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标准化的人类粪便样本采集与使用磁性颗粒处理器进行自动化脱氧核糖核酸提取的工作流程

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2026年9月11日

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1Gut Microbiome Division, SKAN Research Trust, 2Stem Cells Division, SKAN Research Trust

本文内容

摘要

本方案的目的是标准化使用磁性颗粒处理器进行人类粪便样本采集和自动化脱氧核糖核酸提取的操作流程。

摘要

肠道微生物组测序已成为研究健康与疾病状态下微生物群落动态的重要方法。微生物组成的改变已被证实与多种生活方式和年龄相关疾病相关，包括糖尿病、白血病以及神经退行性疾病。由于不同微生物具有独特的生理特征和环境需求，标准化的粪便样本采集、运输和处理对于保持样本完整性并最大限度减少技术变异至关重要。分析前处理及脱氧核糖核酸（DNA）提取过程中引入的差异可能影响后续微生物组分析，并干扰数据解读。本方案旨在提供一种标准化的人类粪便样本采集及自动化DNA提取工作流程，使用MagMAX Microbiome Ultra核酸分离试剂盒（核酸提取试剂盒）和KingFisher Flex系统（自动化磁性颗粒处理器）。该工作流程将受控的样本处理与自动化核酸提取相结合，以减少人工操作带来的变异，提高操作一致性。本方案涵盖粪便样本的标准化采集、储存、制备、自动化提取以及从复杂粪便基质中回收核酸的全过程。代表性结果表明，成功提取了适用于下游应用的DNA，包括16S核糖体核糖核酸（rRNA）基因测序和宏基因组鸟枪法测序。该标准化工作流程支持可重复的样本处理，便于微生物组研究的规模扩展，并促进不同实验间更高程度的一致性。视频演示为实施标准化粪便样本处理和自动化核酸提取提供了实用指导，适用于肠道微生物组研究。

引言

肠道微生物组是一个复杂的微生物生态系统，影响宿主的代谢、免疫和神经功能，并且与多种疾病的关系日益密切，包括代谢紊乱、帕金森病、癌症和神经退行性疾病1,2。它通过影响代谢、免疫功能、营养吸收以及对致病微生物的抵抗，在维持宿主生理功能中发挥重要作用3,4。可靠且可重复的微生物组测量对于将这些关联转化为机制性认识和临床应用至关重要。下一代测序（NGS）技术的进步极大地推动了我们对胃肠道内复杂微生物群落的理解。然而，分析前的变量，如粪便样本采集方法、储存条件、处理方式、运输过程以及脱氧核糖核酸（DNA）提取方法，可能选择性地改变微生物群落结构、DNA 产量和测序结果5,6。此类方法学上的不一致常常使不同研究之间的比较变得复杂。

在所有关键的分析前步骤中，DNA 提取是决定微生物组数据质量的最重要因素之一7,8。理想的提取方案应能在大量样本中持续提取出高质量、高分子量的 DNA，并将污染降至最低。自动化的核酸提取平台可提高实验的可重复性，减少人为操作误差，降低污染风险，并提升处理通量。这些自动化提取平台的性能在很大程度上取决于实验方案参数，包括样本均质化、珠磨条件、裂解化学试剂、孵育条件以及磁珠操作9,10。因此，建立一个将粪便样本统一采集与自动化 DNA 提取相结合的标准化操作流程，对于生成可靠且可重复的微生物组数据集至关重要。

本文介绍了一种标准化的人类粪便样本采集、处理及使用上述核酸提取试剂盒和自动化磁性颗粒处理器进行自动化DNA提取的工作流程。该方案强调对样本处理过程的严格控制、高效的机械和化学裂解、抑制物去除以及适用于下游应用的质量控制措施，这些下游应用包括16S核糖体核糖核酸（rRNA）基因扩增子测序、全基因组测序、定量聚合酶链式反应（PCR）以及鸟枪法宏基因组测序。视频演示为标准化粪便样本处理和自动化核酸提取提供了实用的操作指导，以支持可重复且可扩展的肠道微生物组研究。

方案

本研究严格遵循 SKAN 研究基金会机构伦理委员会的指南，并已获得该委员会批准（批准号：SKAN/IEC/2025/04）。在采集样本前，已从所有参与者处获得书面知情同意书。

注意：所有试剂、耗材和设备均列于材料表中。

1. 组装粪便样本采集套件

  1. 准备一个粪便样本采集套装，包含无菌粪便采集器、带附着刮勺的无菌螺口采集管（容量 30–50 mL）、预装稳定化缓冲液的采集管、一次性手套、吸水材料、贴有生物危害标识的可密封运输袋，以及一份说明手册（图1）。
  2. 使用永久性记号笔或预印标签，在每个采集管上标注唯一的样本编号、采集日期和采集时间。
  3. 附上一份说明手册，描述样本采集流程、操作注意事项、储存条件和运输要求。
    ​注意：稳定化缓冲液作为粪便采集套装的一部分，已预先装填在粪便采集管中。制造商未公开该缓冲液的成分和体积。根据制造商的说明，直接将约 2–5 g 粪便样本采集至预装缓冲液的采集管中。

粪便样本采集套件，包含手套、采样管、生物危害袋、接粪器和用于分析的说明书。
图1．粪便样本采集套件的组成部件。 
粪便样本采集套件包括一次性手套、无菌接粪器、带附着刮勺的无菌螺旋盖粪便采集管、贴有生物危害标识的可密封运输袋，以及提供给参与者的操作说明书，用于指导粪便样本的采集、处理、储存和运输。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 准备受试者以进行样本采集

  1. 指导受试者在采集样本前洗手。
  2. 指导受试者在排便前先排空膀胱，以避免尿液污染粪便样本。

3. 使用粪便采集器收集粪便样本

  1. 将无菌粪便采集器放置在马桶座圈上，以防止粪便样本与马桶水接触。
  2. 对于带有粘性的粪便采集器，应沿标示的边缘小心展开，避免撕裂。按照粪便采集器附带的制造商说明，将其牢固地固定在马桶座圈后部，以形成稳定的采集表面。
  3. 对于无粘性的粪便采集器，应根据制造商说明将其置于马桶内，确保提供稳固支撑。
  4. 确保在样本采集过程中，粪便采集器不与马桶水接触。
  5. 指导受试者直接在粪便采集器上完成排便。
  6. 在处理样本前，戴上采集套件中提供的一次性手套。
  7. 打开无菌采集管，使用附带的刮勺从粪便的至少四个至五个不同区域（包括外表面和内部核心）采集粪便物质。该方法通常可获得约 2–5 g 的粪便样本，足以用于 DNA 提取。
  8. 避免采集已接触粪便采集器边缘或任何外部表面的粪便物质。
  9. 样本采集后应立即牢固地盖紧采集管。
  10. 通过剧烈手动振荡密闭的采集管，使粪便样本与稳定液充分混合，直至样本均匀悬浮且无大块残留。
  11. 将密封的采集管放入带有吸水材料、贴有防泄漏生物危害标签的密封运输袋中。
  12. 小心将粪便采集器连同粪便一起投入马桶，确保内容物不溢出，然后冲水将粪便采集器和粪便一同处理掉。

4. 粪便样本的保存与运输

  1. 根据所使用的稳定缓冲液的说明保存样本。
  2. 如果稳定缓冲液支持常温保存，则将样本置于室温下保存；否则，短期保存（≤24–48 小时）应将样本置于 4°C，长期保存则应置于 −20°C 至 −80°C。
  3. 按照生产商的建议保存样本。本研究所使用的稳定缓冲液采集的样本在室温下可稳定保存长达 2 年。
  4. 将样本置于含有吸水材料的防漏生物危害袋中运输，以防止泄漏和污染。
  5. 运输过程中应维持样本在推荐的温度条件下。必要时使用隔热容器和冷却装置。
  6. 确保遵守机构生物安全指南以及适用于生物样本运输的当地法规。

5. 接收并记录样本

  1. 样本收到实验室后，应逐一检查标签是否正确、试管是否完整，以及有无泄漏迹象。
  2. 如需分配实验室特异性编号，应记录样本采集日期与时间、储存条件及运输时长。
  3. 排除出现泄漏、标签不当或完整性受损的样本。

6. 准备培养皿

注意：在开始提取流程之前，需预先准备好所有培养板。所有涉及试剂和生物样本的操作步骤均须在洁净环境中进行，并穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和眼部防护用具。 图2 显示自动磁性颗粒处理器（图2A），平板加载位置（图2B），深孔板适配器（图2C），可与培养板兼容的离心机（图2D），珠击仪（图 2E），缓冲支撑（图2F），培养皿架（图2G），96孔珠板（图 2H)，深孔板（图 2I）和洗脱板（图2J).

用于样品制备和分析的实验室设备装置，包括离心机和组织研磨仪。
图 2．用于自动化粪便脱氧核糖核酸（DNA）提取的设备和耗材。 
（A）自动化磁性颗粒处理仪。（B）自动化磁性颗粒处理仪内的板加载位置。（C）用于离心的深孔板适配器。（D）可兼容板的离心机。（E）珠磨式均质器。（F）珠击打过程中使用的缓冲支撑。（G）用于珠击打的深孔板支架（适配器）。（H）核酸提取试剂盒配套提供的96孔珠板。（I）96孔深孔板。（J）96孔洗脱板。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 从包装中取出吸头梳板，并准备好用于仪器加样。
  2. 准备洗脱板（图2J），向96孔板的每个孔中加入200 µL核酸提取试剂盒提供的洗脱缓冲液。使用透明粘性封膜密封板子，以防止污染。在将板子装入自动磁性颗粒处理仪之前保持密封状态。将该板标记为洗脱板。
  3. 通过向深孔板的每个孔中加入1 mL 80%乙醇，制备洗涤板4。用粘性封膜密封板子，以防止蒸发和污染。
  4. 通过向另一个深孔板的每个孔中加入1 mL新配制的80%乙醇，制备洗涤板3。用粘性封膜密封板子。
  5. 通过向深孔板的每个孔中加入1 mL洗涤缓冲液，制备洗涤板2。用粘性封膜密封板子。
  6. 通过向深孔板的每个孔中加入1 mL洗涤缓冲液，制备洗涤板1。用粘性封膜密封板子。

7. 设置自动化磁性颗粒处理器

  1. 开启自动化磁性颗粒处理器。确认已安装正确的96深孔磁性头和96孔深孔加热模块。
  2. 在处理样本前，使用洁净的吸头梳和一个兼容的空孔板运行相应的仪器检查程序（例如，Check_96dw_tip程序）。
  3. 确认自动化磁性颗粒处理器上已加载所需的提取程序。
    注意：使用不正确的磁性头或加热模块可能导致核酸得率降低，并损坏仪器。

8. 进行样品裂解

  1. 准备一个板图，用于记录每个样本在96孔板中的位置。
  2. 使用与板兼容的离心机（图2D）和适配器（图2C），以2,750 × g 离心96孔珠板（图2H）10秒，使磁珠沉降至各孔底部。
    注意：此步骤可防止在移除板封膜时造成磁珠损失。
  3. 小心移除板封膜，避免扰动磁珠。
  4. 向珠板的每个孔中加入800 µL裂解缓冲液。
  5. 移液过程中避免吸走磁珠。
  6. 将冷冻的粪便样本在室温下解冻至完全融化。轻轻混匀样本以实现均质化，并立即进行DNA提取。避免反复冻融，因其可能降低DNA的质量和得率。
    注意：对于新鲜样本，将含有稳定溶液的每个粪便样本管涡旋振荡5–10秒，以确保样本充分均质化。
  7. 将每个均质化样本的200 µL转移至珠板中对应的孔内。
  8. 使用配备无菌过滤宽口（剪切）吸头的单通道移液器进行样本转移。避免反复吹打，以尽量减少磁珠损失及后续DNA得率的降低。
  9. 用粘性封膜严密密封板孔，确保所有孔和板边缘均完全密封。

9. 进行机械裂解（珠击裂解）

  1. 使用适当的板架（图 2E）、缓冲支撑（图 2G）和减震垫（图 2F），将密封的板固定在珠磨仪中。
  2. 在样品板的对侧放置一块重量相同的板，以平衡仪器。
  3. 将仪器设置为 30 Hz，运行 2 分钟，并启动运行。
  4. 运行过程中保持连续操作，不得中断。
  5. 运行结束后，小心取出板，避免破坏密封。
    注意：使用缓冲支撑以防止珠磨过程中对板造成损伤。

10. 进行裂解后处理

  1. 使用平衡配置，将板在室温下以 2,750 × g 离心 5 分钟。
  2. 小心地将每孔上清液中的 400 µL 转移至一个新的深孔板，该板标记为样品板。
  3. 此步骤中避免转移任何磁珠。
    注意：样品板不含磁珠，无需预先离心。
  4. 若不立即进行后续操作，请密封样品板。
    注意：如有必要，可将密封的裂解液板在 4°C 下保存过夜；或者将密封的样品板在 −20°C 下保存长达 3 个月。使用前将样品恢复至室温后再进行后续处理。

11. 准备结合珠混合物

  1. 使用前立即配制结合磁珠混合液，每份样本将 500 µL 核酸结合缓冲液与 20 µL 磁珠混合。充分混匀，得到均一的悬浮液。
  2. 根据样本数量计算所需结合磁珠混合液的总体积。
  3. 对于完整的 96 孔板，将 48.00 mL 核酸结合缓冲液和 1.92 mL 磁珠加入无菌锥形管中配制结合磁珠混合液。充分混匀，得到终体积为 49.92 mL 的混合液（每孔 520 µL）。
    注意：建议额外多准备一至两孔的用量，以补偿移液过程中的体积差异。
  4. 轻轻颠倒混匀结合磁珠悬浮液，直至形成均一体系。
  5. 将结合磁珠混合液转移至洁净的试剂储液槽中。
  6. 在分装前立即用移液器将悬浮液上下吹打三至四次，使磁珠重新悬浮，防止沉降。
  7. 使用多通道移液器将 520 µL 结合磁珠混合液加入已准备好的样本板的每个孔中。
  8. 由于溶液黏度较高，移液时应缓慢操作，避免产生气泡。每次分装前，轻轻重悬试剂储液槽中的结合磁珠混合液，以确保所有孔间的磁珠分布均匀。

12. 修改 MagMAX_Microbiome_Stool_Flex 仪器程序（修改后的提取程序）

  1. 根据制造商的说明下载并安装 BindIt 软件（实验方案编辑软件）。
  2. 从制造商网站下载仪器程序。
  3. 启动实验方案编辑软件，并等待其完成初始化。
  4. 点击“打开”，选择已下载的仪器程序。
  5. 按照 表 1 中的描述修改实验方案参数。
  6. 保存修改后的实验方案，然后关闭软件。
  7. 使用 USB 或 RS-232C 串行电缆将计算机连接至全自动磁性颗粒处理器。
    注意：在连接计算机前，务必确保全自动磁性颗粒处理器处于关闭状态。
  8. 打开全自动磁性颗粒处理器，并等待其完成初始化。
  9. 启动实验方案编辑软件，确认其能够检测到全自动磁性颗粒处理器。
  10. 将修改后的提取程序传输至全自动磁性颗粒处理器。
  11. 确认修改后的提取程序已成功传输，然后关闭全自动磁性颗粒处理器。
步骤操作参数
1结合混匀；5 次收集循环；37°C
2收集磁珠5 次磁力收集循环
3洗涤 1混匀 20 秒 × 3 次循环；37°C
4洗涤 2混匀 20 秒 × 3 次循环；37°C
5洗涤 3混匀 20 秒 × 2 次循环；37°C
6洗涤 4混匀；1 次循环；37°C
7干燥室温干燥 2 分钟
8洗脱75°C；6 次混匀循环；启用预加热
9收集磁珠3 次磁力收集循环
10转移洗脱液将纯化的核酸转移至洗脱板

表1：磁性颗粒处理器的自动化提取程序。
本表总结了自动化磁性颗粒处理器在脱氧核糖核酸（DNA）提取过程中执行的自动化提取程序。该程序包括核酸结合、磁珠收集、依次洗涤步骤、空气干燥、洗脱以及将纯化的DNA转移至洗脱板。各自动化步骤的操作参数均已列出。

13. 进行自动化核酸提取

  1. 通过打开主电源开关，然后按下仪器电源按钮，启动全自动磁性颗粒处理器（图2A）。等待系统完成初始化。
  2. 使用仪器控制面板选择修改后的提取程序，并启动运行。
  3. 当系统提示时，将吸头梳板装入位置7，然后按下“开始”继续。有关板位加载位置，请参见表2（图2B）。
  4. 移除洗脱板上的密封膜，将其装入位置6，确保方向正确（A1孔与指定位置对齐）。按下“开始”继续。
  5. 移除含有80%乙醇的洗涤板4上的密封膜，将该板以正确方向装入位置5，然后按下“开始”。
  6. 移除含有80%乙醇的洗涤板3上的密封膜，将该板装入位置4，然后按下“开始”。
  7. 移除洗涤板2上的密封膜，将该板装入位置3，然后按下“开始”。
  8. 移除洗涤板1上的密封膜，将该板装入位置2，然后按下“开始”。
  9. 当系统提示时，将样本板装入位置1，确保方向正确。
  10. 关闭仪器盖板，然后按下“开始”，启动自动提取程序。
  11. 让程序持续运行直至完成（约35–40分钟）。
    注意：表1总结了仪器执行的自动提取程序。
板位置板类型试剂每孔体积
样本板196深孔板样本裂解液 + 结合珠混合液920 µL
洗涤板 1296深孔板洗涤缓冲液1,000 µL
洗涤板 2396深孔板洗涤缓冲液1,000 µL
洗涤板 3496深孔板80% 乙醇1,000 µL
洗涤板 4596深孔板80% 乙醇1,000 µL
洗脱板696孔板洗脱缓冲液200 µL
吸头梳板7标准深孔板96深孔吸头梳N/A

表2：自动核酸提取的板加载配置。
使用磁性颗粒处理仪进行自动DNA提取时的板加载位置、板类型、试剂及试剂体积。样本板包含样本裂解液与结合磁珠的混合物。N/A 表示未向移液头梳板中添加任何液体试剂。

​14. 洗脱并储存核酸

  1. 运行结束后打开仪器，小心取出洗脱板，避免洒出洗脱液。
    注意：如果在洗脱板中可见磁珠残留，将洗脱液转移至标准的96孔板中，并将该板置于磁力架上静置5–10分钟。使用多通道移液器将澄清的上清液转移至新的96孔板或适当标记的管中。
  2. 将洗脱得到的DNA转移至适当标记的管或储存板中。
  3. 洗脱的DNA若需短期使用，可保存在4°C；若需保存不超过6个月，应置于−20°C；如需长期保存，则应置于−80°C。

15. 执行运行后清理

  1. 从自动磁性颗粒处理器中移除所有已使用的微孔板和移液管头梳。
  2. 根据机构的生物安全和化学废弃物处理指南，处置所有耗材。
  3. 使用适当的实验室消毒剂清理任何溢出物。
  4. 关闭自动磁性颗粒处理器，然后关闭主电源。

结果

采用所述采集流程，成功收集了七名参与者的粪便样本，获得的样本质量充足且性状适宜，可用于后续处理。样本采集后于室温下保存。大多数样本表现出均匀的质地和颜色，符合适当的采集和储存条件；而少数样本在性状上存在轻微差异，可能反映了参与者之间的生物学变异。运输过程中未观察到可见污染或泄漏，所有样本均在采集套件验证的稳定性时间窗口内（室温下最长2年）完成处理，表明该采集流程具有良好的稳健性和可靠性（图1）。

使用自动化磁性颗粒处理器（图2A）、板加载配置（图2B）、深孔板适配器（图2C）、可兼容离心机的板架（图2D）、珠磨仪（图2E）、缓冲支撑装置（图2F）、板架固定器（图2G）、珠板（图2H）、深孔板（图2I）以及洗脱板（图2J），按照表1中总结的自动化提取程序以及表2中所示的板加载配置，进行自动化DNA提取流程。对代表性粪便样本的DNA浓度和纯度进行了评估，结果汇总于表3。采用Qubit双链DNA高敏检测试剂盒（荧光定量DNA检测法），在Qubit荧光计（荧光定量DNA检测仪器）上按照制造商说明书测定DNA浓度。将样本与工作液混合，室温孵育2分钟，并与两种试剂盒标准品一同测定。使用NanoDrop分光光度计（微量分光光度计）测定A260/A280和A260/A230吸光度比值。DNA浓度范围为36至87 ng/µL，所有样本均以200 µL的相同洗脱体积进行洗脱，从而可直接比较不同制备样本间的总DNA回收量（表3）。

样品DNA 浓度
(ng/µL)		A260/A280A260/A230洗脱体积
(µL)		总 DNA 产量
(ng)
样品 A621.831.7120012,400
样品 B361.891.512007,200
样品 C871.921.8520017,400
样品 D502.031.8720010,000
样品 E551.971.8120011,000
样品 F851.991.8820017,000
样品 G442.011.512008,800
提取空白样0——2000

表3：从人粪便样本自动化提取后具有代表性的DNA回收率和纯度。
从人粪便样本自动化提取DNA后测得的代表性DNA浓度、纯度（A260/A280 和 A260/A230 吸光度比值）、洗脱体积及总DNA得量。DNA浓度采用荧光定量法测定。提取空白样本作为阴性对照，未检测到可测DNA。

代表性结果表明，不同样本间的DNA回收量存在差异。样本A（62 ng/µL）、样本F（85 ng/µL）和样本C（87 ng/µL）获得的DNA浓度较高，而样本D（50 ng/µL）和样本E（55 ng/µL）的浓度处于中等水平。样本B和样本G的DNA浓度最低，分别为36 ng/µL和44 ng/µL。A260/A280吸光度比值介于1.83至2.03之间，A260/A230吸光度比值介于1.51至1.88之间（表3）。此类差异在粪便样本中属预期现象，可能反映了样本组成和生物学变异性的不同，同时也包括样本处理过程中相关的技术变异。提取空白对照未检测到DNA，表明提取过程中无明显污染。对粪便DNA样本进行细菌16S rRNA基因近全长扩增，获得了预期大小约为1.5 kb的PCR扩增产物，而无模板对照未出现扩增信号（图3）。

凝胶电泳；16S rRNA PCR 结果；DNA 标记；泳道分离过程分析。
图 3．细菌 16S 核糖体核糖核酸（rRNA）基因聚合酶链式反应（PCR）扩增子的琼脂糖凝胶电泳图。 
本图显示了从人类粪便样本提取 DNA 后，使用通用引物 27F 和 1525R 扩增获得的近全长（约 1.5 kb）细菌 16S rRNA 基因的代表性琼脂糖凝胶电泳结果。泳道 M：100 碱基对（bp）DNA 标记；泳道 1：无模板对照（空白）；泳道 2–8：代表性粪便 DNA 样本，均显示出预期大小约为 1.5 kb 的 PCR 扩增产物。 请点击此处查看该图的放大版本。

本方案成功实施的标志是能够回收到可用于下游分子实验的可检测DNA，包括基于PCR的检测、16S rRNA基因测序、宏基因组鸟枪法测序以及文库构建。总体而言，这些代表性结果表明，该方案能够稳定地从人类粪便样本中回收DNA，同时展示了不同生物样本之间可能存在的变异范围。

讨论

本文所述方案为用于微生物组研究的人类粪便样本采集和自动化DNA提取提供了标准化的工作流程。关键步骤包括从粪便的多个区域进行代表性取样、与稳定缓冲液充分均质化、在推荐条件下正确储存和运输、高效的机械裂解，以及在自动化提取过程中的谨慎操作。严格遵循这些步骤可最大限度地减少技术变异，并支持可重复的DNA回收。先前的研究同样指出，样本采集、储存条件、均质化处理和DNA提取是微生物组分析中变异的主要来源，并强调了标准化工作流程对获得可重复结果的重要性5,6,7,8。代表性结果表明，样本采集成功，无可见污染或泄漏现象，且所有测试样本均实现了可测量的DNA回收。

多种操作因素可能影响DNA的回收率，在实施过程中应予以考虑。机械或化学裂解不充分、均质化不完全、核酸结合效率低下，或在转移和洗涤步骤中发生样本损失，均可能导致DNA得率降低。粪便样本的组成差异、微生物生物量以及样本性状的不同，也可能导致各样本间DNA回收率的差异。因此，在操作过程中需谨慎执行实验方案，尤其是在样本均质化、珠磨裂解和自动化提取步骤中，这对于获得一致的结果至关重要。在处理样本前，故障排查应重点确认试剂配制、仪器设置、板孔加样以及自动化提取程序的正确执行。类似建议已在评估微生物组分析流程和DNA提取方法的研究中被报道5,6,7,8,11。

该方法的主要局限性在于不同生物样本间DNA得率存在可观测的变异性。如代表性结果所示，DNA浓度的差异可能反映了粪便样本之间固有的生物学变异，以及样本处理过程中引入的技术性变异。因此，不应将DNA浓度单独作为评价提取效果的唯一指标。根据预期的下游应用，可能还需要其他评估DNA质量和适用性的指标。为进一步评估DNA质量及其对下游分子分析的适用性，使用通用引物27F和1525R通过PCR扩增细菌16S rRNA基因。通过琼脂糖凝胶电泳确认了大小约为1.5 kb的16S rRNA基因片段的成功扩增（图3），表明所提取的DNA质量足以满足包括测序在内的各类下游应用需求。既往的基准研究同样表明，DNA得率并不一定与下游测序表现或微生物组分析准确性相关8,11。

与手动提取流程相比，自动化磁性颗粒处理系统可减少人工操作时间，标准化提取条件，并支持高通量样本处理，同时最大限度地降低操作者依赖性带来的变异9,10。然而，粪便样本的一致性差异和微生物生物量的波动可能影响裂解效率和DNA得率。此外，具有坚固细胞壁的微生物可能无法完全裂解，从而可能影响某些分类群的代表性。尽管存在这些局限性，自动化提取仍为大规模肠道微生物组研究提供了一种稳健且高效的解决方案5,6,7,8,9,10。本方案结合了标准化的粪便样本采集与自动化DNA提取流程，为需要对大量样本进行一致性处理的微生物组研究提供了实用且可重复的方法。此类标准化方法有助于在不同研究之间实现结果的可重复性，并适用于多种下游分子应用，包括微生物组分析、宏基因组测序及其他基于测序的分析技术5,6,7,8,9,10。

披露

作者声明不存在任何竞争性的经济或非经济利益。

致谢

我们衷心感谢印度 SKAN 研究基金会提供资源和协作环境，使本工作得以完成。同时感谢 Anushree Kogje 博士在事实核查和编辑支持方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
80% 乙醇（由纯乙醇配制）MerckET00161000按照方案所述，使用纯乙醇新鲜配制。
吸水材料Kimtech34256包含在运输袋中。
粘性板密封膜Applied Biosystems4306311MicroAmp 透明粘性膜。
自动化磁性颗粒处理器（配备 96 孔深孔头的 KingFisher Flex 纯化系统）Thermo Fisher Scientific5400630自动化核酸提取系统。
带生物危害标识的可密封运输袋Zymo ResearchR1180用于样本运输的防漏运输袋。
BindIt 软件Thermo Fisher Scientific5189009用于修改和传输自动化提取程序的软件。
带附着刮勺的收集管（30–50 mL）Zymo ResearchR1180无菌螺旋盖收集管。
缓冲支撑材料QIAGEN69984TissueLyser 适配器组（珠击破碎过程中用作缓冲支撑）。
深孔板（96 孔）Thermo Fisher Scientific95040460KingFisher 96 孔深孔板。
一次性手套Zymo ResearchR1180推荐使用无粉手套。
洗脱缓冲液Applied BiosystemsA42357随 MagMAX Microbiome Ultra 核酸分离试剂盒提供。
粪便采集器Zymo ResearchR1180无菌采集装置。
加热模块（96 孔深孔）Thermo Fisher Scientific随仪器提供KingFisher Flex 纯化系统的组件。
实验服本地供应商N/A个人防护装备。
裂解缓冲液Applied BiosystemsA42357随 MagMAX Microbiome Ultra 核酸分离试剂盒提供。
磁珠Applied BiosystemsA42357随 MagMAX Microbiome Ultra 核酸分离试剂盒提供。
磁头（96 孔深孔）Thermo Fisher Scientific随 5400630 提供随 KingFisher Flex 系统提供的 96 孔深孔磁头。
磁力架（96 孔）Thermo Fisher Scientific12332D仅在观察到磁珠残留时需要。
多通道移液器Eppendorf3125000052兼容 96 孔板。
NanoDrop 分光光度计Thermo Fisher ScientificND-ONE-W用于测定 A260/280 和 A260/230 比值。
核酸结合缓冲液Applied BiosystemsA42357随 MagMAX Microbiome Ultra 核酸分离试剂盒提供。
永久性记号笔Sharpie3002也可使用预印标签。
移液器吸头，无菌过滤（10 µL）Tarsons528100无菌带刻度滤芯吸头。
移液器吸头，无菌过滤（200 µL）Tarsons528104无菌带刻度滤芯吸头。
移液器吸头，无菌过滤（1,000 µL）Tarsons529106无菌滤芯吸头；根据方案指示剪裁以制备宽口吸头。
离心机用板适配器Eppendorf5820710004转子 A-2-DWP-AT 深孔板适配器。
兼容板的离心机Eppendorf5810兼容 Rotor A-2-DWP-AT 适配器。
珠击破碎用板架QIAGEN69984TissueLyser 适配器组 2 × 96。
预印标签（可选）BradyBBP12替代永久性记号笔。
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo Fisher ScientificQ33231用于 DNA 定量的荧光检测法。
Qubit 荧光计Thermo Fisher ScientificQ33327用于荧光法定量 DNA 的仪器。
试剂储液槽Thermo Fisher Scientific8093Matrix 试剂储液槽。
样本稳定缓冲液Zymo ResearchR1180DNA/RNA Shield 粪便采集试剂盒。
无菌锥形管HiMediaTCP106H用于配制结合磁珠混合液。
TissueLyser III 珠磨均质器QIAGEN9003240机械裂解仪器。
移液头梳板Thermo Fisher Scientific97002534KingFisher 96 孔移液头梳，用于深孔磁铁。
洗涤缓冲液Applied BiosystemsA42357随 MagMAX Microbiome Ultra 核酸分离试剂盒提供。

参考文献

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