一个 在体 内 用于评估防晒霜功效与耐久性的模拟海滨小鼠系统

摘要

本研究采用小鼠模型构建模拟海滨环境系统，用于在紫外线照射、海水浸泡、波浪冲刷和风干等复杂环境应激条件下，定量评估防晒产品的滞留率及光保护功效。该模型可作为临床前筛选工具，但不能替代标准化的临床试验。

摘要

紫外线辐射是导致皮肤光老化、晒伤及急性紫外线损伤的主要环境因素。防晒霜是最常见的光防护手段；然而，现有的评估方法要么无法准确模拟复杂的海滨环境，要么成本高昂且存在伦理限制。本研究提出了一种结合活体小鼠模型的新型模拟海滨测试系统，用于定量评估防晒霜在复杂环境应激源下的功效与持久性。该定制设计的测试舱整合了可控紫外线照射、模拟波浪的海水浸泡以及风干机制。经脱毛处理的 BALB/c 小鼠经不同防晒剂处理后，接受标准化的120分钟模拟海滨环境循环暴露。采用荧光成像技术对防晒剂的驻留率进行定量分析，同时通过苏木精-伊红（H&E）染色评估其光防护功效。&E) 表皮厚度与炎症浸润染色。结果表明，该系统能有效区分不同防晒产品的性能表现。具体而言，一款高防护、防水型防晒霜展现出最高的保留率，并为抵御紫外线及环境损伤提供了最佳保护。本方案为在模拟极端环境下探索皮肤防护产品提供了一种经济高效、重现性良好且符合伦理的临床前筛选替代方法，其作用在于搭建探索性桥梁，而非替代已获验证的强制性人体防晒系数测试。

引言

紫外线（UV）辐射，特别是UVA和UVB，是导致皮肤光老化、晒伤以及急性紫外线诱导性皮肤损伤的主要原因^1,2,3。使用防晒霜是最广泛采用的减轻这些不良影响的策略^4,5。因此，对防晒霜功效进行准确评估对于皮肤科研究和化妆品行业均具有重要意义。

目前，测试防晒产品功效的主要方法包括 体外 仪器分析与人体临床试验^6,7. 体外 方法，例如石英板或人工皮肤上的紫外分光光度法，具有成本效益高且高度可重复的优点^8,9然而，这些方法无法模拟防晒产品在活体皮肤上成膜、防水及耐洗脱的复杂动态过程。相比之下，人体临床试验通过测量志愿者背部的最小红斑剂量（MED），被认为是确定防晒系数（SPF）的金标准，符合国际标准化组织（ISO）（SPF：ISO 24444，防水性：ISO 16217）和美国食品药品监督管理局（FDA）指南的要求。^{10,11,12,13,14}尽管临床试验具有可靠性，但其成本高昂、耗时较长，且存在显著的个体差异，同时受到伦理问题的严格限制，尤其是在极端或可能有害的环境条件下进行测试时。

现有评估技术的一个显著局限性在于无法全面模拟实际的海滨环境。在海滨活动中，防晒产品会经历一个涉及高盐度海水浸泡和波浪冲刷的协同降解过程^15,16。这些因素会严重削弱所用产品的附着稳定性及其防护持续时间。为克服这些局限，本研究引入了一种基于 BALB/c 小鼠模型的新型模拟海滨测试系统。该系统将多个关键环境参数——包括紫外线强度、海水盐度、水温、波浪力和风速——整合到一个高度可控的平台中。通过将该硬件系统与定量荧光成像和组织学分析相结合，本方案可精确评估防晒产品的保留率及其生理防护功效。该方法为复杂、实际海洋环境下防晒产品性能的评估提供了一种可靠、低成本且高效的解决方案。

方案

所有涉及脊椎动物的实验方法均遵循机构指导原则，并已获得广东莱迪生物医学研究院有限公司实验动物管理与伦理委员会的批准，批准号为 LDSW2025050-4。

1. 模拟海滨环境舱的设置

1. 组装测试腔室，该腔室由一个透明、气密的金属箱（尺寸：长40厘米 × 30 厘米宽度 × 30 厘米高度）并设有供动物进出的通道口。
2. 集成紫外线模拟单元：在培养箱顶部安装紫外线灯（6W），提供约2 mW/cm²的强度。²这模拟了正午海滨强烈的平均日照强度。
   **注意：** 紫外线辐射对眼睛和皮肤有害。操作紫外线装置时，请确保腔室完全密封，并佩戴适当的安全护目镜和防护服。
3. 整合水环境单元。向内置水箱中注入人工海水。
4. 将市售海盐以1千克的比例溶解于纯化水中，制备海水。± 向 30 升溶液中加入 0.05 千克盐± 0.5 L) 水。将水温控制器设定为保持恒温 25°C。 °C± 1 °C).
5. 启动造波装置，以约10升/分钟的流速模拟中等强度近岸波浪的机械摩擦作用。
6. 将鼓风机定位，使其气流直吹动物饲养区域。将气流校准至每分钟35立方英尺（CFM），以模拟海滨微风。
7. 将所有组件连接至中央控制接口。测试前，将目标环境参数输入控制系统，并使用相应的测量仪器进行校准。
   注意：执行此初始验证时，请使用外部手持式数字紫外线辐射计、防水温度计和风速计，确保紫外线强度（2 mW/cm²）²），水温（25 °在启动生物学实验前，请确保温度（22°C）、相对湿度（50%）和风速（35 CFM）与预设设定点相符。
8. 实验过程中，请根据需要开启或关闭紫外线灯、造浪器及排水系统。 通过 该界面可精确执行交替浸没与暴露阶段。

2. 动物模型的制备

1. 饲养成体 BALB/c 小鼠（体重约20 g至25 g）在标准条件下饲养，并在实验前使其适应环境一周。
2. 使用1.5%异氟烷对小鼠进行短暂麻醉。 通过 吸入以减轻应激。使用动物脱毛设备预先剃除小鼠背部的毛发。
3. 接下来，将市售化学脱毛膏均匀涂抹于小鼠背部皮肤。等待3至5分钟后，用温热的湿纱布轻轻擦拭去除毛发。
   注意：组织学中使用的化学脱毛膏和多聚甲醛具有毒性和刺激性。请在通风良好的区域佩戴防护手套进行操作。废弃物处理：所有化学废弃物（多聚甲醛）和生物废弃物（动物尸体及组织）必须严格按照机构和地方监管要求，弃置于指定的生物危害及化学废弃物容器中。
4. 将脱毛后的小鼠继续饲养2天，使其恢复。实验前，目视检查背部皮肤，确认脱毛过程未引起任何红斑或刺激。
5. 用黑色记号笔在暴露的背部皮肤上画一个十字，将该区域划分为四个不同的象限（象限1至4）。

3. 防晒霜涂抹与预处理

1. 制备待测防晒霜样品。随机选取三款市售防晒霜：A、B 和 C。
2. 使用20微升移液器将防晒霜涂抹至指定区域。 μ使用 L 型微量移液器，并以无菌手套指尖轻柔地以圆周运动均匀铺展制剂 10 秒，确保形成均匀薄膜，具体操作如下：
   注意： 确保指尖施加的压力在所有象限内保持一致。涂抹不均或压力过大会导致涂膜厚度不规则，这将直接影响后续保留评估的可重复性。
3. 第一象限（左上）：以 20 毫克/平方厘米的剂量涂抹² 防晒霜A的。
4. 象限2（右上）：施加20 mg/cm²² 防晒霜B的
5. 第三象限（左下）：以 20 mg/cm² 的剂量涂抹² 防晒霜的C.
6. 第四象限（右下）：不作处理（未保护对照）。
7. 将小鼠置于静息状态5分钟，以确保防晒霜均匀且稳定地分布于背部皮肤。

4. 防晒剂保留率评估

1. 将一种安全的荧光标记物（0.01% w/w Sulfo Cy7）混入防晒霜A、防晒霜B和防晒霜C中。
2. 按照第3节所述方法，将荧光标记的防晒霜涂抹于小鼠背部皮肤。
3. 使用荧光成像系统捕获背部皮肤的初始基线荧光图像 (F0)。 体内 荧光成像系统。
   注意：请确保成像参数（包括曝光时间和焦平面）对每只动物均保持严格锁定。不准确的基线（F0）捕获将使防晒霜保留率的最终计算结果无效。
4. 将小鼠放入测试箱。关闭紫外线灯，并将水温设定为 25°C。 °C.
5. 升高水位并启动造波器，使小鼠经历30分钟的浸水阶段（游泳），确保其头部安全保持在水面以上。
6. 接下来，关闭造波机并降低水位，使腔室内的阶梯式金属平台露出水面，让小鼠在平台上安全休息30分钟（出水阶段）。
7. 重复进行30分钟浸没阶段和30分钟暴露阶段，完成第二个循环（总计120分钟）。
8. 使用 体内 成像系统。
9. 使用以下公式计算保留水平：
   保留水平 = (F1 / F0) × 100%      (1)
10. 使用以下公式计算相对荧光强度：
    荧光强度 = (F1(X) / F1(A)) × 100%      (2)
    其中，F0为基线荧光强度，F1为实验后荧光强度，F1(A)为涂抹防晒霜A区域的实验后荧光强度，F1(X)为涂抹防晒霜B或C区域的实验后荧光强度。
    注意：在荧光监测实验中，请确保紫外灯保持关闭状态，以防止紫外线诱导的荧光猝灭。总暴露时间为 120 分钟，并确保对动物进行持续监测。' 在整个浸水阶段监测呼吸频率与活动状态，以确认无痛苦或衰竭迹象。

5. 光防护功效检测

1. 按照第3节所述，将标准（非荧光）防晒霜涂抹于小鼠背部。
2. 将一块黑色紫外线阻隔胶带贴于小鼠颈部上方区域，作为紫外线屏蔽的内部对照。记录基线皮肤状况。 通过 宏观摄影。
   注意：请用力按压胶带边缘，以防在波浪冲洗阶段发生渗水或意外脱落。若胶带脱落，内部对照区域将因暴露于紫外线和水中而受损，从而干扰组织学基线。
3. 将小鼠置于第4节所述相同的水循环程序中，并启动紫外线模拟单元：将水位升高30分钟（浸泡阶段），随后降低水位30分钟（暴露阶段），并重复进行第二个循环（总计120分钟）。
4. 将小鼠移出舱室，使用宏观摄影记录皮肤红斑、脱皮或硬化情况。
   注意：根据腔室尺寸（40厘米 × 30 厘米 × 30 厘米）以及动物' 相对于光源的活动空间，在120分钟循环期间所传递的累积紫外线剂量估计约为2.5 J/cm²。²在此剂量水平附近给药，可有效诱导可测量的表皮增厚和急性炎症，同时确保小鼠安全并严格遵守动物福利限制。³.
5. 实验终点时，在深度异氟烷麻醉下，严格遵循美国兽医协会（AVMA）《动物安乐死指南》，通过颈椎脱臼法对小鼠实施人道安乐死，以获取皮肤组织用于后续组织学评估。从四个象限及胶带保护区域切取背部皮肤组织。
6. 将组织置于4%多聚甲醛中固定24小时，随后进行标准脱水、石蜡包埋及切片处理。
7. 使用苏木精和伊红对切片进行染色&E). 简要步骤如下：将切片在二甲苯中脱蜡，通过梯度乙醇溶液复水，用苏木精染色5分钟，在流动自来水下冲洗，用伊红复染1分钟，脱水，并用树脂封片剂封片。
8. 在光学显微镜下观察染色切片。测量表皮厚度，并通过计数浸润的炎性细胞来评估皮肤炎症程度。
   注：该循环中施加的紫外线剂量足以诱发急性红斑以进行疗效评估，但仍远低于安全、非致死阈值；测试循环结束后，小鼠未表现出严重全身性损伤迹象并维持正常生理活动，即证明了这一点。

6. 统计分析

1. 使用 GraphPad Prism 9.5 进行统计分析。定量变量以均值表示。 ± 标准差。采用单因素方差分析，随后进行 Tukey 检验’采用事后检验进行多组间比较。统计学显著性定义为*p < 0.05, **p < 0.01，ns 表示无显著性差异p > 0.05).

结果

测试系统的环境表征
在开始之前 体内 在评估过程中，对模拟海滨环境舱的物理参数进行了校准，以确保高度的环境保真度。紫外线模拟单元采用了一盏6 W的灯，其发射光谱范围宽广，为300至420纳米，峰值波长为340纳米。这种特定的光谱分布确保了以UVA发射为主，并伴随具有生物学相关性的UVB部分，从而有效模拟了正午时分到达地球的自然阳光的典型紫外线光谱。'表面¹⁷造波器以10升/分钟的流速运行，产生与温和海岸波浪冲刷相当的轻度流体剪切应力。此外，气流单元提供35立方英尺/分钟的恒定风速，相当于测试区域约3至4米/秒的风速。这对应于海滨典型气象条件下的微风（蒲福风级3级）。¹⁸这些综合参数可靠地复现了典型海滨活动期间所经历的循环机械与环境应力。

防晒霜驻留效果评估
首先，组装模拟海滨装置。如图所示 图 1A该系统主要由风机、紫外线辐照系统、模拟海水池和控制系统组成，分别用于风干、紫外线辐照、海水浸泡和集中控制。将小鼠置于装置中并启动系统后，成功模拟了海岸带浸没与暴露阶段的环境条件。图 1B基于此实验设置，我们首先研究了防晒剂在此条件下的存留情况。首先，将市售的防晒剂A、B和C（均标记有荧光示踪剂）涂抹于小鼠背部皮肤。随后，将这些小鼠置于模拟装置中，接受交替循环处理：30分钟浸没（模拟游泳）与30分钟暴露（模拟岸上日光浴）。2小时后，在完成一个完整的水浪与风循环后，使用荧光检测法测定皮肤上存留的荧光信号。 体内 成像。如图所示， 图 2A–B与模拟前相比，所有防晒霜组均表现出荧光强度下降，表明海水波浪的冲刷效应导致大量防晒霜被去除。其中，使用防晒霜C处理的象限保留了相对较高的荧光量，防晒霜B表现出中等保留率，而防晒霜A的保留率最低。图 2C这表明防晒霜C和B具有相对更强的附着保留能力。这些数据证实，我们的装置能够在复杂环境应力条件下定量区分不同配方的耐久性。

光保护功效
为在模拟海滨环境中进一步研究这些防晒霜的紫外线防护效果，我们对小鼠背部皮肤进行了宏观观察。如图所示， 图 3A 与 3B未受保护的对照组表现出紫外线诱导的损伤，其特征为明显的红斑、发红和晒伤。相比之下，涂抹防晒霜的区域则显示出显著减轻的晒伤症状。此外，组织学分析 使用 H&进行了E染色 这与前述宏观观察结果一致。图 4A–B）。当未受保护的对照组暴露于海滨模拟环境时，表皮显著增厚，并出现明显的炎性细胞浸润（图 4C)在真皮层中观察到，这表明模拟海滨测试系统有效复现了实际海滨环境中的皮肤晒伤。防晒霜的应用显著减轻了这些病理变化。值得注意的是，经防晒霜C处理的皮肤组织其表皮厚度与炎症细胞浸润情况，与经受相同环境压力但受紫外线屏蔽的内部对照组极为相似。这表明防晒霜C在模拟海洋环境中提供了最佳防护效果，这可能归因于其高保留率及固有的光防护特性。

图 1模拟海滨测试系统概述。 (A) 装置示意图。B) 测试箱内的小鼠。该定制测试箱集成了紫外线照射装置、带造波机的水箱以及鼓风机，有效模拟了真实的海滨环境。本图由作者获取，无版权问题。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2防晒霜残留荧光分析。 (A) 小鼠背部皮肤在120分钟实验前后的代表性荧光图像。B) 荧光保留的定量分析。C) 相对荧光强度分析。数据以平均值呈现 ± SD (n = 5)。统计分析采用单因素方差分析，随后进行 Tukey 检验。’s 事后检验。*p < 0.05, **p < 0.01. 请点击此处查看此图的放大版本。

图 3小鼠皮肤在环境暴露后的宏观外观。 (A) 小鼠背部皮肤在模拟海滨环境中暴露120分钟后的代表性宏观图像。B局部放大视图显示，与防晒剂保护区域及紫外线屏蔽的内部对照（正常）相比，未受保护的对照区域出现了红斑和脱屑现象。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 4光保护功效的组织学评估。 (A) 代表性 H&不同环境暴露处理后小鼠背部皮肤的伊红染色切片。指示线标明了所测量表皮的边界。比例尺 = 250 µm.B) 对各指定区域表皮厚度进行定量分析。C) 相对炎症细胞计数 (%) 的定量评估。以紫外线屏蔽的内部对照 (Normal) 作为基线 (100%)。数据以平均值呈现。 ± SD (n = 5)。统计分析采用单因素方差分析，随后进行 Tukey 检验。’s 事后检验。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本研究成功开发并验证了一种结合活体小鼠模型的多因素模拟海滨测试系统。该综合方案不仅提供了一种新型装置，还能在协同环境压力源下动态评估防晒产品的耐久性与光防护功效。通过弥合简化 体外 在检测方法与复杂人体临床试验之外，该方法建立了一个全面的临床前平台，用于理解皮肤屏障配方在实际海洋环境中的表现。

相较于传统方法，本方案的主要优势在于其高度的环境保真度。标准防水测试通常涉及实验室水槽中的静态水浸。¹⁹相比之下，本系统整合了波浪作用的机械摩擦、高盐度海水的渗透压胁迫、风的蒸发效应以及持续的紫外线辐照。这些因素协同作用，破坏防晒膜，从而提供了更为严苛且贴近实际的应力测试。需注意的是，在荧光保留率评估期间，紫外线灯被关闭以防止荧光团淬灭。因此，该特定测试评估的是针对机械冲刷和渗透压胁迫的物理耐久性，但未包含紫外线诱导的化学降解因素。为弥补这一点，后续的组织学评估在开启紫外线模块的条件下进行，从而对实际防护效能进行了全面评估。结果明确显示，尽管所有防晒产品均能提供一定的基础防护，但其保留率（图 2) 以及相应的组织学保护作用图 4) 因配方不同而存在显著差异'对这些组合动态力的抵抗力。

使用 BALB/c 小鼠提供了一个极佳的 体内 该平台考虑了皮脂分泌、经皮水分流失和动态皮肤运动等生物变量，这些是人工皮肤模型无法复制的。在120分钟循环中施加的紫外线剂量受到严格控制，以有效诱导暴露皮肤区域发生急性晒伤，同时不引起任何全身毒性或严重损伤，将其严格控制在BALB/c小鼠的伦理限度内。此外，通过将单只小鼠'通过将背部重新划分为四个象限，我们消除了个体间的生物学差异，从而能够在不同防晒配方之间进行高度精确的配对比较。

本方案的一个关键步骤是确保小鼠皮肤在脱毛后完全恢复，因为任何基线刺激都会干扰组织学读数的准确性。此外，防晒膜层的均匀涂布、测试前环境参数的稳定校准以及浸没与暴露阶段的精确计时，对于确保批次间的高重复性至关重要。关于故障排除，可能会出现几个可预见的问题。如果观察到防晒霜涂抹不均，应重新校准移液体积并确保采用轻柔的圆周运动进行涂布。若脱毛引起的红斑持续存在，应延长恢复期或将受影响动物排除。为防止动物在浸没过程中疲劳，需严格监测其活动，并确保在浸没阶段动物能完全接触到休息平台。

该模型的一个局限性在于小鼠皮肤与人类皮肤在解剖学和生理学上存在差异（例如毛囊密度和表皮厚度）。小鼠皮肤具有更高的毛囊密度和更薄的表皮，这可能会影响防晒产品膜层的形成。丰富的毛囊内陷可能充当微储库，潜在地有利于颗粒型（无机）防晒剂相对于纯有机配方的机械性驻留。虽然该模型是筛选配方的强大比较工具，但最终的防晒指数（SPF）标注仍需进行人体临床试验。该系统的未来应用前景广阔。除防晒产品外，此装置可适用于评估其他局部用化妆品、屏障霜、伤口敷料，甚至在严苛环境条件下紫外线防护纺织品的耐久性。该系统的整合简化了研发流程。&D 工艺为化妆品化学家与皮肤病学研究人员提供了一种快速、经济且符合伦理的筛选方法，可在进入人体试验前使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
伊红	Macklin	770427	用于H&E染色
乙醇	Macklin	E809059	用于H&E染色
脱毛膏	Veet	TMG-001	用于去除细小毛发
苏木精	Macklin	H810910	用于H&E染色
Image J			用于图像分析
活体成像系统	Perkinelmer	IVIS Lumina III	用于检测荧光保留情况
异氟烷	RWD Life Science	R510-22-10	用于小鼠麻醉
多聚甲醛	Biosharp	BL539A	用于皮肤组织固定
剃毛器	Chemmole	CM700015	用于去除大部分毛发
氯化钠	Macklin	S805285	用于配制模拟海水
Sulfo Cy7	Ruixibio	R-Z54515	用于标记防晒霜
紫外灯	Kanfu Lighting Technology	T5-6W	用于提供紫外线
二甲苯	Macklin	X821391	用于H&E染色