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方法文章

用于光遗传学动态控制的32孔LED嵌入式微孔板的制备与使用

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DOI：

10.3791/73445

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2026年9月22日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

本文内容

摘要

本方案介绍了如何在微孔板读数仪内制备、编程和操作一种集成32孔发光二极管（LED）的微孔板（LEMOS 2.0），用于光遗传学研究，从而实现对微生物培养物的高通量光遗传刺激以及定量基因表达检测。

摘要

光遗传学控制能够实现光激活的基因表达调控，并为活细胞与电子系统之间提供可编程的接口。然而，光遗传学元件的常规原型构建仍受限于基础设施。现有的闭环平台通常需要恒化器、微流控装置、机器人操作或定制的光学传感器，这些设备可能增加成本、降低可及性，或限制测量性能。

本文介绍了 LEMOS 2.0，这是一种用于光遗传学研究的新型发光二极管（LED）集成微孔板，是一种低成本设备，可在标准微孔板读数仪内实现光遗传刺激和基因回路表征。LEMOS 2.0 在原始 LEMOS 平台的基础上进行了改进，将通量从 16 个微孔提升至 32 个微孔，并减少了相邻微孔之间的光泄漏，从而实现了以黑暗条件作为额外的光照状态。该设备由一个三维（3D）打印框架、位于每个微孔旁的可独立寻址 LED、可充电电池以及用于基于蓝牙的无线通信的板载微控制器组成。生物相容性聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔通过复制模塑法直接浇铸到设备中，使得光刺激能够透过透明模具作用于细菌培养物。该设备可适配标准微孔板读数仪，从而实现 光密度和荧光检测。

本方案描述了完整的LEMOS 2.0工作流程，包括设备制造、电路组装、Arduino编程、PDMS微孔板浇铸、酶标仪设置、菌株与培养准备、自动化实验运行、设备清洁以及荧光/OD600数据分析。作为示例，本方案采用了CcaSR光遗传系统，其中sfGFP的表达在绿光照射下被激活，在红光照射下被抑制。LEMOS 2.0旨在使光遗传扰动和基因表达表征更易于湿实验研究人员使用，无需专业的生物反应器或微流控设备，即可实现更快速的设计-构建-测试-学习循环。

引言

光遗传学为活细胞与电子控制系统之间提供了可编程的接口。通过利用光来调控基因表达，可以以高时间精度、可逆性以及对培养基最小干扰的方式激活细胞行为1。当与荧光或生物发光报告系统结合时，光遗传系统能够以电子方式检测生物状态，并通过反馈回路进行调控1。这种双向光学接口已实现对细胞过程的网络遗传控制，包括基因表达、细胞生长和群体组成2,3,4。然而，许多成功的闭环光遗传系统需要专用的恒化器5、微流控装置4,6,7或机器人取样系统2,3,8，这可能限制其可及性，并阻碍常规的设计-构建-测试-学习循环。

酶标仪是测量微生物生长和基因表达动态最常用的仪器之一。它们能够对大量样本提供可靠的光密度和荧光测量结果，支持环境控制，并已整合到标准的合成生物学工作流程中9。然而，标准商用酶标仪的照明光路设计主要用于光学测量，而非在培养过程中对特定孔位进行可编程的光遗传学操控。因此，光遗传学实验通常需要额外的照明装置10,11,12,13,14、在刺激平台与测量平台之间进行机器人转移8,15，或使用定制的读出硬件5,16,17。这些额外步骤会降低时间分辨率，引入操作变异，并使闭环控制变得复杂。

为填补这一空白，此前已开发出用于光遗传学研究的嵌入式LED微孔板（LEMOS）18。LEMOS是一种与微孔板读板仪兼容的装置，其周围分布有可独立寻址的LED，对应各个培养微孔。该装置在整个实验过程中始终置于商用微孔板读板仪内，可在同一平台上实现光学刺激以及荧光/600 nm处光密度（OD600）的检测。在最初的设计中，LEMOS支持16个培养微孔，并已用于演示分批培养条件下开环光遗传刺激及基因表达的闭环反馈控制18。该装置与外部计算机同步，可在检测时间窗口关闭LED照明，从而最大限度减少对荧光和光密度读数的直接干扰。

本方案描述了LEMOS 2.0设备的更新版本及其在微生物培养物中进行光遗传学实验的应用。LEMOS 2.0被重新设计，将可独立寻址的培养微孔数量从16个增加到32个，提高了实验通量，使单次运行中可测试更多条件、重复组或控制器设计。设备设计还进行了改进，以减少光照微孔与相邻暗微孔之间的光泄漏，从而提高暗对照和空间模式刺激实验的可靠性。这些改进使该平台更适用于光遗传学比较表征、多条件控制器测试，以及已被使用微孔板读数仪的实验室常规采用。

LEMOS 2.0 专为需要重复进行 OD600 和荧光测量，并可编程控制红光、绿光、蓝光或黑暗状态照射的微生物批量培养实验而设计。所用酶标仪必须支持动力学 OD600 和荧光检测、温度控制、振荡功能，能够自定义 32 个 LEMOS 微孔的板布局，并能自动将测量文件导出至由 Python 控制脚本监控的文件夹。当前实现方案已使用 BioTek Synergy H1 酶标仪配合 BioTek Gen5 v3.14 软件完成验证；若使用其他酶标仪软件，则需对导出格式、文件解析器及屏幕自动化步骤进行相应修改。由于该设备使用的 LED 发射峰分别为 620–630 nm、515–525 nm 和 465–475 nm，用户应选择其激活和检测光谱与这些通道相匹配的光遗传学效应分子和荧光报告系统19,20。若更换新的宿主菌株、报告分子、光遗传系统、培养基、生长温度、采样间隔或控制器设计，可能需要重新校准 LED 强度、占空比范围、空白校正、荧光归一化参数以及控制器参数。

本方案涵盖了 LEMOS 2.0 的完整工作流程：设备制备、电路组装、Arduino 编程、聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔板浇铸、酶标仪设置、菌株与培养准备、自动化实验运行、设备清洗以及荧光/OD600 数据分析。尽管示例流程聚焦于细菌的光遗传基因表达调控，但该框架同样可适用于其他微生物菌株、荧光报告系统、光遗传效应系统及控制算法。通过将可编程光照与标准酶标仪检测相结合，升级后的 LEMOS 2.0 平台为批量培养中的高通量光遗传扰动及反馈控制实验提供了便捷的实现途径。

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方案

所有涉及实验动物的实验操作 Escherichia coli 菌株 MG1655  所有操作均在德克萨斯 A&M 大学指定的生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。&M大学。细菌培养与操作均在经认证的二级生物安全柜中进行，并遵循标准防护指南。所有操作均在经德克萨斯农工大学审查并批准的指定防护条件下进行。&M 机构生物安全委员会（IBC），许可编号 IBC2023-044。

1. LEMOS 2.0 框架与 LED 阵列的制造

注意：开始制作 LEMOS 2.0 时，首先通过 3D 打印制作 LEMOS 2.0 框架，并将 LED 灯条置入设备主体。其目标是生成一个机械稳定的框架，使每个 LED 都位于对应的微孔旁边。此阶段 LED 的正确放置至关重要，因为错位会降低刺激均匀性，并增加微孔之间的光学串扰。

  1. 使用 GitHub 仓库（github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0）中提供的 STL 文件，3D 打印 LEMOS 2.0 内框架和用于 PDMS 微孔阵列的浇铸模具。打印完成后，清除所有支撑材料。
    注意：建议使用聚乳酸（PLA）线材和熔融沉积成型（FDM）打印机，并采用以下打印参数：层高0.2毫米，LEMOS 2.0框架填充率为20%，铸造模具填充率为40%。
  2. 将LED灯带沿焊接焊盘中心切割为两组，每组16个LED。确保每条灯带末端均有三个焊接焊盘可供焊接，具体细节将在第2节进一步讨论。
  3. 将每条 LED 灯带对折，使 LED 灯珠朝外补充图 1A， 补充视频 1).
  4. 手动将LED灯带贴合至设备几何形状，并将其插入微孔之间，使+5 V焊接焊盘朝下，同时注意LED灯带上的箭头指示。补充图 1A，补充视频 1）。在继续操作前，反复调整灯条位置，直至每个LED灯珠均正确卡入其槽位。

2. 电路组装与验证

注意：组装无线设备运行所需的电源、充电、微控制器、开关及 LED 连接。组装完成后，LEMOS 2.0 设备应能通过板载电池运行，通过充电模块充电，并接收来自外围 Arduino 板的 LED 指令。在连接 LED 灯带前，请逐一验证各电源连接，因为错误的电压布线可能损坏微控制器或 LED。

**注意**：本实验方案要求操作者预先熟练掌握焊接技能，包括相应的安全操作规范（例如使用吸烟器、佩戴护目镜及采取防烫伤措施）、电烙铁的维护保养以及基本的通孔/导线焊接技术。不具备相关经验的用户应在尝试本节步骤前接受培训。

  1. 收集所有列出的电子元件 材料列表 并检查是否存在可见的物理损伤。查阅接线图（补充文件 1).
  2. 将升压电压转换器配置为输出 5 V，而非默认的 12 V。根据电路板背面的配置键，使用烙铁加热以断开焊盘 A 和 B 之间的连接。
  3. 将 Arduino Nano BLE Rev2（下文简称 BLE Nano）的 VIN 引脚焊接至升压转换器的 OUT+ 引脚，并将 BLE Nano 的 GND 引脚焊接至升压转换器的 OUT- 引脚。补充图 1B).
  4. 焊接升压转换器的输入– 连接至电池充电模块的负极（-）引脚。
  5. 分离两根导线。 'JST PH 2针连接线 – 雌性连接器，100 毫米' 将电池连接端从白色外壳中拔出。从非电池连接端进行修剪，使每根线缆长度约为70毫米，以更好地适配设备。补充图 1C).
  6. 修改开关。首先，移除每个角落的安装引脚。其次，将所有引脚修剪至其原始长度的30%。接着，完全移除T1、T3和B3（注：T = 顶部，B = 底部，当开关正面朝上、引脚朝上观察时，从左至右编号为1至4）。补充图 1D).
  7. 将红色 JST 电缆焊接至 B2，使电池连接端裸露在外，以便连接电池。’稍后连接 s 型公接头补充图 1D).
  8. 在 B1 与 B4 之间焊接一根连接导线。
  9. 将电池充电模块的B+引脚焊接至B1，注意确保上一步的连接导线也同时焊接在B1上。补充图 1E).
  10. 将升压转换器的IN+引脚焊接至T4。
  11. 将电池充电模块的正极 (+) 引脚焊接到 T2。
  12. 将黑色JST电缆焊接到电池充电模块B上。– 引脚。将电池连接端保持松动，以便后续连接电池。’s 型公头连接器。
  13. 在设备正常操作模式下验证连接。将锂离子电池通过焊接步骤中预留的电池连接线接入电路，同时将开关置于中央/关闭位置。补充图 1E).
  14. 将开关向左/开启位置拨动（即仅有两个插针被占用的那一侧）。
  15. 通过板载电源LED（标记为 ‘开启’位于USB端口旁），其指示灯应变为绿色。补充图 1E，补充视频 1).
  16. 通过其板载LED（应亮起蓝色）确认升压转换器已通电。
    注意：若 LED 指示灯未亮起，请在进行下一步操作前，使用万用表检查所有连接。
  17. 移除步骤1.4中插入的第一条LED灯带，并将导线焊接至两组VIN、DIN和GND焊盘。重新插入LED灯带，并将导线穿过框架侧面的端口。补充图 1F，补充视频 1).
  18. 对第二条 LED 灯带重复上述操作。 补充视频 1.
  19. 将第一条LED灯带焊接到BLE Nano的GND引脚、D13引脚和VIN引脚上。
    注意：焊接至 VIN 引脚需将两根导线焊接到同一 Arduino 引脚。将一根导线焊接到引脚孔内部，另一根 对准 Nano 板凹槽处的针孔外侧。
  20. 将两条 LED 灯带焊接在一起。
  21. 使用万用表的通断测试模式，通过触碰 BLE Nano 上的 VIN 引脚与最后一个未焊接 LED 焊盘上的 +5 V 焊盘来验证连接。对 GND 重复此操作。
  22. 使用热熔胶枪将LED灯带固定到位。补充图 1F，补充视频 1）。缓慢移动，每次仅粘合一至两对 LED，并在每次粘合后留出时间让胶水冷却。根据需要，使用镊子将 LED 固定到位。

3. 中央与外围 Arduino 开发板的编程

注意：对用于无线通信和LED控制的两块Arduino开发板进行编程。中央Arduino（Arduino Nano IOT 33）在实验期间连接至计算机，并负责中继来自Python脚本的指令。外围Arduino（Arduino Nano 33 BLE Rev 2）置于LEMOS 2.0设备中，用于控制LED阵列。在开始实验前，必须为两块开发板加载相应的程序草图。如需获得成功连接到另一设备的视觉指示，请取消Arduino脚本中列出行的注释：中央 – 第34行–37，黄色 LED 闪烁；外围设备 – 第99行–106，绿色 LED 闪烁。请在确认设备间连接成功后重新注释这些代码行。否则，闪烁的 LED 可能在设备置于酶标仪内时亮起，这可能会影响测量结果。

  1. 从 GitHub 仓库下载 Arduino 文件：LEMOS_Central.ino、LEMOS_Peripheral.ino。从 http://www.arduino.cc/en/software 下载并安装最新版本的 Arduino 集成开发环境（IDE）。
  2. 从 Boards Manager 安装最新版本的开发板软件包。工具 > 董事会 > Boards Manager) (补充图 2A).
    中央：Arduino SAMD 开发板
    外围设备：Arduino Mbed OS Nano 开发板
  3. 在库管理器中安装以下 Arduino 库：工具 > 管理文库) (补充图 2B): 'ArduinoBLE’ 用于外围设备与中心设备之间的蓝牙低功耗通信， ‘Adafruit_NeoPixel’ 用于 LED 编程。
  4. 在 Arduino IDE 中打开 LEMOS_Central.ino Arduino 文件。
  5. 通过通用串行总线（USB）数据线将相应设备连接至计算机。
  6. 为已连接的设备选择正确的 COM 端口工具 > 端口）。若COM端口不明确，可在连接与断开设备时观察哪个端口出现或消失。
  7. 从开发板菜单中选择 Arduino Nano 33 IoT 开发板工具 > 董事会).
  8. 将脚本上传至设备。
  9. 对 LEMOS_Peripheral.ino 文件及外围设备 (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) 重复此操作。

4. 通过复制模塑法制备聚二甲基硅氧烷微孔板

注意：采用复制模塑法，将光学透明的 PDMS 微孔直接浇铸在 LEMOS 2.0 框架内部。21聚二甲基硅氧烷微孔在酶标仪实验期间用于容纳细菌培养物，其底部必须清晰无气泡，以确保光密度测量的可靠性。600 及荧光测量。灰尘、气泡或固化不完全可能导致孔间差异，应在浇铸过程中避免。确保浇铸前通风橱表面清洁，因为聚二甲基硅氧烷中的任何灰尘或碎屑都会损害其光学透明度，导致光密度读数不一致。600 微孔读数。

**注意：** 处理未固化的PDMS时，请在通风橱内操作。避免皮肤接触固化剂。

  1. 使用 70% 乙醇喷洒 LEMOS 2.0 框架内部（微孔铸造区域）进行消毒，避免直接接触除 LED 以外的任何电气部件。待 LEMOS 2.0 框架完全干燥后，再进行 PDMS 微孔的铸造。
    注意：乙醇接触 LED 灯是安全的，但会损坏所有其他电气元件。
  2. 将PDMS微孔铸模喷涂脱模剂，静置10分钟使喷雾在塑料表面沉降。10分钟后再次喷涂可改善脱模效果，但此步骤为可选操作。
    注意：脱模剂（例如 Ease Release 200）将使浇铸模具具有疏水性，从而便于将浇铸模具从固化后的 PDMS 微孔中取出。
  3. 称量并混合 184 硅橡胶弹性体的固化剂与基料，使基料与固化剂的质量比为 10:1，混合于一次性塑料杯中。
    注意：建议每台 LEMOS 2.0 装置使用 2.5 g 固化剂 + 25 g 基料，总计 27.5 g 混合物；若同时浇铸多台装置，请按比例放大用量。
  4. 使用一次性刮刀或木棒剧烈搅拌至少5分钟，刮擦杯壁和杯底以确保混合完全。
    注意：充分混合至关重要。混合不充分的 PDMS 将无法均匀固化，并导致不一致的基线光密度。600 微孔读数。
  5. 将盛有PDMS混合物的培养皿置于真空干燥器中。施加真空（至少65 cmHg / 25 inHg）45分钟。–60 分钟，直至混合物中所有可见气泡均已去除。随着气泡升至表面，PDMS 会膨胀并可能溢出容器。请使用容量至少为 3× 混合物的体积。
    注意：固化聚二甲基硅氧烷中残留的气泡会改变微孔底部的光学透射率，导致基线光密度不一致。600 测量。
  6. 使用尺寸合适的活页夹夹将 LEMOS 2.0 框架固定在壳体四周。
    注意：活页夹夹可最大限度减少聚二甲基硅氧烷渗入外壳与 LEMOS 2.0 框架之间缝隙的量。该缝隙中过量的聚二甲基硅氧烷会增加装置整体高度，并导致 LEMOS 2.0 框架无法在外壳内保持水平。沿 LEMOS 2.0 框架底部边缘（紧邻微孔处）粘贴聚酰亚胺胶带可进一步减少渗漏。
  7. 将脱气后的PDMS小心注入LEMOS 2.0框架中。使用注射器将PDMS加入框架内的每个微孔，确保其被填充且气泡最少。
    注意：小气泡的形成不可避免；它们最终会升至表面并消失。脱气后应立即倾倒聚二甲基硅氧烷，以尽量减少操作过程中气泡的再次引入。
  8. 将3D打印的铸模插入已填充PDMS的框架中。轻柔均匀地按压铸模，确保铸模中的圆形突起嵌入LEMOS 2.0框架的孔洞内。该铸模用于在LED旁侧定义方形微孔。使用洁净的无绒擦拭布清除从边缘溢出的多余PDMS。
  9. 使PDMS在室温（25 °C) 在水平表面上放置至少30小时。如需加速固化，可将装置置于37 °在 4 小时内完成 C 步骤，但前提是必须确保所有可见气泡均已从 PDMS 中完全去除。
    注意：请勿将 LEMOS 设备暴露于 37°C 以上的温度环境中。 °C，因为这可能导致设备内置的锂离子电池过热并破裂。
  10. 待PDMS微孔固化后，握住模具边缘并施加平稳的拉力将其移除。确保PDMS微孔阵列保留在框架内。
  11. 检查每个微孔，确保孔壁光学透明且底部无气泡。此时，配备新鲜PDMS微孔的LEMOS 2.0装置即可投入使用。

5. 微孔板读板机配置与数据导出流程设置

注意：请配置酶标仪，以获取与 LEMOS 2.0 兼容的动力学测量数据并实现数据导出的自动化。该仪器必须能识别自定义的 LEMOS 2.0 微孔板布局，并采集光密度600 并在设定时间间隔进行荧光测量，将数据文件导出至由 Python 控制脚本监控的文件夹。在生物实验前使用无菌培养基进行基线测量，以确认 PDMS 微孔和酶标仪设置能产生一致的读数。本方案使用通过 BioTek Gen5 软件 v3.14 操作的 BioTek Synergy H1 微孔板读数仪。

  1. 启动 Gen5。
  2. 前往 培养板类型 并导入 LEMOS 2.0.xml 从 GitHub 下载，或参照 Gen5 软件中 LEMOS 2.0 的定制板布局进行设置。 补充文件 2 （第一部分）  以及 补充文件 3.
  3. 使用 LEMOS 2.0 设备进行基线测量（微孔中填充 200 µL 无菌 M9CA 培养基，覆盖医用级密封膜 [例如，Breathe-Easy 膜]）。记录 OD600 并比较所有32个微孔与标准96孔微板的荧光基线值。若观察到显著差异，则需重新浇铸PDMS微孔，因固化PDMS中的气泡或杂质最可能是导致此差异的原因。
    注意：Breathe-Easy 膜具有透气性，可为细胞生长维持有氧条件，同时保持光学透明性，以避免干扰荧光和光密度测定。600 测量。
  4. 打开实验方案 闭环协议.prt 从 GitHub 仓库导入至 Gen5。
    注意：为方便起见，GitHub 仓库中提供了一个预配置的实验文件模板 `template.xpt`。不过，其设置将在下文中详细描述。 补充文件 2 （第二部分） 以及 补充文件 3 为使用不同版本 Gen5 的用户提供故障排除参考。

6. 用于 LEMOS 2.0 实验的细菌培养物制备

注意：为 LEMOS 2.0 光遗传学时间进程实验准备细菌培养物。培养物制备需谨慎，因为起始密度和实验前的光照暴露会影响所测得的基因表达动态。演示菌株为 Escherichia coli (E. coli) 携带 pSR58.6 与 pNO286-3 的 MG165522pSR58.6 质粒包含超折叠绿色荧光蛋白sfgfp) 在 P 条件下cpcG2 以及组成型表达的CcaR、氯霉素抗性基因和一个pColE1复制起点。pNO286-3包含组成型表达的CcaS、壮观霉素抗性基因和一个p15A复制起点。这些质粒共同重建了一个绿光诱导、红光抑制的基因表达系统。pSR58.6和pNO286-3被转化至化学感受态细胞中。 E. coli MG1655 采用标准热激转化法23将培养板置于盒中，以保护细胞免受环境光影响，避免光遗传学回路过早激活。

  1. 将 CcaSR 光遗传菌株的单菌落和荧光阴性对照菌株分别接种至两个独立的 14 mL 圆底培养管中，每管含有 2 mL 补充了 50 µg/mL 壮观霉素与 25 µg/mL 氯霉素。在实验的所有后续培养步骤中均使用此培养基配方。
  2. 用铝箔覆盖每个试管，并在 14 小时内进行过夜孵育。–37°C 下 16 小时 °在 220 rpm 转速下振荡培养。
    注意：使用铝箔包裹可维持黑暗条件，并防止 CcaSR 系统被意外激活。或者，可将培养管置于 LED 培养箱中进行恒定的红光照射培养，该培养箱的电路连接方式与第 2 节所述相同；此方法能更准确地模拟实验前该系统的抑制状态。
  3. 转移 100 µ将每种过夜培养物各取1 L，加入装有2 mL新鲜培养基的新铝箔包裹培养管中。于37℃条件下孵育4小时。 °在 220 rpm 转速下振荡培养。
  4. 测量 OD600 使用酶标仪测定各亚培养物在4小时后的数值。
    注意：培养物应达到光密度600 0.4–0.6.
  5. 将每种培养物稀释至 OD600 = 0.1 于新鲜培养基中，移取 200 µ向 LEMOS 2.0 装置的每个微孔中加入 L 液体，移液时注意避免产生气泡，并用医用级密封膜密封装置。

7. LEMOS 2.0 光遗传学时间进程实验的启动

注意：启动自动化 LEMOS 2.0 实验需协调微孔板读数仪、中央 Arduino 控制板及 Python 控制脚本。运行期间，计算机负责协调微孔板读数仪测量、数据导出、蓝牙通信及 LED 驱动。必须保持 Gen5 软件窗口可见，因为 Python 脚本需基于屏幕自动化与微孔板读数仪软件交互。成功启动的标志包括：预期文件夹中出现导出的数据文件、终端输出确认蓝牙通信正常，以及每个控制间隔 LED 指令均得到更新。

  1. 将开关向左滑动以启动 LEMOS 2.0 设备。LEMOS 2.0 中 LED 灯带上的第一个 LED 将亮起绿色指示灯。
  2. 通过 USB 将中央 Arduino 连接到计算机，并在 Arduino IDE 的下拉菜单中选择该设备。工具 > 董事会).
  3. 打开 串行监视器 并将位于 LEMOS 2.0 中的外围 Arduino 连接到中央 Arduino。
  4. 通过输入字母关闭 LED 灯带上的指示灯。 'o' 进入串行监视器。
  5. 打开实验文件 LEMOS-起始数据.xpt 在 Gen5 中，对设备内的培养物进行基线读数，确保光密度600 且荧光数值与预期相符。关闭实验文件。
  6. 打开步骤 5.4 中保存的 Gen5 协议文件，参照以下步骤将其另存为实验文件： 补充文件 2 （第 3 节） 以及 补充文件 3.
  7. 确保系统已安装 Python 3.10 或更高版本，并使用提供的 requirements.txt 文件安装所需软件包。
  8. 开放 control_duty_cycle.py （用于占空比实验）或 control_pid.py （适用于PID实验）在任何合适的集成开发环境中，例如 Visual Studio Code 或 Spyder。
    注意：请确保将工作目录设置为包含所有 Python 脚本的文件夹，以便在脚本执行期间可以导入这些脚本。集成开发环境的选择并不关键。
  9. 在 主要 在 Python 脚本的相应部分进行修改 文件 变量应与步骤 7.6 中为 Gen5 实验文件选择的文件名相匹配。
  10. 将实验文件与 Python 脚本并排设置图 1).
  11. 点击 运行 在 Gen5 实验中，一旦动力学步骤开始，立即中止。
    注意：Python 脚本会查找一个 继续 点击后按钮 运行然而，在新创建的实验文件中，该按钮仅在完成第二次读数或中止动力学运行后才会显示。
  12. 运行 Python 脚本。在程序运行期间，请勿最小化或遮挡 Gen5 窗口。
    注意：Python 脚本采用基于屏幕的自动化技术，必须能够每隔约 20 分钟定位 Gen5 软件窗口，以处理每个动力学循环后的数据导出。在此期间，若窗口被遮挡或最小化，可能导致实验中断。

8. 设备清洁、PDMS 去除与电池充电

注意：实验结束后，请清洁并重置 LEMOS 2.0 设备。移除细菌培养物和已使用的 PDMS 微孔，对可重复使用的框架和外壳进行消毒，并为下一次运行充电。清洁过程中，请避免将非 LED 电子组件暴露于乙醇中或使其受到过度的机械力。

  1. 轻轻从 LEMOS 2.0 装置顶部揭下医用级密封膜并丢弃。
  2. 使用移液器，按照生物废弃物处理程序，吸弃每个微孔中的所有细胞悬液。
  3. 将 LEMOS 2.0 框架的外壳分离时，需施加平稳、均匀的力。避免对 PLA 框架进行过度弯曲或扭转，否则可能导致其开裂或永久变形。
  4. 剥离框架外部的块状PDMS层，并使用镊子小心地从LEMOS 2.0框架中移除PDMS微孔。
  5. 使用 70% 乙醇对 LEMOS 2.0 框架和外壳进行消毒，避免与除 LED 以外的任何电气部件直接接触，具体操作如步骤 4.1 所述。
  6. 为下一项实验对锂离子电池进行充电：
    1. 将滑动开关拨至右侧/充电位置。
    2. 将 USB 连接至充电模块。
    3. 通过板载 LED 确认充电状态，充电时 LED 将闪烁补充图 1E).

9. 荧光与生长动态分析

注意：同步处理荧光信号与光密度值600 LEMOS 2.0 实验期间生成的数据。分析笔记本导入导出的酶标仪数据，应用空白和阴性对照校正，计算归一化荧光值，并生成时程曲线图。运行笔记本前，请确认微孔分配和条件标签与实验布局相符。

  1. 打开任意一个 FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb 或 FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
    注意：本方法使用运行过程中生成并存储于这些文件中的荧光（FL）与光密度（OD）数据。 数据文件/fl.csv 以及 数据文件/od.csvPID分析表还使用了存储于其中的设定点表达误差。 数据文件/错误.csv.
  2. 设置条件变量，包含条件名称与孔位。
  3. 设置 阴性孔 等于一个括号内的阴性对照微孔名称列表。
  4. 设置 空白对照 以及 fl_blank 相对于空白孔的平均值，或在未设置空白孔时相对于已知值。
  5. 设置 四色图 至所需颜色（完整命名颜色列表请访问 https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html）。
  6. 将图形尺寸设置为所需宽度和高度（以英寸为单位）。
  7. 确认“文件名”下列出的文件 常量.
  8. 运行该笔记本，图表将生成为 .png 文件。

10. 故障排除

  1. 在 LED 焊接过程中，若 LED 焊盘脱落，请考虑以下方案：
    1. 将 LED 灯带的边角弯折，以便更轻松地将导线穿过接线端口。
    2. 若先前使用的是较硬（实心）导线，请更换为更柔韧（绞合）的导线。
  2. 如果开关已打开且 BLE Nano'如果电源 LED 指示灯未亮起，请考虑以下情况：
    1. 首先，确认电池是否已充电。将开关调至充电模式，并将充电模块连接至电源。若电池已充电，指示灯 LED 应在数分钟后停止闪烁并转为常亮绿色。若电池电量已耗尽，请先将其完全充电后再重新尝试。
    2. 若电池已充电且 LED 仍不亮，请使用万用表测量 BLE Nano 两端的电压。's VIN 和 GND 引脚。
      1. 0 V：线路连接断开。请检查电池沿线的每个焊点。 > 开关 > 升压转换器 > 对任何看起来温度不足或焊接不完整的接点，进行纳米路径修复与回流处理。
      2. 5 V：电源已正确接入 Nano，因此电路板本身可能已损坏。尝试通过电缆为 Nano 供电以确认此问题。若电源指示灯仍未亮起，请焊接一块新的 Nano 以替换故障的 Nano。
      3. 大于 5 V：升压转换器未配置为输出 5 V。请确认升压转换器上的焊盘 A 和 B 已断开连接，如设备组装部分所述。
  3. 如果 Python 脚本运行失败，请考虑以下情况：
    1. 确认 Python 脚本是否从其完整项目文件夹内打开，而非作为独立文件打开；control_duty_cycle.py 和 control_pid.py 均依赖于其他本地模块，若独立打开将会失败。
    2. 确认 Arduino IDE 已关闭，因为 Arduino 一次只能维持一个活动连接。操作系统会将端口访问权限授予最先打开该端口的程序。
    3. 确认 Gen5 实验方案设置正确，尤其是在使用不同软件时。请参考 补充文件 2 （第 2 节）。
    4. 确保已安装所需软件包。创建虚拟环境并按照 requirements.txt 文件所列清单安装软件包。
  4. 若实验意外中断，请考虑以下因素：
    1. 首次循环后停止：Gen5 数据导出路径可能配置错误。请确认导出目标文件夹与 Python 脚本预期读取的文件夹一致。 文件 变量。
    2. 运行数轮后停止：PyAutoGUI 偶尔无法识别屏幕上的元素，这通常发生在屏幕分辨率、显示缩放比例或窗口大小发生变化后。请重新截取脚本所使用的参考截图，并在整个运行过程中保持 Gen5 窗口处于活动状态并位于前台；Python IDE 窗口可以最小化。
    3. 若 Gen5 软件报告反应室温度超出目标范围，请等待读数仪达到平衡后再继续操作。切勿忽略温度警告，否则可能触发需手动关闭的审计报告窗口，并可能中断自动化流程。
  5. 若吸光度值异常偏高或不一致600若观察到各微孔间的荧光基线值存在差异，请考虑以下因素：
    1. 检查PDMS微孔中是否有灰尘或碎屑残留，这些杂质会散射光线并导致读数虚高。
    2. 在浇铸或使用前，应避免将PDMS长时间暴露于环境空气中且不加覆盖。
  6. 若细胞在实验过程中对光刺激无任何可检测的响应，请考虑以下因素：
    1. 确认 LED "关于" 通过同时检查集成开发环境终端输出与蓝牙低能耗通信日志来发出指令。
    2. 若指令已发送但未见光信号，请使用万用表检查 LED 的焊接连接点。

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结果

LEMOS 2.0 是一种具有32个微孔、兼容微孔板读数仪的平台24，可用于程序化光遗传学刺激和定量基因表达检测（图2A、B）。每个微孔均配备一个独立寻址的WS2812B发光二极管（LED），由Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2通过Adafruit_NeoPixel库进行控制。该设备通过蓝牙与外部计算机通信，可在实验过程中实时更新光照指令。使用前，通过复制模塑法将新鲜的PDMS微孔浇铸至设备中（图2C、D）。在30 °C条件下，于LEMOS 2.0中在LED持续光照下培养的E. coli菌液在各微孔间表现出可重复的生长曲线，表明该设备支持在整个实验过程中进行细菌培养及微孔板读数仪检测18（图2E）。此外，在不同光照条件下，生长曲线相似，表明在此实验设置下，...

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讨论

本方案描述了LEMOS 2.0的制备与操作方法，LEMOS 2.0是一种嵌入LED的32孔微孔板，可在标准微孔板读数仪内进行光遗传学刺激及反馈控制实验。代表性实验表明，LEMOS 2.0支持微生物生长（图2E），在光照条件下未观察到显著的光毒性。此外，LEMOS 2.0减少了光泄漏至相邻暗条件微孔的现象（图3D），从而提高了暗对照及空间模式化刺激实验的可靠性。同时，LEMOS 2.0实现了基于占空比的光遗传学操控（图3E），并可在分批培养中实现基因表达的闭环PID控制（图4B）。

在光遗传学实验中，光漂白是一个重要的考虑因素，因为相同的光学工作流程既用于光刺激，也用于荧光信号读取27。LEMOS 2.0 使用商用 RGB LED，其包含三个发射峰分别位于 620–630 nm（红光）、515–525...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者 B.J.、T.S.B. 和 H.R.N. 获得了德克萨斯农工大学系统校长研究卓越计划的支持。&M 工程实验站。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
22 AWG 多股连接线 AmazonASIN: B089CQ2N69用于连接电路的低成本导线。实心或多股导线均可接受。
8 针 3 位 2P3T DP3T 滑动开关 侧拨旋钮AmazonASIN: B007Q9Y8YC开关和引脚应位于相邻两侧，而非相对两侧（后者更常见）。
Arduino Nano 33 BLE Rev 2ArduinoABX00071微控制器 – 扁平外形和蓝牙低功耗功能适用于外设设备需求。
Arduino Nano 33 IoTArduinoABX00027微控制器 – 用作中心设备。
BioTek Synergy H1 微孔板读板仪Agilent (BioTek)—或具有动力学模式的兼容微孔板读板仪
Breathe-Easy 透气封板膜USA Scientific9123-6100医用级封板膜；透气型微孔板密封膜
氯霉素（乙醇中 25 mg/mL 储存液）Various—工作浓度 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200Mann Release Technologies脱模剂
聚酰亚胺胶带（Kapton Tape）AmazonASIN: B07F8TZZ4N
LB 琼脂平板及相应抗生素实验室自制—假定这些材料已具备。
锂离子 3.7 V 电池，3000 mAh（11.1 Wh），尺寸 104060UfineUFX0391-03 应附带 JST PH 2 针公头线缆。由 Liter Energy 生产，多家零售商销售。
带 Type-C USB（5V 1A）的锂离子电池充放电模块AmazonASIN: B0CTMJMRKZ在 Amazon 上搜索“Replaces TP4056”。略过标准 TP4056 模块，选择标题中注明“Replaces TP4056”的小型黑色模块产品。
锂离子 JST PH 2 针线缆 – 母接头 100 mmVariousASIN: B07NWNPB77必须与电池’s 的 JST 接头兼容。
微型升压模块 3.7 V 至 5 V/8 V/9 V/12 V 升压板 带 LED 指示灯Amazon (Teyleten Robot)ASIN: B0B4TB9QNY[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
Nunc OmniTray 单孔培养皿Thermo Scientific242811外壳
pNO286-3Addgene质粒 #107746编码组成型表达的 CcaS
pSR58.6Addgene质粒 #63176编码组成型表达的 CcaR 以及在 PcpcG2 启动子控制下的 sfGFP
电烙铁和焊锡Various—建议：细尖烙铁，使用助焊剂芯或松香芯焊锡。
壮观霉素（50 mg/mL 储存液）Various—工作浓度 50 µg/mL
无菌培养管（14 mL 圆底）Various—
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体（基础剂 + 固化剂）SYLGARD 184固化剂与基础剂质量比为 1:10
USB-A 转 Micro USB 数据线Various—用于将 Arduino 开发板连接至计算机。必须为支持数据传输的线缆，而非仅用于充电的线缆。
USB-A 转 USB-C 充电线Various—连接至电池充电模块
真空干燥器及真空泵Various—用于对 PDMS 脱气
WS2812B IC SPI RGB 像素 LED 灯带，100 LED/m，DC5V，IP30，黑色Amazon (BTF-LIGHTING)ASIN: B088B8G8LD ; BTF-LIGHTING 部件号: WS2812B1M100LB30可单独寻址的 LED 灯带。100 LED/m。电压：5 V。IP30 表示防水等级。黑色优于白色，因其反光较少。

参考文献

  1. Kumar S, Khammash M. Platforms for optogenetic stimulation and feedback control. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:918917.
  2. Milias-Argeitis A, et al. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nat Commun. 2016;7:12546.
  3. Gutierrez Mena J, Kumar S, Khammash M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nat Commun. 2022;13(1):4808.
  4. Lugagne JB, Blassick CM, Dunlop MJ. Deep model predictive control of gene expression in thousands of single cells. Nat Commun. 2024;15(1):2148.
  5. Steel H, Habgood R, Kelly CL, Papachristodoulou A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000794.
  6. Lugagne JB, et al. Balancing a genetic toggle switch by real-time feedback control and periodic forcing. Nat Commun. 2017;8(1):1671.
  7. Chait R, et al. Shaping bacterial population behavior through computer-interfaced control of individual cells. Nat Commun. 2017;8(1):1535.
  8. Harmer ZP, McClean MN. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit (vol 12, pg 1943, 2023). ACS Synth Biol. 2023;12(11):3505.
  9. Abkar L, et al. Enhanced reproducibility and precision of high-throughput quantification of bacterial growth data using a microplate reader. J Vis Exp. 2022;185:63849.
  10. Olson EJ, et al. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nat Methods. 2014;11(4):449-456.
  11. Bugaj LJ, Lim WA. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 2019;14(7):2205-2228.
  12. Repina NA, et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 2020;31(10):107737.
  13. Höhener TC, et al. LITOS: A versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Sci Rep. 2022;12(1):13139.
  14. Vogt A, et al. Simultaneous spectral illumination of microplates for high-throughput optogenetics and photobiology. Biol Chem. 2024;405(11-12):751-763.
  15. Kumar S, et al. Diya: A universal light illumination platform for multiwell plate cultures. iScience. 2023;26(10):107862.
  16. Soffer G, Perry JM, Shih SCC. Real-time optogenetics system for controlling gene expression using a model-based design. Anal Chem. 2021;93(6):3181-3188.
  17. Benman W, et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. Commun Biol. 2023;6(1):1192.
  18. Namboothiri HR, et al. Closed-loop optogenetic control in a microplate reader. ACS Synth Biol. 2026;15(6):2356-2365.
  19. Worldsemi. WS2812B intelligent control LED integrated light source. 2026: https://cdn-shop.adafruit.com/datasheets/WS2812B.pdf
  20. Lambert TJ. FPbase: A community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 2019;16(4):277-278.
  21. Xia YN, et al. Replica molding using polymeric materials: A practical step toward nanomanufacturing. Adv Mater. 1997;9(2):147-149.
  22. Ong NT, Tabor JJ. A miniaturized Escherichia coli green light sensor with high dynamic range. ChemBioChem. 2018;19(12):1255-1258.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 1991;204:63-113.
  24. ANSI SLAS 1-2004 (R2012). Footprint dimensions. At https://www.slas.org/SLAS/assets/File/public/standards/ANSI_SLAS_1-2004_FootprintDimensions.pdf.
  25. Åström KJ, Murray RM. Feedback systems: An introduction for scientists and engineers. Princeton University Press; Princeton, NJ; 2008.
  26. Namboothiri HR, Pandey A, Hu CY. Resolving emergent transient oscillations in gene circuits with a growth-coupled model. Sci Adv. 2026;12(6):eadz2310.
  27. Song LL, Hennink EJ, Young IT, Tanke HJ. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J. 1995;68(6):2588-2600.
  28. Campbell DJ, et al. Replication and compression of bulk and surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J Chem Educ. 1999;76(4):537-541.

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