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方法文章

一种优化的人诱导多能干细胞血管类器官生成方案

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DOI：

10.3791/73561

⸱

2026年9月3日

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

本文内容

摘要

本方案介绍了一种利用人诱导性多能干细胞生成血管类器官的方法。

摘要

由人多能干细胞（hPSCs）衍生的血管类器官已成为研究血管发育、疾病机制及药物反应的强有力三维模型。现有的血管类器官方案可生成自我组织化的内皮细胞–周细胞网络；然而，批次间差异、类器官形成不一致以及周细胞覆盖不足等问题可能影响其可重复性与可扩展性。本研究提出了一种优化的从人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成血管类器官的方案，显著提高了可重复性与结构的一致性。关键优化包括：改进拟胚体形成的条件，优化中胚层诱导与血管特化阶段生长因子的浓度与作用时间，以及改善三维培养条件，以促进周细胞的有效招募及内皮–周细胞间的相互作用。优化后的类器官表现出高度分支的CD31阳性内皮网络，并被PDGFR-β阳性周细胞稳定包绕，与原始方案相比，批次间变异显著降低。本文提供了类器官生成、整体免疫荧光表征及质量控制评估的详细分步操作流程。该优化方法可实现高质量血管类器官的规模化生产，适用于研究血管细胞相互作用、疾病建模及化合物筛选，从而降低了实验室采用此类模型系统的技术门槛。

引言

三维（3D）类器官已成为研究人类器官发育与疾病的有力工具 体外与传统的二维细胞培养模型相比，具有更优的结构仿生性和病理生理相关性1,2近年来，已成功建立了多种组织类型的人多能干细胞（hPSC）来源类器官，包括肠道3, 脑4,5，肾脏6，肝脏7,8，以及视网膜9然而，类器官研究中的一个主要挑战是在长期培养过程中血管化不足，这可能导致缺氧和坏死，从而阻碍类器官的扩增与分化10,11为解决这一局限性，已提出多种共培养策略，包括引入内皮细胞或间充质干细胞以促进血管网络的形成12,13然而，传统的二维培养和动物模型无法完全再现人类血管生物学特征，而共培养方法则会引入额外的实验复杂性。14因此，能够自主血管化的血管类器官提供了一种颇具前景的人源性替代方案。15.

血管网络的形成涉及血管发生和血管生成，这一过程由内皮细胞与壁细胞（如周细胞和血管平滑肌细胞）之间的相互作用所协调，并受到多种信号分子的严格调控，包括VEGF（血管内皮生长因子）、TGF-β（转化生长因子-β）、PDGF（血小板源性生长因子）和血管生成素16。2019年，Wimmer及其同事建立了一种直接从人多能干细胞（hPSCs）生成自组装三维血管类器官的方法17,18。该体系可同时生成内皮细胞和周细胞，形成具有管腔结构和基底膜覆盖的微血管网络。在此平台基础上，血管类器官已被用于在高糖和促炎性细胞因子（TNF-α和IL-6）刺激下模拟糖尿病性血管病变；这些类器官重现了基底膜增厚的现象，这是糖尿病微血管病变的典型特征17。此外，该模型还被用于研究遗传性血管疾病，并作为血管毒性筛选的平台19。最近，一些以方法优化为导向的研究进一步改进了血管类器官的生成策略。例如，单细胞RNA测序技术的进步鉴定出关键调控因子如MECOM和LEF1，为表征和优化人类血管类器官的形成提供了分子框架。此外，Xu等人引入了微孔阵列以促进均一胚体的形成，并加入CEPT cocktail以提高细胞存活率，从而有效降低了批次间的差异性20。

为了提高血管类器官生成的均一性、可重复性和通量，本研究对 Wimmer 等人17,18 描述的原始方案进行了系统性优化，以解决若干关键局限性。首先，原始方案采用在低吸附培养板中自然聚集的方式形成类胚体，可能导致聚集体尺寸在批次间存在较大差异，从而引起分化效率的不均一。在优化后的方案中，聚集体形成阶段结合使用聚乙烯醇（PVA）和轨道振荡，以促进细胞均匀聚集，提高类胚体尺寸的一致性。其次，原始方案在血管网络形成阶段采用完全更换培养基的方式，可能导致生长因子浓度剧烈波动，影响血管出芽的持续进行及周细胞的募集。相比之下，优化方案在每次换液时保留三分之一的条件培养基，以维持内源性促血管生成因子，稳定培养环境。第三，原始方案在类器官分离与成熟过程中需要多次转移培养板，增加了操作步骤及类器官丢失的风险。优化方案通过将分离后的类器官直接单个转移至96孔低吸附培养板的孔中，避免了上述步骤，从而简化了操作流程并提高了通量。综上所述，该优化方案提供了详细的分步操作流程和关键的质量控制节点，降低了采用该模型系统的操作门槛，有助于推动血管类器官在血管发育、疾病机制研究及高通量药物筛选中的广泛应用。

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方案

本研究中使用hPSCs已获得安徽大学生物医学伦理委员会（BECAHU_2026-010）批准。

1. 人类诱导性多能干细胞的培养

注意：在无饲养层条件下培养人诱导多能干细胞（hiPSCs）。所有操作均须在II级生物安全柜中进行，并采用无菌技术。

  1. 基底膜基质包被培养板的制备
    1. 从 −20 °C 取出一瓶基底膜基质，在 4 °C 条件下过夜解冻约 12–16 小时。避免反复冻融。
    2. 在无菌条件下将解冻后的基底膜基质充分混匀，并分装成单次使用量（例如每管 1 mL）。分装后可在 −20 °C 保存长达 2 年。
      注意：操作过程中应保持基底膜基质、移液器、枪头和离心管处于低温状态，以防止提前凝固。避免引入气泡。
    3. 将所需用量的基底膜基质分装物置于冰上解冻。用预冷的 DMEM 按 1:200 的比例稀释基底膜基质（每 1 mL DMEM 中加入 5 µL 基底膜基质；终浓度约为 5 µg/mL）。
    4. 通过移液轻轻混匀溶液，直至无可见颗粒残留。
    5. 向 12 孔板的每孔中加入 0.5 mL 稀释后的基底膜基质。轻轻倾斜并旋转培养板，使底部表面完全被覆盖。
    6. 将包被好的培养板在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育至少 2 小时，或在 4 °C 过夜。
      注意：密封后可在 4 °C 保存 1–2 周。使用前将培养板恢复至室温，并立即吸除包被液。
  2. 人诱导多能干细胞（hiPSCs）的解冻
    1. 从液氮中取出一支冻存的 hiPSCs 冻存管，立即放入 37 °C 水浴中。轻轻摇动冻存管，当仅剩少量微小冰晶时（1 分钟内）取出。
      注意：避免在 37 °C 下长时间暴露于二甲基亚砜（DMSO）以及不完全解冻，这两种情况均会降低细胞活力。
    2. 用 70% 乙醇对外表面进行消毒，并在生物安全柜内打开。
    3. 将细胞悬液缓慢逐滴加入含有 3 mL 预热的化学成分明确的 hPSC 维持培养基（或等效的化学成分明确维持培养基）的 15 mL 圆底离心管中。转移过程中轻柔混匀，以逐步稀释 DMSO，减少渗透压应激。
    4. 使用摆动桶转子，在室温（22–24 °C）下以 300 × g 离心 3 分钟。
    5. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将沉淀轻柔重悬于 1 mL 预热的化学成分明确的 hPSC 维持培养基中。
      注意：使用 P1000 移液器轻柔吹打 2–3 次，以最大限度减少机械剪切力和气泡产生。
  3. hiPSCs 的接种与培养
    1. 从培养箱中取出预先包被的 12 孔板，吸除包被液。无需洗涤各孔。
    2. 常规复苏解冻后，每孔接种约 1 × 105–2 × 105 个活细胞。根据 hiPSC 细胞系及实验需求调整接种密度。
    3. 将细胞悬液沿每孔壁缓慢加入，避免移液枪头接触包被表面。
    4. 加入 Y-27632 至终浓度为 5 µM，以促进细胞解冻后的存活与贴壁。
      注意：仅在初次接种培养基中使用 Y-27632。次日更换为不含 Y-27632 的化学成分明确的 hPSC 维持培养基。
    5. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 及饱和湿度条件下培养。
    6. 约 16–24 小时后观察细胞贴壁情况和形态。吸除培养基，并更换为新鲜预热的不含 Y-27632 的化学成分明确的 hPSC 维持培养基。
    7. 每日或隔日更换培养基，直至细胞达到约 70%–80% 汇合度，用于传代或分化。
      注意：每日观察培养状态。选择具有紧密、边界清晰的克隆形态、高核质比且自发分化程度低的细胞集落。

2. 人类诱导多能干细胞聚集体的生成与分化

注意：将人诱导多能干细胞（hiPSCs）在化学成分明确的hPSC维持培养基中，以无饲养层条件培养于基底膜基质包被的培养板上。使用0.02% EDTA每4–5天传代一次。为最大化血管分化效率，应使用接种密度和克隆大小适宜、且自发分化程度最低的细胞培养物。

  1. 单细胞悬液的制备
    1. 吸除化学成分明确的hPSC维持培养基，并用0.5 mL DMEM洗涤6孔板每孔中的hiPSC。
    2. 吸除DMEM，每孔加入0.5 mL 0.02% EDTA。室温（22–23 °C）孵育2–4分钟，观察细胞直至细胞开始变圆。
    3. 使用P1000移液器吹打使细胞脱离，轻柔吹打2–3次，将细胞团解离为单细胞悬液。
    4. 将细胞重悬于5 mL化学成分明确的hPSC维持培养基中，并将悬液转移至15 mL锥形管。
    5. 取10 µL细胞悬液与10 µL 0.1%台盼蓝溶液混合。取10 µL混合液加入细胞计数板，测定活细胞数量。
    6. 计算获得每孔5 × 105个活细胞所需的细胞悬液体积。
    7. 在室温（22–23 °C）下以300 × g离心5分钟，吸除上清液。
    8. 将细胞重悬于新鲜的化学成分明确的hPSC维持培养基中，每孔体积为3 mL，培养基中含50 µM Y-27632。
  2. 细胞团形成
    1. 将3 mL细胞悬液加入低吸附6孔板的每孔中，并加入PVA至终浓度为0.25%。
    2. 将培养板置于50 rpm的摇床上，37 °C孵育1天。
    3. 在继续下一步前，确认形成的细胞团具有光滑的边界，直径约为50–100 µm或更大。
    4. 注意：针对不同hiPSC细胞系优化聚集时间。必要时可将孵育时间延长至2–3天，以获得所需大小的细胞团。
  3. 中胚层诱导
    1. 第0天，使用无菌10 mL一次性移液管将细胞团转移至15 mL锥形管中。保留原始低吸附培养板用于后续重铺。
    2. 让细胞团依靠重力自然沉降约15–20分钟。
    3. 注意：操作细胞团时应轻柔，使用重力沉降而非离心，以尽量减少机械损伤。
    4. 细胞团沉降后，小心吸除上清液。
    5. 将细胞团重悬于每孔3 mL N2B27培养基中，培养基中添加12 µM CHIR99021和30 ng/mL BMP-4。
    6. 将细胞团转移回低吸附培养板，37 °C继续孵育。
    7. 每天使用P1000移液器轻柔吹打一次细胞团，以减少过度融合。中胚层诱导持续3天。
  4. 血管谱系诱导
    1. 第3天，将细胞团转移至15 mL锥形管中，依靠重力自然沉降。保留原始6孔板。
    2. 细胞团沉降后，小心吸除上清液。
    3. 将细胞团重悬于每孔3 mL N2B27培养基中，培养基中添加100 ng/mL VEGF-A和2 µM forskolin。
    4. 将细胞团转移回低吸附6孔板，继续孵育2天。

3. 血管网络和类器官的生成

  1. 胶原蛋白 I–基底膜基质的制备
    1. 收集在一个 6 孔板中生成的类器官聚集体，用于包埋至一个 12 孔板中。每孔使用约 40–60 个聚集体。
    2. 准备足够的胶原蛋白 I–基底膜基质混合物，为 12 孔板的每个孔添加两层，每层 0.5 mL。
    3. 为一个 12 孔板准备 12 mL 基质。所有组分保持在冰上，使用前立即配制混合物，并避免引入气泡。
    4. 向 12 孔板的每个孔中加入 0.5 mL 基质。轻轻摇晃培养板，使基质均匀分布。
    5. 将培养板在 37 °C 下孵育 2 h，使第一层基质凝固。
  2. 类器官聚集体的包埋
    1. 使用无菌的 10 mL 一次性移液管将聚集体转移至 15 mL 圆锥形离心管中，并通过重力使其自然沉降。
    2. 吸除上清液，并用 1 mL N2B27 培养基将聚集体清洗两次。最后一次清洗后，尽可能去除残留的培养基。
    3. 配制新鲜的胶原蛋白 I–基底膜基质混合物，并将其保持在冰上。
    4. 将清洗后的聚集体轻轻重悬于新配制的基质中。
    5. 从培养箱中取出含有已凝固第一层的 12 孔板。
    6. 向每个孔中加入 0.5 mL 含聚集体的基质。
    7. 轻轻摇动培养板，时间不超过 1 min，使聚集体均匀分布。
    8. 立即在 37 °C 下孵育 2 h，使第二层基质凝固。
  3. 血管出芽的诱导
    1. 将添加了 15% FBS、100 ng/mL VEGF-A 和 100 ng/mL FGF-2 的 N2B27 培养基预热至 37 °C。
    2. 将预热的补充培养基加入各孔，以诱导血管分化。
    3. 在接下来的 1–3 天内监测培养物中的血管出芽情况。
    4. 注意：在将培养基加入培养物前，应将其预热至 37 °C，以尽量减少凝胶基质的不稳定。
  4. 培养基更换与培养维持
    1. 包埋后第 3 天进行首次换液。
    2. 此后每隔一天更换一次培养基，使用含 15% FBS、100 ng/mL VEGF-A 和 100 ng/mL FGF-2 的新鲜 N2B27 培养基。
    3. 每次换液时保留三分之一的条件培养基，并用新鲜补充培养基替换剩余的三分之二。
  5. 在第 10 天进行血管类器官的分离。

4. 血管类器官的建立及染色前准备

  1. 分离单个血管网络
    1. 将无菌刮勺的圆头沿孔板边缘插入，并轻轻将凝胶基质从底部剥离。
    2. 继续将刮勺从孔板边缘向中心移动，直至整个凝胶基质自由漂浮。
    3. 使用两根无菌针从凝胶中切除单个血管网络。在不损伤血管网络的前提下，尽可能去除多余的基质。
  2. 分离类器官的培养
    1. 使用无菌一次性移液器将每个分离的类器官直接转移至低吸附96孔板的单个孔中。
    2. 向每孔中加入100 µL N2B27培养基，添加15% FBS、100 ng/mL VEGF-A和100 ng/mL FGF-2。
    3. 将类器官继续培养5天，并每天更换添加了补充物的培养基。
    4. 在成熟第5天确认类器官呈现圆形且完全包被的形态。
  3. 血管类器官的固定
    1. 将形态成熟的类器官转移至2 mL微量离心管中。每管处理的类器官数量不超过约60个。
    2. 小心吸除培养基，并加入含4%多聚甲醛（PFA）的PBS。
    3. 在室温下固定类器官1小时。
      注意：PFA具有毒性且为疑似致癌物。操作时应在化学通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备。
    4. 吸除PFA，替换为PBS。
      暂停点：固定的血管类器官可在4 °C的PBS中保存长达1个月。

5. 血管类器官的染色与共聚焦成像

  1. 封闭与通透化
    1. 向每个含有固定血管类器官的离心管中加入 2 mL 封闭缓冲液。
    2. 将离心管垂直置于摇床上，室温震荡孵育 2 小时，以实现类器官的封闭与通透化。
  2. 一抗孵育
    1. 吸除封闭缓冲液，加入 50–100 µL 用封闭缓冲液按 1:100 稀释的一抗溶液。
    2. 将离心管直立放置于摇床上，4 °C 震荡孵育过夜。
  3. 洗涤与二抗孵育
    1. 用 PBST 洗涤样本 3 次，每次 10–15 分钟，洗涤过程中保持离心管垂直并持续震荡。
    2. 加入用封闭缓冲液按 1:300 稀释的荧光标记二抗。
    3. 室温孵育 2 小时。
  4. 细胞核复染与最终洗涤
    1. 用 PBST 洗涤样本 2 次，每次 10–15 分钟。
    2. 加入用 PBS 按 1:5,000 稀释的 Hoechst 溶液，室温孵育 10–15 分钟。
    3. 用 PBS 洗涤 10–15 分钟。
  5. 共聚焦成像
    1. 将染色后的类器官转移至共聚焦成像培养皿中。
    2. 在所有实验组中采用一致的成像参数获取共聚焦图像。
  6. 血管类器官的定量图像分析
    注意：使用 Fiji/ImageJ 和 AngioTool 进行定量图像分析。所有实验组须保持显微镜采集参数一致。
    1. 聚集体直径测量
      1. 使用带有校准标尺的倒置显微镜获取第 0 天 hiPSC 聚集体的明场图像。选择彼此分离良好的聚集体成像，并在图像中包含比例尺。
      2. 将每张图像导入 Fiji/ImageJ。使用“直线”工具沿比例尺画线，然后选择 分析 > 设置标尺。
      3. 输入已知距离和单位（例如 100 µm），并选择 全局，以将该标尺校准应用于当前会话中的所有图像。
      4. 使用“直线”工具沿每个聚集体最宽处画线。选择 分析 > 测量 或按 Ctrl+M，记录直径（单位：µm）。
      5. 每批至少测量 30 个聚集体。
      6. 对于非球形聚集体，使用椭圆或多边形选择工具勾勒每个聚集体轮廓。选择 分析 > 设置测量值 > Feret 直径，并记录测量值。
      7. 从“结果”表格中导出测量数据，并将数据汇编至电子表格中。
      8. 计算每批的平均值、标准差（SD）和变异系数（CV），其中 CV = SD/平均值 × 100%。
    2. 类器官直径测量
      1. 使用带有校准标尺的倒置显微镜获取第 15 天成熟血管类器官的明场图像。每张图像中均需包含比例尺。
      2. 将每张图像导入 Fiji/ImageJ，并按照步骤 5.6.1.2 所述方法校准标尺。
      3. 使用“直线”工具沿每个类器官最宽处画线。选择 分析 > 测量 或按 Ctrl+M，记录直径（单位：µm）。
      4. 每批至少测量 30 个类器官。
      5. 对于形状不规则的类器官，测量其最长和最短直径，取其平均值；或按照步骤 5.6.1.6 所述方法测定 Feret 直径。
      6. 导出测量数据，并计算每批的平均值、SD 和 CV。
    3. CD31 阳性血管面积的定量
      1. 获取第 15 天经 CD31 染色的完整血管类器官的共聚焦 z 轴层扫图像。所有样本使用相同的激光功率、增益、偏移和针孔设置。
      2. 使用显微镜软件或 Fiji/ImageJ 从 z 轴层扫图像生成最大强度投影（MIP）。
      3. 应用强度阈值分割 CD31 阳性血管网络，同时排除背景信号。
      4. 选择 处理 > 噪声 > 去除杂点，使用 2–5 像素的半径去除微小伪影。选择 处理 > 二值化 > 填充空洞，以填补血管网络内的微小间隙。
      5. 选择 分析 > 设置测量值，启用 面积 和 面积分数。选择 分析 > 测量，以确定血管面积。
      6. 将 CD31 阳性血管面积计算为占类器官总面积的百分比。
      7. 从三次独立实验批次中，每批至少分析三个类器官。导出测量数据用于统计分析。
    4. PDGFR-β 阳性周细胞覆盖率的定量
      1. 获取第 15 天经 CD31 和 PDGFR-β 染色的完整类器官的共聚焦 z 轴层扫图像。生成 MIP 图像。
      2. 将 CD31 和 PDGFR-β 的 MIP 图像导入 Fiji/ImageJ，确认图像对齐。
      3. 对 CD31 通道进行阈值处理，生成定义血管网络的二值化掩膜。
      4. 采用相同的分割方法对 PDGFR-β 通道进行阈值处理，生成周细胞信号的二值化掩膜。
      5. 选择 处理 > 图像计算器，对 CD31 和 PDGFR-β 掩膜执行 AND 运算，以识别重叠像素。
      6. 测量重叠信号的面积。
      7. 计算周细胞覆盖率：（CD31 阳性血管内 PDGFR-β 阳性面积 / 总 CD31 阳性血管面积）× 100%。
      8. 从三次独立实验批次中，每批至少分析三个类器官。导出测量数据用于统计分析。
    5. 使用 AngioTool 进行分支指数分析
      1. 获取第 15 天经 CD31 染色的完整类器官的共聚焦 z 轴层扫图像。生成 MIP 图像。
      2. 启动 AngioTool，加载 MIP 图像。
      3. 根据图像中观察到的典型血管直径设置血管直径参数。
      4. 调整强度阈值以分割血管网络并排除背景信号。设置最小血管尺寸以排除微小伪影。
      5. 运行分析，记录血管面积、血管密度、总血管长度、分支节点数量和分支指数。
      6. 验证输出图像：确认血管以黄色轮廓显示，血管骨架以红色显示，分支点以蓝色圆点标记。
      7. 从 AngioTool 导出定量结果。
      8. 从三次独立实验批次中，每批至少分析三个视野，并将数据汇编用于统计分析。

6. 血管类器官的定量实时 PCR 分析

注意：所有 RNA 提取及后续操作均须在无 RNase 条件下进行。

  1. RNA 提取
    1. 在 1.5 mL 无 RNase 的微量离心管中收集 5–10 个成熟的第 15 天血管类器官。彻底去除残留培养基。
      注意：必要时可合并多个类器官以获得足够的 RNA。
    2. 加入含 1% β-巯基乙醇的裂解缓冲液 350 µL。
    3. 用移液器吹打样品 10–15 次，直至类器官完全裂解。
    4. 将裂解液转移至置于收集管中的基因组 DNA 去除离心柱。室温下以 11,000 × g 离心 30 秒。
    5. 弃去离心柱，保留穿流液。
    6. 向穿流液中加入等体积的 70% 乙醇（约 350 µL），并通过移液充分混匀。
    7. 将最多 700 µL 混合液转移至置于收集管中的 RNA 离心柱。以 11,000 × g 离心 30 秒后弃去穿流液。
    8. 向离心柱中加入 350 µL 洗涤缓冲液 1。以 11,000 × g 离心 30 秒后弃去穿流液。
    9. 按每份样品将 10 µL DNase I 与 70 µL DNase 消化缓冲液混合，配制 DNase I 反应液。
    10. 直接向离心柱膜上加入 80 µL DNase I 反应液，室温孵育 15 分钟。
    11. 向离心柱中加入 350 µL 洗涤缓冲液 1。以 11,000 × g 离心 30 秒后弃去穿流液。
    12. 向离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 2。以 11,000 × g 离心 30 秒后弃去穿流液。
    13. 用 500 µL 洗涤缓冲液 2 重复洗涤一次。
    14. 将空离心柱以 11,000 × g 离心 2 分钟，以干燥膜。
    15. 将离心柱转移至新的 1.5 mL 无 RNase 的微量离心管中。直接向膜上加入 30–50 µL 无 RNase 水，室温孵育 1 分钟。
    16. 以 11,000 × g 离心 1 分钟以洗脱 RNA。将 RNA 储存于 −80 °C 直至使用。
      注意：通过分光光度法测定 RNA 浓度和纯度。A260/A280 比值在 1.8–2.1 范围内为可接受值。
  2. cDNA 合成
    1. 在冰上配制逆转录反应体系。
    2. 将 600 ng 总 RNA 与含逆转录酶、缓冲液、dNTPs 和随机引物的 4 µL RT 预混液混合。加入无 RNase 水至终体积为 20 µL。
    3. 在 37 °C 孵育反应体系 15 分钟，随后在 85 °C 孵育 5 秒。
    4. 将所得 cDNA 储存于 −20 °C 直至使用。
  3. 定量实时 PCR
    1. 每反应配制 9 µL qPCR 预混液：将 5 µL 2× SYBR Green 预混液、3 µL 无 RNase 水以及各 10 µM 的正向和反向引物预混液 1 µL 混合。
    2. 将 9 µL 预混液分装至 96 孔 qPCR 板的每个孔中。
    3. 向每孔加入 1 µL cDNA，使最终反应体积为 10 µL。
    4. 用光学粘性封膜密封反应板，并以 1,000 × g 离心 1 分钟。
    5. 在 95 °C 进行初始变性 30 秒。
    6. 进行 40 个扩增循环，每个循环包括 95 °C 变性 5 秒，随后 60 °C 退火/延伸 30 秒。
    7. 进行熔解曲线分析以确认扩增产物的特异性。
      注意：每个样品应设置双复孔或三复孔。
    8. 采用 2−ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达量。将 Ct 值归一化至内参基因（如 GAPDH），并以未分化的 hiPSC 样品作为对照进行表达量校准。

7. 统计学分析

  1. 每种条件下至少进行三次独立的生物学重复实验（n ≥ 3），定量数据以均值 ± 标准差（SD）表示。
  2. 将每次独立制备的批次视为一个生物学重复，对每批中测量的30个独立结构取平均值，得到该批次的单个平均值，用于类器官或类器官直径的汇总分析。
  3. 对每批中多个类器官或多个视野的血管面积、周细胞覆盖度和分支指数测量值进行平均，获得该批次的单个批次水平值，并使用这些批次水平值进行统计学比较。
  4. 采用非配对双尾 Student t 检验，将优化后的方案与原始 Wimmer 方案进行比较。
  5. 统计学显著性定义为 p < 0.05；根据情况标注显著性水平：p < 0.05、p < 0.01 和 p < 0.001。
  6. 所有统计分析均使用第10版统计分析软件完成。

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结果

本研究描述的优化方案采用逐步分化策略，可在约15天内由人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成成熟的血管类器官（图1A）。简言之，在第−1天，将hiPSC细胞聚集体置于添加0.25% PVA的低黏附培养板中，并在旋转摇床上形成聚集体。从第0天开始，使用CHIR99021（12 µM）和BMP-4（30 ng/mL）诱导中胚层，持续3天；随后在第3至第5天，使用VEGF-A（100 ng/mL）和forskolin（2 µM）进行血管谱系特化，持续2天。第5天时，将细胞聚集体包埋于I型胶原-基底膜基质中，并在N2B27培养基中培养，培养基中添加VEGF-A（100 ng/mL）、FGF-2（100 ng/mL）和15% FBS，以促进血管出芽。第10天时，将单个血管网络从凝胶中分离，并转移至低黏附96孔板中，每孔放置一个类器官，以进行进一步成熟。至第15天，获得具有圆形、完全包封形态的成熟血管类器官（图1B）。

为了确认分化细胞的血管特性，对内皮细胞标志物CD31进行了...

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讨论

本文所述的优化方案对Wimmer等人最初建立的血管类器官分化体系引入了若干关键性改进。18，旨在提高血管类器官生成的均一性、可重复性及结构完整性。与原始方案相比，优化后的方法在以下几个方面实现了显著改进。首先，通过优化聚集体形成条件，大幅提升了类胚体的均一性。原始方案采用在低吸附6孔板中进行自然聚集的方式生成hiPSC聚集体，接种密度为2 × 105 每孔细胞数为 NC8 细胞系 5 × 105 每孔细胞数适用于H9细胞系，并依靠重力驱动细胞聚集。该方法在很大程度上依赖于对接种密度和孵育时间的经验性控制，导致聚集体大小在不同批次间存在差异。在优化后的方案中，虽然仍采用低吸附6孔板进行细胞聚集，但引入了三项改进以提高聚集体的均一性：（1）接种 5 × 105 每孔细胞数以提供足够细胞数量用于稳定聚集；(2) 添加 0.25% 聚乙烯醇（PVA）以减少非特异性细胞-基质黏附并促进同型细胞-细胞聚集；(3) 将培养板置于旋转摇床中孵育 37 °C 通过持续轻柔振荡促进细胞均匀分布和同步聚集。...

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

本工作得到国家自然科学基金委员会青年科学基金项目（C类）（编号：32200655）和面上项目（编号：32270847）的支持。作者同时感谢安徽大学公共服务平台提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 瓶顶过滤器NalgeneFPE204030用于培养基和缓冲液的无菌过滤
15 mL 圆锥形离心管SparkJadeGD0001无菌
2 mL 微量离心管Eppendorf22363204无菌
2-巯基乙醇（1000×）Gibco21985023在通风橱中使用
Alexa Fluor 488 AffiniPure F2 片段 驴抗兔 IgG（H+L）LableadY1104二抗；按1:300稀释
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab′)2 片段 驴抗山羊 IgG（H+L）LableadY1007二抗；按1:300稀释
抗CD31抗体Cell Signaling3528s一抗；在封闭缓冲液中按1:100稀释
抗PDGFR β 抗体Zenbio347269一抗；在封闭缓冲液中按1:100稀释
自动细胞计数仪Life TechnologiesCountess™ II包含计数室载玻片
B27添加剂（50×）Gibco17504044用于N2B27培养基；在4ºC下解冻，分装后于−20ºC保存，避免反复冻融
台式离心机ZonkiaSC-3610配备摆动桶转子
生物安全柜（II级）Thermo FisherNANA
BMP4ProteintechHZ-1045用无菌ddH2O溶解至100 ng/μL，分装后于−20 °C保存
牛血清白蛋白（BSA）Biosharp9048-46-8用于封闭缓冲液
CHIR99021MCEHY-10182用DMSO配制成10 mM母液，于−20ºC保存，有效期最长1年
CO2 培养箱Fisher ScientificLS-CO15037 ºC，5% CO2，湿度恒定
共聚焦成像培养皿BiosharpBS-20-GJM染色后用于成像
共聚焦显微镜LEICANA配备10×、20×、63×物镜及ZEN软件
DMEMVivacellC3113-0500用于Matrigel稀释和I型胶原溶液
DMEM/F-12，含GlutaMAX添加剂Gibco10565018用于Matrigel稀释和N2B27培养基
EDTA（0.5 M，pH 8.0）InvitrogenAM9260G用PBS稀释至0.02%用于传代
胎牛血清（FBS）Gibco10270-106用于N2B27完全分化培养基（终浓度15%）
FGF-2NovoproteinC046用无菌PBS配制成1 mg/mL母液，分装后于−20ºC保存
佛司可林R&D Systems1099用DMSO配制成10 mM母液，于−20ºC保存
HEPES（1M）Gibco15630080用于I型胶原溶液
Hoechst染料BeyotimeC1071S-4用去离子水配制成1 mg/mL母液，分装后于−20ºC保存
倒置显微镜LEICADMIL LED常规细胞观察
Matrigel（生长因子减少型）STEEMABM05分装后于−20ºC保存，避免反复冻融；操作时置于冰上
MEM非必需氨基酸溶液（NEAA，100×）Gibco11140035用于N2B27培养基
N2添加剂（100×）Gibco17502048用于N2B27培养基；避光保存于−20ºC
Neurobasal培养基Gibco21103049用于N2B27培养基
无核酸酶水（DNase/RNase-free）LableadDoo55WJ用于RNA/cDNA制备和qPCR
轨道摇床Joan LabNA用于洗涤步骤
多聚甲醛（4%溶液）ServicebioG1101用PBS稀释至4%用于固定；在通风橱中使用
青霉素-链霉素（100×）Gibco15140122用于N2B27培养基
PGM1培养基CellapyA1517001hiPSC扩增培养基；避光保存于4ºC，有效期2周
PGM1添加剂（25×）CellapyA1517101与PGM1基础培养基配合使用
聚乙烯醇（PVA）Sigma-AldrichP8136在PGM1中以0.25%（w/v）浓度溶解以促进聚集体形成
PureCol（牛I型胶原，3 mg/mL）Advanced BioMatrix5005用于I型胶原-Matrigel混合物；需测试批次的聚合能力
qPCR热循环仪Thermo FisherStepOnePlus™具备熔解曲线功能；用于实时PCR检测
逆转录试剂盒Accurate BiologyAG11706用于从总RNA合成cDNA；包含含逆转录酶的RT预混液、缓冲液、dNTPs和随机引物
RNA提取试剂盒Yeasen19221ES50用于从血管类器官中分离总RNA；包含gDNA去除柱和无RNase的DNase I
碳酸氢钠（7.5%）Gibco25080094用于I型胶原溶液
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750用去离子水配制成1%（w/v）溶液用于封闭缓冲液
氢氧化钠（1.0 N）Sigma-AldrichS2770用于调节I型胶原溶液的pH
无菌一次性移液管（10 mL）Bkmamlab110205007独立包装，无菌
无菌滤芯移液器吸头（1000、200、20 μL）BiozymVT0270/VT0250/VT0220无菌，带滤芯
无菌针头（30 G）NANA用于解剖血管网络
无菌刮刀（圆头）Fisher Scientific21-401-5不锈钢
SYBR Green预混液Accurate BiologyAG11733qPCR用2×浓度；包含热启动DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs和SYBR Green染料
组织培养处理12孔板BD Falcon353043用于凝胶包埋和血管网络培养
组织培养处理6孔板Eppendorf30720113标准TC处理
Triton X-100Sigma-AldrichT9084用于封闭缓冲液
台盼蓝（0.4%）Thermo Fisher15250061用于细胞计数
Tween 20Sigma-AldrichP7949用于配制0.05% PBS-T洗涤液
超低吸附6孔板Corning3471用于聚集体形成和分化
超低吸附圆底96孔板BeyotimeFULA962-6pcs用于血管类器官的悬浮培养
VEGF-AProteintechHZ-1038用无菌PBS配制成1 mg/mL母液，分装后于−20ºC保存
水浴锅Blue pardHWS-2437ºC
Y-27632MCEHY-10071用无菌PBS或DMSO配制成10 mM母液，于−20ºC保存；工作浓度：5 μM（解冻时）、50 μM（聚集体形成时）

参考文献

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