间的选择依据是既往已发表的使用乙醇作为解毒对照的甲氨蝶呤预处理大鼠模型13,14。
所有溶液均在给药当天新鲜配制，并检查其外观是否均匀，以及是否存在可见的颗粒物。口服给药使用不锈钢灌胃套管进行。灌胃过程中，将套管小心地从口腔推进至食管，避免发生反流、口腔泄漏、误吸及呼吸困难。腹腔注射在无菌条件下使用无菌一次性注射器和针头进行。所有与化学品配制和给药相关的操作均按照机构实验室安全规定执行。
实验动物、饲养条件与随机分组
共使用30只成年雄性Wistar白化大鼠，年龄为8–12周，体重为220 ± 20 g，来源于土耳其克尔谢希尔阿希·埃夫兰大学实验动物研究中心。选择Wistar大鼠是因为其在实验性毒性及肾保护研究中已被广泛应用，便于与既往已发表的研究进行比较。动物饲养环境温度为24 ± 2 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。在整个为期10天的实验期间，自由提供标准颗粒饲料和自来水。在开始实验操作前，所有动物均经过7天的适应性饲养期。
采用计算机辅助的随机分配程序将30只大鼠分为5个实验组，每组目标为6只动物。对每只大鼠生成一个1至5之间的随机整数，并将其分配至相应的实验组。一旦某组达到6只动物，任何后续抽中该组的随机数将被舍弃，并重新生成随机数，直至选中尚有空位的组别。此过程持续进行，直到全部30只大鼠均被分配完毕，最终每组各6只动物。由同一名研究人员生成随机分配方案并执行分组操作，未使用独立的分配人员。第1组（对照组）未接受实验药物治疗，动物按与其他组相同的计划终点进行取样。第2组（MTX组）以0.3 mg/kg剂量经口灌胃给予甲氨蝶呤，连续7天。第3组（MTX + 甲醇组）给予甲氨蝶呤治疗7天，随后在第8天以3 g/kg剂量给予甲醇。第4组（MTX + 甲醇 + 范美匹唑组）在甲氨蝶呤预处理后给予甲醇，并于4小时后开始使用4-甲基吡唑治疗。第5组（MTX + 甲醇 + 乙醇组）在甲氨蝶呤预处理后给予甲醇，并于4小时后给予乙醇。
所有接触甲醇的三组均接受了相同的甲氨蝶呤（MTX）预处理和甲醇给药方案，仅在暴露后的解毒治疗方面有所不同。实验分组、给药方案、解毒治疗的时间安排以及样本采集流程详见图1。本研究针对包含五个独立组的固定效应单因素方差分析（one-way ANOVA）进行了预先的统计功效分析。假设标准化效应量较大（Cohen’s f = 0.70），显著性水平为0.05，统计功效为80%，计算得出所需的最小总样本量为30只动物，即每组6只动物。当总样本量为30时，计算得到的统计功效约为80.9%。所假设的效应量（Cohen’s f = 0.70）是在实验前基于研究人员对该急性毒性模型中组间总体效应较大的预期而设定的。该假设基于研究者的专业判断，而非来自预实验数据或特定前期研究的估计值。本研究未预先指定单一主要结局指标；样本量的计算依据是五个实验组之间整体效应较大的假设。主要结局指标不能在事后被追溯性地定义为预先设定的终点。因此，该样本量计算并不能为每个单独的结局指标或两两比较提供足够的统计功效。
甲醇中毒及解毒治疗方案
在适应期结束后，第2至第5组动物在连续7天内每天给予一次甲氨蝶呤（研究第1–7天）。在研究第8天，第3至第5组动物通过口服灌胃给予单次剂量为3 g/kg的20%甲醇溶液。在给予甲醇前，未实施禁食或其他食物或饮水限制。
在MTX + 甲醇 + 甲吡唑组中，于甲醇给药后4小时腹腔注射15 mg/kg的负荷剂量，随后在甲醇给药后12、24和36小时分别给予10 mg/kg的腹腔维持剂量。在MTX + 甲醇 + 乙醇组中，于甲醇给药后4小时通过口服灌胃给予单次0.5 g/kg剂量的乙醇；未给予维持剂量的乙醇。这两种解毒方案的选择依据是已确立的甲吡唑给药推荐方案以及既往发表的乙醇对照方案1,6,13,14。这些方案并非设计为在剂量、给药途径或暴露水平上相匹配的治疗。因此，重复腹腔注射甲吡唑方案与单次口服乙醇剂量构成了一种药理学上的非对等比较。灌胃给药成功通过操作过程中无反流、口腔漏出或呼吸困难来确认。腹腔注射成功则通过注射部位无渗漏、出血或明显肿胀来确认。
给药后，定期监测动物的一般健康状况、活动能力、摄食情况、姿势、毛发外观及毒性迹象。治疗方案的设计旨在允许甲醇代谢产生有毒代谢物，同时能够评估解毒剂的保护和治疗效果。
安乐死、人道终点和样本采集
在整个实验过程中，每天对所有动物的一般健康状况、食物和水的摄入、活动能力及行为变化进行评估。人道终点标准预先定义为明显的嗜睡、无法进食或饮水、严重体重减轻、活动受限、异常姿势、持续竖毛或明显痛苦迹象。符合其中任一标准的动物将实施人道安乐死。然而，在本研究期间，没有任何动物达到预设的人道终点标准。
在实验第10天，五个实验组的所有动物均被实施安乐死。对于MTX + 甲醇组、MTX + 甲醇 + 法莫替丁组以及MTX + 甲醇 + 乙醇组，该时间点对应于实验第8天单次给予甲醇后48小时。对照组在实验第10天前未接受任何处理，而仅给予MTX组则在完成为期7天的MTX给药方案后继续观察至实验第10天。因此，所有五个实验组的总实验周期相同，并在同一实验日进行安乐死及样本采集。
使用氯胺酮和赛拉嗪诱导深度麻醉。通过足底回缩反射消失来确认麻醉深度。达到深度麻醉后，通过心脏穿刺采集血样。使用合适的注射器和针头采集约 3–5 mL 血液。用于测定血清尿素和肌酐浓度、血清超氧化物歧化酶（SOD）活性以及血清丙二醛（MDA）浓度的血液被转移至不含抗凝剂的试管中，并使其完全凝固。用于测定谷胱甘肽（GSH）水平和过氧化氢酶（CAT）活性的血液则单独采集至含有乙二胺四乙酸（EDTA）的试管中，且不经过凝血步骤。待血液完全凝固后，血清样本在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 10–15 分钟。分离后的血清储存于 −80 °C，直至进行分析。通过观察血清是否清晰且无溶血现象，确认血清分离成功。采血后，在深度麻醉下通过放血法实施安乐死。随后行正中腹切口，仔细取出双侧肾脏。去除周围脂肪和结缔组织后，用冷生理盐水冲洗肾脏。将肾组织样本分为两部分，分别用于组织病理学和生物化学分析。用于组织病理学检查的样本置于 10% 中性缓冲甲醛溶液中固定。用于生物化学分析的样本经适当标记后，储存于 −80 °C。
样本采集、生化分析和结果评估均由对实验分组不知情的研究人员完成。所有动物均未被排除在分析之外。
生化分析
采用全自动生化分析仪，通过酶法尿素酶-谷氨酸脱氢酶动力学测定法检测血清尿素浓度。尿素经尿素酶水解生成氨，后者在谷氨酸脱氢酶存在下与2-氧代戊二酸及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）发生反应。通过动力学方法测定NADH消耗引起的吸光度下降。血清肌酐浓度采用同一全自动生化分析仪进行比色法测定。
采用基于黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生超氧阴离子自由基的比色法测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，超氧阴离子与2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四氮唑氯化物反应生成有色甲臜产物。在505 nm处测定终点吸光度。采用硫代巴比妥酸反应法测定血清丙二醛（MDA）浓度。将血清样品与冷三氯乙酸混合以沉淀蛋白质，并在4 °C下以7,500 × g离心5分钟。取上清液与等体积硫代巴比妥酸混合，在90 °C水浴中孵育60分钟。反应管随后在冷水浴中冷却10分钟，在532 nm处测定吸光度。根据相应的标准曲线计算MDA浓度。采用改良的Ellman法测定EDTA抗凝全血中的还原型谷胱甘肽（GSH）含量。在用三氯乙酸沉淀蛋白质后，去蛋白样品与5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)在pH 8.2的500 mM Tris缓冲液中反应，在412 nm处测定吸光度。采用两步比色法测定EDTA抗凝全血中的过氧化氢酶（CAT）活性。样品先与已知量的过氧化氢孵育，待酶促反应终止后，使用显色试剂在405 nm处测定残余过氧化氢含量。
由于SOD活性和MDA浓度是在血清中测定的，而GSH水平和CAT活性则是在EDTA抗凝全血而非肾组织匀浆中测定的，因此无法将这些与氧化还原相关的参数归一化到组织总蛋白浓度。在解读与氧化还原相关的生物标志物谱时，较高的血清MDA浓度被认为与更显著的脂质过氧化一致，而较低的血清SOD活性、血液GSH水平和血液CAT活性则提示抗氧化能力下降；相反方向的变化则被解释为更有利的氧化还原相关谱型。
对于肾组织的酶联免疫吸附测定（ELISA）检测，取约50 mg保存于−80 °C的肾组织，在冰上用500 µL含有蛋白酶抑制剂混合物的匀浆缓冲液进行匀浆，组织与缓冲液体积比固定为1:10（w/v）。每只大鼠单独制备一份特异性的肾组织匀浆液。不同动物的样本独立处理，任何阶段均未混合。匀浆液在4 °C条件下以14,000 × g 离心10分钟，分别收集每只动物的上清液，并分装成若干份用于计划中的肾组织分析。总蛋白浓度未单独测定，因此组织ELISA结果未对其进行标准化校正。根据相应检测特异性的标准曲线计算出的最终浓度，TNF-α和IL-6以ng/L表示，IL-1β、KIM-1和胱抑素C以ng/mL表示。
评估肾损伤分子-1（KIM-1）和胱抑素C作为肾损伤生物标志物，而肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）则作为肾炎症标志物进行评估。所有五种分析物均使用大鼠特异性ELISA试剂盒，按照制造商提供的操作规程在肾组织匀浆中进行测定。对于各项检测，分析灵敏度和检测范围分别为：TNF-α为2.51 ng/L和5–1,000 ng/L；IL-6为0.052 ng/L和0.1–40 ng/L；IL-1β为0.08 ng/mL和0.2–60 ng/mL；KIM-1为0.01 ng/mL和0.05–10 ng/mL；胱抑素C为0.25 ng/mL和0.5–100 ng/mL。在分析前，所有试剂、标准品和肾组织上清液均恢复至室温。根据制造商的建议，每次检测运行时均单独生成标准曲线。将标准品和肾组织上清液加入已包被抗体的微孔板中，随后加入相应的生物素化检测抗体和链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物。样品与ELISA试剂在37 °C孵育1小时。使用自动酶标洗板机洗涤五次后，加入底物溶液A和B，并在37 °C孵育10分钟。通过酸性终止液终止显色反应，并在450 nm处测定吸光度。对于每种分析物，均使用相应检测特异性的标准曲线将空白校正后的吸光度值转换为浓度。
所有生化分析均在标准化条件下进行，所有样本均采用相同的处理程序。肾脏组织的ELISA检测均设置复孔。对于每种分析物，通过计算两个技术重复孔的均值得到单个动物水平的数值。来自同一动物特异性匀浆的技术重复孔及不同等分试样不被视为独立观察值。以单个动物作为实验单位，每项参数仅纳入一个动物水平的结果用于统计分析。
组织病理学处理与肾脏损伤评分
组织样本采用标准组织病理学方法进行显微镜下评估。肾脏组织在室温下用10%中性缓冲甲醛固定72小时。固定后，组织依次经50%、70%、80%、96%和100%梯度乙醇脱水，每个浓度处理1小时。随后，采用二步法二甲苯透明处理，并包埋于石蜡块中。使用旋转式切片机从石蜡块中切取5 µm厚的组织切片。
进行苏木精-伊红染色时，切片经脱蜡和水化后，用苏木精染色5分钟，并在流动的自来水下冲洗5分钟。使用酸性酒精进行分化，随后将切片置于氨水溶液中1分钟。然后用伊红复染2分钟。之后，切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明，并用适当的封片介质封片。
进行马松三色染色时，切片经脱蜡和水化后，在媒染液中56 °C孵育60分钟，并用流水冲洗10分钟。随后，切片依次用韦格特铁苏木精染色10分钟、比布里希猩红-酸性品红染色15分钟、磷钨酸处理10分钟，以及苯胺蓝染色10分钟。最后，切片在1%醋酸中浸泡5分钟，脱水，二甲苯透明，封片。
通过清晰的细胞核染色、保存良好的细胞质对比度、肾组织结构的完整保留以及结缔组织结构的清晰可视化，确认染色成功。所有染色切片均在标准化条件下，使用配备数字成像系统的光学显微镜进行评估。
组织病理学评估由一名经验丰富的病理学家独立完成，该病理学家对实验分组情况设盲。组织病理学评分在200×放大倍数下进行。针对每只动物及每个组织病理学参数，随机选取10个显微视野进行检查。根据每个参数下表现最严重的视野，为该动物在0–4分量表上赋予一个整数评分。肾小管损伤的评估依据包括肾小管扩张、肾小管腔内蛋白质物质积聚、肾小管上皮变性和肾小管坏死。肾小球损伤的评估依据包括肾小球变性或萎缩、鲍曼氏囊腔扩大以及血管充血。间质损伤则基于间质炎症和纤维化程度进行评估。每只动物均采用5 µm厚的苏木精-伊红染色及Masson三色染色的肾组织切片进行组织病理学分析。代表性显微照片在200×放大倍数下拍摄，比例尺表示100 µm。由于研究记录中无法追溯每只动物所检查的独立组织切片数量，因此该数据无法报告。
Masson 三色染色结果通过组织形态学进行解读，重点考虑胶原沉积的定位及其形态学模式，而非仅依据蓝色染色的强度。间质性纤维化评分采用半定量方式，基于上述组织形态学评估，未对胶原阳性区域的百分比进行定量分析。组织病理学评分采用已报道的肾脏损伤评估标准进行半定量分析16,17。每只动物的每一项组织病理学参数均被赋予一个0–4范围内的整数评分，其中0 = 无，1 = 极轻微，2 = 轻度，3 = 中度，4 = 重度。分级类别代表病理学家对每种病变形态学严重程度的整体评估，而非连续的形态测量数据。
安全预防措施与废物管理
处理甲醇、甲醛、二甲苯、生物样本和动物组织时，均使用了适当的个人防护装备。穿戴实验服、手套和眼部防护装置。由于甲醇具有全身毒性和挥发性，所有操作均需谨慎进行。涉及甲醛和二甲苯的步骤尽可能在化学通风橱内操作。锐器收集于专用的锐器处置容器中。化学废物和生物材料依照机构的生物安全和危险废物管理规程进行处置。
统计学分析
连续的生化、肾损伤生物标志物、炎症、肾功能及氧化还原相关变量以均值 ± 标准差（均值 ± SD）表示。采用Shapiro–Wilk检验评估数据分布的正态性，采用Levene检验评估方差齐性。组间生化指标的比较采用单因素方差分析（ANOVA）。假设检验发现，血清肌酐在一个组中偏离正态分布，且多个生化指标存在方差异质性。尽管仍保留了原始的ANOVA方法，但这些偏离可能影响所得p-值的可靠性，因此对结果的解释持谨慎态度。
当方差分析（ANOVA）检测到具有统计学显著性差异时，采用邓肯（Duncan）事后多重比较检验进行组间两两比较。每行中具有相同上标字母的数值之间差异无统计学意义。对于生物化学指标的结果，未进行额外的多重性校正。邓肯法未能对整体I类错误率提供强控制，而对多个结果进行检验进一步增加了假阳性发现的风险。因此，对个别具有统计学意义的比较结果应谨慎解释。
生化结果的总体效应量采用 eta 方（η2）进行估计，计算公式为 (F × df_组间)/(F × df_组间 + df_误差)，其中 df_组间 = 4，df_误差 = 25。双侧 95% 置信区间通过逆向非中心 F 分布计算，并使用 λ/(λ + N) 对非中心性参数界限（λ）进行转换得到，其中 N = 30。这些补充计算在科学计算环境中完成。效应量估计基于主要统计分析中四舍五入后的 F 统计量，因此为近似值。置信区间的计算依赖于方差分析模型的正态性和方差齐性假设，且未对多重结果进行校正。
组织病理学评分是有序的半定量观察结果，以均值±标准差的描述性方式总结，以显示组水平病变负荷的平均值及个体动物间的变异性。未对组织病理学评分进行推论性假设检验或事后两两比较。因此，方差分析（ANOVA）、邓肯事后检验（Duncan’s post hoc test）和p值报告仅应用于生化指标、肾损伤生物标志物、炎症因子、肾功能及氧化还原相关指标的结果。统计学显著性定义为p值 < 0.05。
结果
所有30只动物均被纳入分析，每组实验动物各6只，共五组。五组中的所有动物均在研究第10天实施安乐死并取样。对于三个甲醇暴露组，此终点对应于甲醇给药后48小时。因此，所有实验组的总研究时长和样本采集时间均保持一致。肾损伤与炎症生物标志物、肾功能与氧化还原相关参数以及组织病理学结果均按下文所述方法进行评估。
生化检查结果：肾脏损伤与炎症生物标志物
肾组织匀浆中测得的肾损伤与炎症生物标志物结果如下 表 1单因素方差分析表明，五组间在半胱氨酸蛋白酶抑制剂C上存在显著的整体差异[F(4,25) = 5.329, p = 0.003]、IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013]、KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017], TNF-α [F(4,25) = 7.660, p < 0.001]，以及IL-1β [F(4,25) = 11.584, p < 0.001]。事后组间比较采用 Duncan’s多重范围检验，组别分配以上标字母表示于 表 1肾脏组织匀浆中胱抑素C、IL-6和KIM-1的水平在MTX + 甲醇组中最高，而在对照组、仅MTX组、MTX + 甲醇 + 甲吡唑组以及MTX + 甲醇 + 乙醇组之间，这些变量未观察到显著差异。肾脏组织匀浆中TNF-α 和 IL-1β 甲氨蝶呤+甲醇组的水平也最高。仅使用甲氨蝶呤组显示出更高水平的TNF-α 和 IL-1β 与对照组相比，肾脏组织匀浆中的含量更高，而解毒剂处理组则显示出中间值。表 1).
肾功能与氧化还原相关参数
血清肾功能指标与血液来源的氧化还原相关参数呈现于 表 2单因素方差分析表明，五组间血清尿素存在显著整体差异[F(4,25) = 3.694, p = 0.017]、血清肌酐[F(4,25) = 12.988, p < 0.001]，血清超氧化物歧化酶活性 [F(4,25) = 11.621, p < 0.001]，血液 GSH 水平 [F(4,25) = 10.164, p < 0.001]，血液过氧化氢酶活性[F(4,25) = 10.631, p < 0.001]，以及血清MDA浓度[F(4,25) = 8.814, p < 0.001]。事后组间比较采用 Duncan’s多重比较检验，组别分配以上标字母表示于 表 2.
血清尿素、血清肌酐和血清丙二醛浓度在 MTX + 甲醇组中最高。血清尿素和血清丙二醛浓度在对照组、MTX 单独组、MTX + 甲醇 + 甲吡唑组以及 MTX + 甲醇 + 乙醇组之间无显著差异，而血清肌酐浓度在对照组中最低。表 2).
MTX + 甲醇组也显示出最低的血清SOD活性、血液GSH水平和血液CAT活性。与MTX + 甲醇组相比，甲吡唑治疗组的血清SOD和血液CAT活性显著更高，而乙醇治疗组的相应升高则无统计学意义。仅MTX组、MTX + 甲醇组以及两个解毒剂治疗组之间的血液GSH水平无显著差异。表 2).
与对照组相比，仅使用甲氨蝶呤（MTX）组的肾脏组织匀浆中肿瘤坏死因子（TNF）水平更高。α 和 IL-1β 且血清超氧化物歧化酶活性、血液谷胱甘肽水平及血液过氧化氢酶活性均较低，但在肾脏组织匀浆中的胱抑素C、白细胞介素-6或肾损伤分子-1水平，以及血清尿素、血清肌酐或血清丙二醛浓度方面均无显著差异。
组织病理学发现与肾脏损伤评分
肾组织病理学评估结果呈现于 表 3各组在肾小管扩张、蛋白样物质积聚、肾小管上皮变性、肾小管坏死、肾小球变性以及鲍曼囊扩张方面均观察到描述性差异。’肺泡间隔内可见血管充血、间质炎症及间质纤维化。
在对照组中，肾组织保持了正常的组织学结构，肾小球或肾小管结构未见明显病理改变。在甲氨蝶呤组中，观察到轻度肾小管变性、血管充血及间质炎症。
MTX + 甲醇组在评估的肾小管、肾小球、血管及间质参数中均显示出最高的观察损伤评分。两个解毒剂治疗组的观察评分均描述性地低于MTX + 甲醇组。在描述性比较中，对于大多数参数，特别是肾小管扩张、肾小管坏死、肾小球变性、鲍曼囊扩张，甲吡唑治疗组的观察评分均低于乙醇治疗组。’s空间、血管充血及间质纤维化表 3）。这些比较为描述性分析，未对组织病理学评分进行推断性统计检验。采用苏木精-伊红（H&E）与Masson三色染色法获得的代表性肾脏组织病理学图像’三色染色的结果如图所示 图 2.
总体而言，甲氨蝶呤+甲醇组表现出最高的肾损伤和炎症生物标志物值、最不利的肾功能与氧化还原谱，以及最高的组织病理学损伤评分。两个解毒剂治疗组均显示出比甲氨蝶呤+甲醇组更有利的肾脏结局模式，其中甲吡唑治疗组在所有评估领域均表现出更一致的良好模式。与对照组相比，仅甲氨蝶呤组在选定的炎症和氧化还原相关参数上也显示出变化。
数据可用性：
支持生化、肾损伤生物标志物、炎症、肾功能及氧化还原相关分析的动物个体原始数据已提供于 补充文件 1.
图 1实验设计与处理时间线。 甲醇中毒实验大鼠模型示意图。成年雄性 Wistar 白化大鼠被分为五组：对照组、仅甲氨蝶呤 (MTX) 组、MTX + 甲醇组、MTX + 甲醇 + 甲吡唑组以及 MTX + 甲醇 + 乙醇组（每组 n = 6）。在整个为期 10 天的研究期间，大鼠可自由获取标准颗粒饲料和自来水，在给予甲醇前后均未进行禁食或其他食物或饮水限制。对照组未接受实验处理。第 2 组动物–5只小鼠通过口服灌胃方式接受甲氨蝶呤（MTX）给药，剂量为0.3 mg/kg，每日一次，连续七天（研究第1天至第7天）。–7). 第3组动物–第5组于研究第8天通过口服灌胃给予单次剂量3 g/kg的甲醇。在MTX+甲醇+甲吡唑组中，于甲醇给药后4小时腹腔注射15 mg/kg的甲吡唑负荷剂量，随后在12、24和36小时分别给予10 mg/kg的维持剂量。在MTX+甲醇+乙醇组中，于甲醇给药后4小时通过口服灌胃给予单次剂量0.5 g/kg的乙醇。所有动物均于研究第10天实施安乐死。对于第3组–5，该时间点对应甲醇给药后48小时。采集血液与肾脏样本，用于肾功能、肾损伤生物标志物、炎症细胞因子、氧化还原相关生物标志物及肾脏组织病理学分析。缩写：MTX = 甲氨蝶呤。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2实验组肾组织代表性组织病理学发现。 对照组、MTX组、MTX+甲醇组、MTX+甲醇+甲吡唑组以及MTX+甲醇+乙醇组的代表性肾脏切片如图所示。上方一行展示的是苏木精和伊红（H&E) 染色，而下行则展示马松’三色染色。对照组显示出保留的肾脏结构，具有正常的肾小球和肾小管形态。在对照组的肾小球和肾小管基底膜、血管壁及间质结缔组织中观察到的蓝色染色胶原被视为生理性胶原，而非病理性纤维化的证据。MTX组显示出轻微的肾小管变性、血管充血和炎症变化。MTX+甲醇组表现出更显著的肾损伤，其特征为肾小管变性（*）、血管充血（+）、鲍曼囊’s 空间 (x)、肾小管坏死↑），间质炎症（↕），以及肾小球周围胶原积聚，符合组织形态学纤维化改变（‡正如Masson染色中所观察到的那样’三色染色切片。Fomepizole 处理组显示出比 MTX + 甲醇组更低的组织病理学损伤评分，其肾小管和肾小球结构相对保存较好，坏死、炎症、血管充血和胶原相关变化范围较小。乙醇处理组也显示出比 MTX + 甲醇组更低的组织病理学损伤评分；然而，其残留的肾小管、肾小球和血管改变比 Fomepizole 处理组更为明显。显微照片拍摄于 200 倍放大倍率。× 放大倍率，比例尺代表 100 µm. Masson’三色染色法作为支持性组织形态学证据进行评估；各组间蓝色染色强度的差异未用作纤维化组间比较的定量指标。符号：* 表示肾小管变性；+ 表示血管充血；x 表示鲍曼囊扩张。’s 空间； ↑ 肾小管坏死 ↕ 间质炎症； ‡ 肾小球周围胶原积聚，符合组织形态学纤维化改变。MTX，甲氨蝶呤。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 变量 | 对照组 (n = 6) | MTX (n = 6) | MTX + 甲醇（n = 6） | MTX + 甲醇 + 甲吡唑 (n = 6) | MTX + 甲醇 + 乙醇 (n = 6) | p | η² （95% 置信区间） |
| 胱抑素C (ng/mL) | 26.07 ± 12.05a | 32.01 ± 1.86a | 45.23 ± 10.51b | 32.49 ± 1.60a | 31.27 ± 4.60a | 0.003 | 0.460 (0.084 – 0.597) |
| IL-6 (ng/L) | 7.66 ± 1.38a | 8.72 ± 2.45a | 11.02 ± 0.83b | 7.96 ± 1.54a | 8.12 ± 1.77a | 0.013 | 0.385 (0.023 – 0.535) |
| KIM-1 (ng/mL) | 2.21 ± 1.00a | 2.47 ± 0.24a | 3.45 ± 0.81b | 2.28 ± 0.58a | 2.32 ± 0.37a | 0.017 | 0.370 (0.013 – 0.522) |
| 肿瘤坏死因子-αα (纳克/升) | 118.66 ± 22.95a | 190.51 ± 5.84b | 238.29 ± 34.68c | 147.10 ± 24.31ab | 168.41 ± 75.41ab | <0.001 | 0.551 (0.181 – 0.668) |
| IL-1β (ng/mL) | 8.43 ± 0.59a | 12.53 ± 1.05c | 15.26 ± 1.46d | 10.05 ± 2.86ab | 11.17 ± 2.37bc | <0.001 | 0.650 (0.316 – 0.743) |
表1：实验组中的肾损伤与炎症生物标志物。 数据以平均值表示 ± 标准差 (SD)，每组六只动物。所有生物标志物均在肾脏组织匀浆中测定。胱抑素 C、KIM-1 和 IL-1β 浓度以 ng/mL 表示；IL-6 与 TNF-α 浓度以 ng/L 表示。 p 数值来源于对五个组进行的综合单因素方差分析（ANOVA）。在综合检验结果显著后，使用邓肯法进行事后比较。’多重比较检验。同一行内，共享至少一个上标字母的组别无显著差异，而无共同字母的组别在 0.05 水平上存在显著差异。不同生物标志物之间未进行额外的多重性校正。部分生物标志物间存在方差异质性；因此，对 ANOVA 和 Duncan 检验结果的解读需谨慎。缩写：MTX = 甲氨蝶呤；KIM-1 = 肾损伤分子-1；IL-6 = 白细胞介素-6；TNF-α = 肿瘤坏死因子-α；IL-1β = 白细胞介素-1β；SD = 标准差；ANOVA = 方差分析；CI = 置信区间。 η2 代表五个组间的总体效应量。双侧95%置信区间基于模型计算，假设误差呈正态分布且方差齐性，且未针对多重结局进行调整。因此，当这些假设条件不满足时，应谨慎解读置信区间。
| 变量 | 对照 | MTX | MTX + 甲醇 | MTX + 甲醇 + 甲吡唑 | MTX + 甲醇 + 乙醇 | p | η² (95% CI) |
| 血清尿素 (mg/dL) | 39.64 ± 13.69a | 46.88 ± 9.49a | 98.75 ± 59.24b | 48.03 ± 19.64a | 60.44 ± 18.53a | 0.017 | 0.371 (0.014–0.523) |
| 血清肌酐 (mg/dL) | 0.50 ± 0.10a | 0.54 ± 0.05ab | 0.72 ± 0.03c | 0.54 ± 0.03ab | 0.60 ± 0.05b | <0.001 | 0.675 (0.356–0.762) |
| 血清 SOD 活性 (U/mL) | 470.40 ± 40.49d | 371.16 ± 17.64c | 219.29 ± 85.06a | 319.38 ± 107.20bc | 256.22 ± 67.89一 | <0.001 | 0.650 (0.317–0.743) |
| 血液谷胱甘肽（mmol/L） | 58.74 ± 31.90b | 26.36 ± 5.92a | 11.10 ± 3.73a | 19.56 ± 1.66a | 13.66 ± 5.32a | <0.001 | 0.619 (0.272–0.720) |
| 血液过氧化氢酶活性（U/mL） | 220.82 ± 74.08c | 160.88 ± 55.18b | 68.90 ± 13.41a | 129.45 ± 7.49b | 110.14 ± 20.18ab | <0.001 | 0.630 (0.287–0.728) |
| 血清 MDA (nmol/mL) | 13.17 ± 2.03a | 17.29 ± 6.36a | 31.83 ± 9.94b | 17.93 ± 2.04a | 19.34 ± 4.65a | <0.001 | 0.585 (0.225–0.694) |
表2：实验组肾功能与氧化还原相关参数。 数据以平均值表示 ± 标准差（SD），每组六只动物。在血清中测定血清尿素、血清肌酐、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）浓度，而在用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的血液中测定还原型谷胱甘肽（GSH）水平和过氧化氢酶（CAT）活性。血清尿素和肌酐浓度以 mg/dL 表示，SOD 和 CAT 活性以 U/mL 表示，GSH 水平以 mmol/L 表示，MDA 浓度以 nmol/mL 表示。 p 数值来源于对五组进行的综合单因素方差分析（ANOVA）。在综合检验结果显著后，使用邓肯法进行事后比较。’多重比较检验。在每一行中，共享至少一个上标字母的组别之间无显著差异，而无共同字母的组别在 0.05 水平上存在显著差异。各生物标志物之间未进行额外的多重性校正。部分结果存在方差异质性；因此，对 ANOVA 和 Duncan 检验结果应谨慎解读。氧化还原相关生物标志物为间接指标，不构成对线粒体功能或损伤分子机制的直接测量。 η2 代表五个组间的总体效应量。双侧95%置信区间为基于模型的估计，假设误差呈正态分布且方差齐性，且未针对多重结局进行校正。因此，当这些假设条件不满足时，应谨慎解读置信区间。缩写：MTX = 甲氨蝶呤；SOD = 超氧化物歧化酶；GSH = 还原型谷胱甘肽；CAT = 过氧化氢酶；MDA = 丙二醛；EDTA = 乙二胺四乙酸；SD = 标准差；ANOVA = 方差分析；CI = 置信区间。
| 变量 | 对照 | 甲氨蝶呤 | MTX + 甲醇 | MTX + 甲醇 + 甲吡唑 | MTX + 甲醇 + 乙醇 |
| 肾小管扩张 | 0.16 ± 0.40 | 1.50 ± 0.54 | 3.50 ± 0.54 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 蛋白质物质积累 | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.33 ± 0.51 |
| 肾小管上皮细胞变性 | 0.16 ± 0.40 | 1.83 ± 0.40 | 3.83 ± 0.40 | 1.00 ± 0.00 | 2.00 ± 0.00 |
| 肾小管坏死 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.33 ± 0.51 | 0.83 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 |
| 肾小球变性 | 0.16 ± 0.40 | 1.33 ± 0.51 | 3.33 ± 0.51 | 1.00 ± 0.00 | 1.66 ± 0.51 |
| 鲍曼'空间扩大 | 0.00 ± 0.00 | 1.16 ± 0.40 | 3.00 ± 0.00 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 血管淤血 | 0.00 ± 0.00 | 1.33 ± 0.51 | 3.16 ± 0.40 | 0.83 ± 0.40 | 1.66 ± 0.51 |
| 间质炎症 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 3.00 ± 0.63 | 0.83 ± 0.40 | 1.16 ± 0.40 |
| 间质纤维化 | 0.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 2.83 ± 0.40 | 0.66 ± 0.51 | 1.16 ± 0.40 |
表3：实验组描述性组织病理学评分。 数据以描述性统计形式呈现，均值为 ± 标准差 (SD)，每组六只动物。肾脏切片经苏木精和伊红 (H&E) 染色后获得组织病理学评分。&E) 与 Masson’s trichrome；评分为无量纲值。每只动物针对每个组织病理学参数均被赋予一个整数评分，评分范围为0–4，其中 0 = 无，1 = 轻微，2 = 轻度，3 = 中度，4 = 重度。表中呈现的十进制数值代表每个实验组六只动物个体整数评分的算术平均值，不代表分配给个体动物的评分或一个连续评分系统。标准差代表每组内动物间的变异性。未对组织病理学评分进行推断性统计检验或事后成对比较；因此，观察到的组间模式应进行描述性解读，而非视为具有统计学显著性的差异。组织病理学评估包括肾小管扩张、蛋白样物质积聚、肾小管上皮变性、肾小管坏死、肾小球变性、鲍曼囊扩大’肺泡间隔增宽、血管充血、间质炎症及间质纤维化。
补充文件 1：支持生化分析的原始数据本电子表格包含用于手稿中报告的生化、肾损伤生物标志物、炎症及氧化还原相关分析的动物个体原始数值。 请点击此处下载此文件。
讨论
本研究的主要发现是，MTX + 甲醇组在肾功能、炎症、氧化还原相关指标及组织病理学结果方面的肾损伤表现最为严重。该组血清尿素、血清肌酐、肾组织胱抑素C、KIM-1、TNF-α、IL-6、IL-1β和MDA水平最高，同时SOD活性、GSH含量和CAT活性最低，并且观察到的组织病理学损伤评分也最高。与MTX + 甲醇组相比，两种解毒剂处理组均表现出更有利于肾脏的结果，其中甲吡唑处理组在各项评估指标中表现出更为一致的有利趋势。然而，这些结果来源于一种采用不等效解毒方案的急性MTX预处理大鼠模型：即重复腹腔注射甲吡唑与单次口服乙醇的对比。给药途径和频率的差异限制了对两种解毒剂肾保护效果的直接比较，因此所观察到的结果模式并不能确立甲吡唑优于乙醇。与对照组相比，仅接受MTX处理的组别TNF-α和IL-1β水平升高，SOD活性、GSH含量和CAT活性降低，而肾组织胱抑素C、IL-6、KIM-1、血清尿素、血清肌酐及MDA水平在组间差异无统计学意义。这一模式表明，MTX预处理本身导致了基础性的炎症和氧化还原状态改变。因此，MTX + 甲醇组中观察到的额外变化是在MTX预处理基础上发生的，不能完全归因于甲醇毒性。由于未设置单独甲醇暴露组，甲醇的独立作用以及潜在的MTX与甲醇相互作用尚无法完全区分。
根据已确立的甲醇毒理学机制，毒性代谢产物的蓄积可能是导致肾损伤的合理因素。甲醇主要在肝脏中经乙醇脱氢酶（ADH）代谢为甲醛，随后进一步代谢为甲酸1,3,18,19,20。因此，肾脏可能主要受到循环中甲酸及其引发的全身性代谢紊乱的影响，而非局部肾组织内大量甲醇代谢的直接作用。然而，由于未测定甲醇、甲醛和甲酸的浓度以及肾脏中ADH的活性，尚不能排除肾组织内醇类或醛类代谢的贡献。甲酸可抑制线粒体细胞色素c氧化酶，从而损害氧化磷酸化过程，减少ATP生成，并引发组织毒性缺氧；该过程可能导致乳酸酸中毒、活性氧物质生成增加以及细胞膜损伤1,2,3,19,20。与作为甲醇主要代谢场所的肝脏相比，肾脏可能对甲酸的下游效应及全身性代谢紊乱尤为敏感。近端肾小管上皮细胞具有较高的能量需求，因而特别容易受到线粒体功能障碍、氧化应激和微循环障碍的影响。因此，甲酸介导的缺氧、代谢性酸中毒和炎症反应可能共同促成肾损伤2,8,9,21,22,23。临床研究显示，急性肾损伤与代谢性酸中毒、呼吸衰竭、横纹肌溶解、脓毒症及多器官功能障碍之间存在关联，提示肾损伤可能反映了全身性毒物负荷的影响8,9,10,21。大鼠体内叶酸依赖性甲酸氧化速率较人类更快，这是实验模型的一个重要局限性1,11,12。因此，本研究采用甲氨蝶呤预处理以降低甲酸清除率，增强对甲醇毒性的易感性，而非完全复制人类甲醇中毒的临床和代谢特征。
通过联合评估常规生化参数和肾脏损伤生物标志物，证明了肾功能障碍的存在。MTX + Methanol 组血清尿素和肌酐浓度升高，提示肾小球滤过功能和排泄能力受损。肾组织中胱抑素 C 和 KIM-1 水平升高表明，肾小管损伤伴随功能损害。鉴于 KIM-1 与近端肾小管损伤相关，该升高结果与肾小管上皮变性、扩张及坏死一致24,25。胱抑素 C 水平升高也支持肾功能受损的存在26,27。在甲吡唑和乙醇治疗组中，这些生物标志物水平较低，提示肾损伤得到缓解，其中甲吡唑治疗组表现出更为一致的改善模式。氧化还原相关生物标志物的变化模式提示氧化应激可能参与了肾损伤的发生，但并未提供明确机制的证据。MDA 通常作为脂质过氧化的指标，而 GSH 则参与维持细胞氧化还原稳态28,29。在甲醇中毒及甲醇相关性视神经病变的实验模型中，氧化应激、脂质过氧化以及抗氧化能力下降也与组织损伤相关10,15,20。MTX + Methanol 组血清 SOD 活性降低、血清 MDA 浓度升高以及全血 GSH 水平和 CAT 活性下降，均符合抗氧化能力减弱和脂质过氧化增强的表现；然而，这些检测结果并未阐明潜在的线粒体或分子机制。在解毒剂治疗组中，血清 MDA 浓度降低，血清 SOD 活性和全血 CAT 活性部分恢复，提示氧化还原相关生物标志物谱更为有利，其中甲吡唑治疗组表现出更为一致的有利变化模式。
MTX + 甲醇组中较高的 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平与促炎性肾脏特征一致。由于这些细胞因子并非特定信号通路相关，且 MTX 本身与某些选定炎症标志物的变化相关，因此研究结果支持炎症可能是肾损伤的潜在促成因素，而非已确认的损伤机制。甲酸介导的线粒体功能障碍、细胞缺氧和氧化应激可能为炎症通路的激活提供基础；因此，在甲醇毒性中，氧化应激与炎症可能作为相互促进的过程进展1,2,3,15。甲醇中毒的实验模型已报道甲醇暴露与炎性细胞浸润、组织病理学损伤以及 IL-1β 和 TNF-α 等促炎标志物水平升高之间存在关联13,15。这些发现与 MTX + 甲醇组中观察到的促炎细胞因子水平升高以及间质性炎症、小管变性和小管坏死评分升高结果一致。总体而言，这些发现符合一种多因素参与的过程，涉及毒性代谢物效应、氧化应激、炎症、微循环障碍及全身毒性负荷；然而，这些通路并未被直接评估。解毒剂治疗组中较低的 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平提示，抑制毒性代谢物的生成也可能限制了炎症反应。组织病理学结果提供了肾脏损伤的组织层面证据，MTX + 甲醇组在小管、肾小球、血管及间质等各项参数中均表现出最高的损伤评分。两种解毒剂治疗组的组织病理学损伤评分在描述性上均较低，且在多数参数中，甲吡唑治疗组的评分在描述性上低于乙醇治疗组。然而，由于未对组织病理学评分进行推论性统计检验，因此这些观察结果未能确立任一解毒剂在组织病理学保护效果或优越性方面的统计学显著性16,17。
乙醇和甲吡唑在甲醇中毒中的解毒作用机制基于抑制由乙醇脱氢酶介导的代谢过程，从而减少甲醛和甲酸的生成。乙醇作为竞争性底物发挥作用，而甲吡唑则作为乙醇脱氢酶的直接且强效抑制剂1,3,4,6,7,30,31,32。在两种解毒剂治疗组中观察到的肾功能结局模式均更为有利，这与乙醇脱氢酶抑制的预期效应一致。然而，现有文献并未证实甲吡唑在临床上具有明确优于乙醇的疗效。尽管由于给药更简便、药代动力学可预测以及不良反应谱较低，甲吡唑常被优先选用，但乙醇仍是一种有效的替代方案1,3,4,6,7,30,32。Zakharov 等人报道的大规模甲醇中毒数据显示，两种解毒剂在死亡率、重症监护持续时间或透析需求方面均未表现出明显差异；因此，关于临床优势的结论需持谨慎态度5。通过 Duncan 事后检验，未发现甲吡唑治疗组与乙醇治疗组在生化结局指标上存在具有统计学意义的直接差异。此外，甲吡唑采用重复给药方式，而乙醇则为单次给药，两种方案在给药途径、给药频率或全身暴露水平方面均未匹配。因此，与甲吡唑相关的描述性上更优的结果可能反映了给药方案、给药途径或药物暴露量的差异，而不仅仅是解毒剂本身的差异，故不能据此确立甲吡唑具有更高的生化疗效、临床优势或临床治疗优先性5,6,30,32。本研究的一个主要优势在于整合评估了血清尿素、肌酐、胱抑素 C、KIM-1、促炎性细胞因子、氧化还原相关生物标志物以及组织病理学评分，覆盖了功能、肾小管、炎症、氧化还原相关及结构等多个互补维度。这种以肾损伤为重点的模型可能为评估解毒方案、辅助性肾保护干预措施以及在叶酸依赖性甲酸清除能力降低条件下肾损伤生物标志物提供一个有用的临床前研究框架8,9,10,21。
本研究存在若干局限性，影响了结果的解读。由于采用实验性动物模型以及物种间代谢差异，研究结果直接外推至临床甲醇中毒的情况受到限制。甲氨蝶呤可能独立影响肾脏、炎症及氧化应激相关结局33，而缺乏仅使用甲醇的对照组，导致无法完全区分甲醇本身的效应与甲氨蝶呤–甲醇之间潜在的相互作用。未检测血清或组织中甲醇、甲醛、甲酸、乙醇及甲吡唑的浓度，也未评估粗制肾细胞质组分中的醇脱氢酶（ADH）活性；因此，无法直接验证代谢敏感化、毒性代谢产物的生成、解毒剂暴露情况以及甲醇代谢的抑制效应，也无法进行与肾脏生化结局的相关性分析。未测定酸碱平衡相关指标，包括pH、碳酸氢盐、碱剩余和阴离子间隙。48小时的随访时间仅能评估急性肾脏结局，无法确定肾损伤的恢复情况、持续性、可逆性或慢性结构改变。Masson三色染色仅通过组织形态学进行评估，未对胶原阳性区域进行定量测量，且未检测分子或生化水平的纤维化标志物，包括α-平滑肌肌动蛋白表达、胶原含量和4-羟脯氨酸浓度。由单一位经盲法评估的病理学家进行组织病理学评估，无法评价观察者间的一致性，半定量病变分级仍可能存在观察者依赖性的分类偏差。两种解毒剂治疗方案在药理学上并不等效；肾组织ELISA浓度未根据总蛋白浓度进行标准化；未开展线粒体功能和细胞死亡通路的分子分析；样本量有限；且仅纳入雄性大鼠。未来的研究应纳入仅使用甲醇和仅使用甲氨蝶呤的对照组，采用可比的解毒剂治疗方案，进行甲醇、甲酸及解毒剂浓度的系列检测，评估肾组织ADH活性，测定酸碱平衡指标，实施定量纤维化评估，延长随访时间，并设计适当的临床验证研究。总之，在该甲氨蝶呤预处理的大鼠模型中，甲醇暴露与肾功能受损、肾损伤及炎症生物标志物升高、不利的氧化还原相关谱型以及组织病理学损伤相关。与甲氨蝶呤+甲醇组相比，两种解毒剂治疗组均表现出更有利的肾脏结局模式。在各项评估指标中，甲吡唑组呈现出更为一致的有利描述性趋势；然而，由于解毒剂组之间缺乏显著的直接生化差异、组织病理学比较为描述性性质、解毒剂方案不等效，以及缺乏毒代动力学数据，因此无法得出甲吡唑优于乙醇的结论。这些发现仅适用于甲氨蝶呤预处理的大鼠模型，不能推断在无甲氨蝶呤预处理的情况下甲醇暴露后任一解毒剂的肾脏效应，也不适用于人类甲醇中毒。需要进一步研究，纳入直接的毒代动力学测量、机制性评估、可比的解毒剂给药方案以及更长的随访时间，以评估这些发现的可重复性及更广泛的适用性。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。在撰写本文稿过程中，仅使用人工智能辅助工具进行语言编辑和语法校正。未使用任何人工智能工具生成、分析或解释数据，也未用于创建任何图表、表格或图形元素。作者对文稿内容承担全部责任。
致谢
本研究由克尔谢希尔阿希·埃夫兰大学科研项目协调处资助（项目编号：TIP.A3.26.011）。资助机构在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释以及论文撰写过程中均未参与。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Merck | 未记录 | 用于组织病理学处理的组织固定。 |
| 无水乙醇（≥99.8%） | Sigma-Aldrich, USA | 未记录 | 用无菌蒸馏水稀释，配制成终浓度为20%（v/v）的溶液；在甲醇给药后4小时，以0.5 g/kg的单次剂量经口灌胃给药。 |
| 台式离心机 | Nüve | NF048 | 样品制备与离心。 |
| 生物素标记抗体 | BT Lab ELISA试剂盒组分 | 包含在试剂盒中 | 检测抗体 |
| CAT（过氧化氢酶）试剂盒 | Otto Scientific | Otto3051 | 比色法测定EDTA抗凝血中过氧化氢酶（CAT）活性。 |
| cOmplete Mini EDTA-free蛋白酶抑制剂混合液 | Roche / Sigma-Aldrich | 11836170001 | 在制备用于ELISA分析的肾组织匀浆时，加入匀浆缓冲液中。 |
| 肌酐试剂盒 | Otto Scientific | OttoBC139 | 血清肌酐水平的评估。 |
| 数显匀浆器 | Daihan Scientific | HG-15D | 组织匀浆 |
| ELx50自动洗板机 | Bio-Tek Instruments, USA | ELx50 | ELISA洗涤 |
| ELx800酶标仪 | Bio-Tek Instruments, USA | ELx800 | ELISA和比色法检测的吸光度测定；ELISA吸光度在450 nm处读取。 |
| 伊红Y（微黄色） | Merck | 1.15935.0025 | 组织病理学染色 |
| 甲吡唑（4-甲基吡唑） | Hüsnü Arsan  A. ., 安卡拉, Türkiye | 未记录 | 用无菌0.9%氯化钠溶液配制成终浓度为10 mg/mL的溶液；在甲醇给药后4小时，以15 mg/kg的负荷剂量腹腔注射，随后在甲醇给药后12、24和36小时分别给予10 mg/kg的维持剂量。 |
| GSH（谷胱甘肽）试剂盒 | Otto Scientific | Otto3053 | 比色法测定EDTA抗凝血中还原型谷胱甘肽（GSH）水平。 |
| 哈里斯苏木精溶液 | BSLAB | BS-002 | 组织病理学染色 |
| 盐酸（HCl） | Merck | 7647-01-0 | pH调节 |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corp. | IBM SPSS Statistics Version 29.0 | 统计分析；RRID:SCR_016479。 |
| 盐酸氯胺酮（Ketalar） | Pfizer,USA | 未记录 | 采血和肾组织采集前的全身麻醉。 |
| 光学显微镜 | Nikon Eclipse | Ni-U | 组织病理学检查 |
| 马松三色染色试剂盒 | MOSLAB（Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türkiye） | BKMTO001 | 组织病理学染色 |
| MDA（丙二醛）试剂盒 | Otto Scientific | Otto1001 | 比色法测定血清中丙二醛（MDA）水平，作为脂质过氧化的指标。 |
| 甲醇（≥99.8%） | Sigma-Aldrich, USA | 322415 | 口服给药（3 g/kg），用于诱导实验性甲醇中毒。 |
| 甲氨蝶呤（Emthexate 500 mg/5 mL） | Teva Pharma Belgium | 未记录 | 将市售100 mg/mL制剂用无菌0.9%氯化钠溶液稀释，获得终工作浓度为0.06 mg/mL的溶液；以5 mL/kg剂量经口灌胃给药，相当于0.3 mg/kg，每日一次，连续7天。 |
| 迈瑞生化分析仪 | Mindray | BS-400 | 血清尿素和肌酐的测定。 |
| 石蜡，组织学级 | 未记录 | 未记录 | 组织包埋。 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Merck | P4417 | 组织冲洗/洗涤 |
| 大鼠胱抑素C ELISA试剂盒 | BT Lab, 中国 | E0145Ra | 肾组织匀浆中胱抑素C水平的定量；分析灵敏度为0.25 ng/mL；检测范围为0.5–100 ng/mL。 |
| 大鼠IL-1β ELISA试剂盒 | BT Lab, 中国 | E0119Ra | 肾组织匀浆中IL-1β水平的定量；分析灵敏度为0.08 ng/mL；检测范围为0.2–60 ng/mL。 |
| 大鼠IL-6 ELISA试剂盒 | BT Lab, 中国 | E0135Ra | 肾组织匀浆中IL-6水平的定量；分析灵敏度为0.052 ng/L；检测范围为0.1–40 ng/L。 |
| 大鼠KIM-1 ELISA试剂盒 | BT Lab, 中国 | E0549Ra | 肾组织匀浆中KIM-1水平的定量；分析灵敏度为0.01 ng/mL；检测范围为0.05–10 ng/mL。 |
| 大鼠TNF-α ELISA试剂盒 | BT Lab, 中国 | E0764Ra | 肾组织匀浆中TNF-α水平的定量；分析灵敏度为2.51 ng/L；检测范围为5–1,000 ng/L。 |
| RIPA裂解与提取缓冲液 | Thermo Scientific | 89900 | 用于ELISA分析的肾组织匀浆与裂解。 |
| SOD（超氧化物歧化酶）试剂盒 | Otto Scientific | Otto3047 | 比色法测定血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性。 |
| 柠檬酸钠 | Merck | 03-04-6132 | 缓冲液配制 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Merck | 1310-73-2 | pH调节 |
| 不锈钢喂养针（22 G 口服灌胃套管） | Instech Laboratories, USA | 未记录 | 可重复使用的不锈钢套管，用于大鼠的口服灌胃给药。 |
| 终止液 | BT Lab ELISA试剂盒组分 | 包含在试剂盒中 | ELISA反应终止 |
| 链霉亲和素过氧化物酶 | Thermo Scientific | SHRP248-B | ELISA检测系统 |
| TMB底物溶液 | BT Lab ELISA试剂盒组分 | 包含在试剂盒中 | 显色底物 |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | 缓冲液配制 |
| 尿素试剂盒 | Otto Scientific | OttoBC157 | 血清尿素水平的测定。 |
| 洗涤缓冲液浓缩液 | BT Lab ELISA试剂盒组分 | 包含在试剂盒中 | 板孔洗涤 |
| Wistar白化大鼠 | 阿希雷万大学实验动物研究中心， ，Türkiye | 繁殖/生产许可证编号 184 | 雄性；8–12周龄；体重为220 ± 20 g |
| 盐酸赛拉嗪（Rompun） | Bayer, Germany | 未记录 | 采血和肾组织采集前的全身麻醉。 |
| 二甲苯，组织学级 | 未记录 | 未记录 | 组织学组织处理与透明化。 |
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