靶向溃疡性结肠炎中的铁死亡与铜死亡：综合生物信息学分析与实验验证结果

摘要

本研究通过整合机器学习、单细胞RNA测序和实验验证，在溃疡性结肠炎中鉴定了五种与铜死亡和铁死亡相关的生物标志物，为临床诊断和靶向免疫治疗提供了见解。

摘要

溃疡性结肠炎（UC）是一种病因尚未完全明确的慢性肠道疾病，在新近工业化的国家中其患病率和住院率呈上升趋势。在 UC 中，肠上皮细胞过度死亡破坏了黏膜屏障，并触发炎症反应。铁死亡（ferroptosis）和铜死亡（cuproptosis）是两种新近被定义的程序性细胞死亡形式。目前大多数 UC 研究分别探讨了这两种死亡方式，但它们在 UC 进展中的联合作用仍缺乏充分表征。为探究其在 UC 发病机制中的协同作用，我们采用逐步递进的研究策略，首先通过大规模转录组分析鉴定候选靶点，随后在体外模型中进行验证。将差异表达基因（DEGs）与铁死亡相关基因（FRGs）及铜死亡相关基因（CRGs）进行交集分析。利用多种机器学习算法结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）对重叠靶点进行优先排序。结果发现五个生物标志物——LCN2、IDO1、CXCL2、NOS2 和 CD274——在 UC 中显著上调。单细胞分析进一步刻画了这些标志物在不同细胞类型中的表达特征，其中 LCN2 和 NOS2 主要在上皮细胞中富集。通过体外实验进一步评估了这些标志物的机制相关性。在 Caco-2 细胞模型中，使用铁死亡或铜死亡抑制剂处理可减轻与 UC 相关的炎症反应，并调控生物标志物的表达。本研究鉴定了五个与 UC 进展相关的生物标志物，并提供了实验证据，支持其在临床诊断和治疗干预中的潜在应用价值。

引言

溃疡性结肠炎（UC）是一种反复发作的炎症性肠病，其全球疾病负担日益加重，并带来显著的长期治疗成本^1,2。尽管氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、生物制剂和小分子疗法已拓展了治疗选择，但许多患者仍难以实现持久缓解^3,4。这一尚未满足的临床需求凸显了识别可重复的分子标志物和可干预的作用机制的重要性，这些标志物和机制可能有助于实现早期诊断以及基于机制指导的治疗⁵。

铁死亡是一种由脂质过氧化、谷胱甘肽耗竭和GPX4活性受损驱动的铁依赖性程序性细胞死亡形式⁶。溃疡性结肠炎（UC）中铁和丙二醛水平升高与铁死亡相关的上皮损伤一致，而实验性激活SLC7A11–GSH–GPX4轴或直接抑制铁死亡可保护肠道屏障^7,8。

2022年描述了一种名为铜死亡（cuproptosis）的细胞死亡方式，当铜与线粒体中的脂酰化蛋白结合时会触发该过程，导致蛋白质聚集和蛋白毒性应激⁹。由于肠道在铜代谢中起核心作用，该通路的紊乱可能会加剧溃疡性结肠炎（UC）中的氧化性和炎症性上皮损伤¹⁰。

铁死亡与铜死亡可能通过金属离子失衡、线粒体代谢、谷胱甘肽耗竭以及氧化应激等机制发生交汇¹¹。然而，这种串扰是否在溃疡性结肠炎中产生可重复的分子特征，以及该分子特征是否对通路特异性抑制产生响应，目前仍未明确。

本研究的假设是，溃疡性结肠炎（UC）中铁死亡与铜死亡通路间的失调性交互作用会汇聚形成一种可重复的生物标志物特征谱，该特征谱可在批量及单细胞转录组数据集中被优先识别，并在肠道上皮损伤模型中通过通路特异性抑制得以缓解。因此，本研究整合了多队列生物信息学分析、机器学习、单细胞分析以及靶向的Caco-2细胞实验，以识别并功能验证候选生物标志物（图1）。

图1：研究工作流程。 整合多队列转录组筛查、基于机器学习和网络的生物标志物优先排序、单细胞定位以及在Caco-2细胞中基于抑制剂的验证的综合工作流程。UC：溃疡性结肠炎；GEO：基因表达综合数据库；WGCNA：加权基因共表达网络分析；PPI：蛋白质-蛋白质相互作用；ROC：受试者工作特征；GSEA：基因集富集分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

本研究使用了公开可用的数据集和商业获取的人类细胞系。未涉及人类受试者、新采集的人体组织或脊椎动物；因此，无需机构伦理委员会批准。本实验方案中使用的研究工具、软件和在线资源列于材料表中。

1. 差异表达分析的数据处理

为建立转录组学发现队列和验证队列，使用“溃疡性结肠炎”作为检索词在基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中进行搜索。选取四个数据集——GSE87466、GSE92415、GSE107499 和 GSE75214 作为训练集，而 GSE47908 被保留用于外部验证。训练数据集采用 Sangerbox 3.0 中的 ComBat 方法进行标准化和批次效应校正，而验证数据集则独立处理。

从FerrDB获取了共计583个铁死亡相关基因（FRGs），并补充了文献报道的基因，以减少单一来源偏差¹²。铜死亡相关基因（CRGs）集合共96个，来源于已发表的研究^12,13,14。差异表达分析采用limma进行，筛选阈值为|log₂倍数变化| > 1且经Benjamini–Hochberg校正的P < 0.05。标准化、批次校正、差异表达和聚类的诊断图见补充图1。样本组成、检测平台及队列分配信息见补充表1。

2. UC中CF-DEG的鉴定

采用 |r| > 0.5 且 P < 0.05 的阈值进行 Pearson 相关性分析，以鉴定共表达的铁死亡相关基因（FRGs）和铜死亡相关基因（CRGs）。将所得基因集与差异表达基因（DEGs）取交集，以确定铜死亡-铁死亡共表达的差异表达基因（CF-DEGs）。

3. 富集分析

使用 clusterProfiler 和 Bioinformatics.com.cn 平台进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。显著性阈值采用经 Benjamini–Hochberg 校正的 P < 0.05。富集分析图见补充图 2。

4. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）

采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）研究基因表达谱的模块化结构。通过层次聚类结合goodSamplesGenes函数识别并剔除异常样本。随后确定合适的软阈值幂参数（β），以满足网络构建的无标度拓扑准则。

利用处理后的表达数据构建基因共表达分析的拓扑重叠矩阵（TOM）。采用动态树切割方法，将表达模式高度一致的基因聚类为基因模块，每个模块至少包含100个基因。通过分析模块特征基因（MEs）与表型之间的关联，鉴定与疾病过程相关的模块，并提取相应的基因集。WGCNA筛选的诊断结果见补充图3。

5. 生物标志物的选择

为优先选择候选对象进行实验后续研究，平行应用了三种机器学习算法15。采用最小绝对收缩与选择算子（LASSO）回归进行特征筛选，采用树数量为500的随机森林对基因重要性进行排序，采用支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）方法识别交叉验证误差最低的特征子集。完整筛查诊断结果见补充图5。

基因的重要性根据各个基因对分类准确性的贡献进行评估，并将排名较高的基因收集起来以构建初步的基因集合16。SVM-RFE算法通过迭代式特征剔除实现特征筛选与模型优化，从而确定用于分类的最优特征子集17。三种算法共同筛选出的基因被视为通过机器学习鉴定出的候选生物标志物。

利用CF-DEGs构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并使用CytoHubba对核心节点进行排序。通过关键WGCNA模块、三种机器学习输出结果以及PPI核心基因集的交集，确定了五个整合候选生物标志物：LCN2、IDO1、CXCL2、NOS2和CD274。这些基因被归类为与溃疡性结肠炎（UC）相关的诊断候选基因。后续的抑制剂实验进一步将LCN2、IDO1、CXCL2和NOS2归类为铁死亡抑制响应标志物，将CD274归类为铜死亡抑制响应标志物。这些基因并未被视为任一通路的已证实上游调控因子。

6. 预测模型开发与多方法评估

为了评估所鉴定基因特征的临床转化潜力，使用 rms 软件包构建列线图以评估其诊断性能。通过校准曲线、Hosmer–Lemeshow（HL）检验以及 Harrell 一致性指数（C 指数）来评价模型性能。

采用HL检验和平均绝对误差（MAE）评估模型校准度。以P值＞0.05和MAE＜0.1分别作为可接受模型拟合优度和准确性的阈值。绘制受试者工作特征（ROC）曲线，并计算曲线下面积（AUC），以评估列线图对UC的预测性能。使用独立数据集评估模型的泛化能力和稳定性。

7. 基因集富集分析 (GSEA)

在训练集中，对每个生物标志物与所有其他基因之间进行Spearman相关性分析。根据相关性结果进行排序，生成有序基因集。使用分子特征数据库（MSigDB）中的c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols基因集作为参考，进行基因集富集分析（GSEA）。具有显著富集的生物学通路 P < 0.05 被认为显著富集。

8. 免疫景观分析

采用 CIBERSORT 工具和 LM22 特征矩阵对表达数据进行去卷积分析，以估算 22 种免疫细胞亚型的比例。随后进行斯皮尔曼相关性分析，以评估五种生物标志物与免疫细胞亚型之间的关联性。

9. 调控网络分析

通过 NetworkAnalyst 平台，从整合的 ChEA3 和 TarBase 9.0 数据库中获取了与基因相关的转录因子（TF）和微小RNA（miRNA）调控信息。在调控网络中仅包含与至少两个节点相关的miRNA。

10. 单细胞RNA测序

整合了UC单细胞数据集GSE116222（包含三个健康样本和三个UC样本）和GSE214695（包含六个健康样本和六个UC样本）。筛选细胞的标准为：检测到200–5,000个基因、>1,000个唯一分子标识符、线粒体转录本比例< 30%、血红蛋白转录本比例< 3%以及核糖体转录本比例< 50%。使用NormalizeData函数进行数据归一化，并在聚类与注释前采用Harmony进行批次效应校正。

过滤后，使用 NormalizeData 函数对数据进行标准化。采用 Harmony 方法以最小化样本间的批次效应。使用统一流形近似与投影（UMAP）和t分布随机邻域嵌入（t-SNE）进行降维和细胞聚类，以表征细胞群体内的局部和全局结构。共保留31,712个高质量细胞用于进一步分析。细胞类型根据经典细胞标志基因进行注释。

使用 Monocle 2 对溃疡性结肠炎组织中的上皮细胞和髓系细胞状态变化进行拟时序分析。评估了细胞发育轨迹及组间差异，并可视化了拟时序轨迹上生物标志物的表达模式。

采用CellChat评估上皮细胞与髓系细胞亚群之间的细胞间通讯。整合各亚群特异性表达模式，以推断上皮细胞与髓系细胞之间的相互作用概率及关键信号通路，并表征其潜在的细胞间调控网络。

11. 细胞实验

人Caco-2结肠腺癌细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养。Caco-2细胞被选为可重复的肠上皮单层模型，用于肠道屏障及炎症-损伤检测；然而，其恶性来源限制了向非恶性结肠上皮的直接外推。存档实验记录中未提供传代信息。

一个 体外 通过将细胞暴露于炎症性损伤模型中建立 1 µg/mL 脂多糖（LPS）处理24小时。细胞被分为二甲基亚砜溶剂对照组、仅LPS组、LPS + 4 µM ferrostatin-1组，或LPS + 40 µM 四硫钼酸盐组，终溶剂浓度保持一致。仅脂多糖组作为抑制剂挽救实验的阳性损伤/模型对照。

1. 细胞活力
   根据制造商说明书，使用细胞活力检测试剂盒评估细胞活力。在37 °C孵育约2 h后，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。
2. MDA和Fe²⁺水平测定
   根据各制造商说明书，使用相应的检测试剂盒测定细胞内丙二醛（MDA）和Fe²⁺水平。采用双辛可宁酸法测定总蛋白含量，并将各检测结果归一化至相应样品的蛋白含量。
3. 铜离子荧光探针检测
   去除培养基后，加入Cu²⁺特异性荧光探针，终浓度为1 µM，在37 °C孵育30 min。使用倒置荧光显微镜直接获取图像（无需洗涤），激发波长和发射波长分别为510 nm和578 nm。各组图像采集参数保持一致，标尺校准为50 µm。
4. RT-qPCR
   使用基于苯酚–胍盐的RNA提取试剂分离总RNA。取1 µg RNA，利用第一链cDNA合成试剂盒合成互补DNA，并采用基于SYBR Green的试剂进行实时PCR。每个反应设技术重复三次。引物序列见补充表2，相对信使RNA丰度采用2⁻^ΔΔCt法计算。

12. 统计分析

使用 Shapiro–Wilk 检验和以中位数为中心的 Levene 检验分别评估数据的正态性与方差齐性。满足两项假设的数据采用非配对双侧 t 检验或单因素方差分析，随后进行 Tukey 法真实显著性差异检验。若任一假设不满足，则采用 Welch t 检验或 Welch 方差分析，随后进行 Games–Howell 比较。

结果以均值 ± 标准差表示。实际的生物学重复次数、精确的双侧 P 值及假设检验结果见补充表3。存档的图13源数据表中，A（n = 4）、C（n = 4）和F（n = 2）图板的对照组重复数较少，而其他所有图板/组别组合均为 n = 6。

使用 R 语言及 limma、WGCNA、clusterProfiler、glmnet、randomForest、e1071、pROC、rms、Seurat v4、Harmony、Monocle 2、CellChat 和 Cytoscape/CytoHubba 工作流程进行计算分析。在线资源包括 FerrDB、GEO、STRING、ChEA3、TarBase 9.0、NetworkAnalyst、CIBERSORT/LM22、MSigDB、Bioinformatics.com.cn 和 Sangerbox 3.0。

结果

铜死亡-铁死亡共表达基因的鉴定与功能注释

整合了包含421例溃疡性结肠炎（UC）样本和97例健康对照的四个训练数据集。共鉴定出551个差异表达基因，其中包括362个上调基因和189个下调基因。相关性分析得到444个铁死亡–铜死亡相关基因，与差异表达基因取交集后获得32个铜死亡–铁死亡共表达的差异表达基因（CF-DEGs）。

32个CF-DEGs在对损伤、铜离子、脂肪酸转运、脂多糖、炎症性肠病、NF-κB信号通路、TNF信号通路以及铁死亡的响应中显著富集（补充表4）。

通过整合机器学习与WGCNA对核心生物标志物进行优先排序

加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出与溃疡性结肠炎（UC）关联最强的模块为MEpurple、MEbrown和MEblack。这些选定的模块共包含1,426个基因（补充表5

讨论

本研究整合了大规模转录组学、机器学习、单细胞分析和靶向细胞实验，以探讨溃疡性结肠炎（UC）中铁死亡与铜死亡之间的相互作用。在发现队列和验证队列中，五个与UC相关的诊断候选基因具有一致性，主要定位于上皮细胞和髓系细胞区室，并在Caco-2细胞中表现出对通路抑制响应的表达模式。这些发现支持一种分阶段的工作流程，即通过计算方法优先筛选目标，进而指导有针对性的生物学验证，同时避免得出这五个基因是铁死亡或铜死亡上游明确调控因子的更强结论。

CF-DEGs 在脂多糖应答、铜离子代谢、脂质转运、NF-κB/TNF 信号通路以及铁死亡过程中显著富集，为金属依赖性氧化应激与黏膜炎症之间提供了连贯的关联依据^10,19。

这五个候选分子分别涉及互补的炎症和金属应激环境。LCN2 联结铁螯合、微生物群失调以及 LCN2–ALOX15 铁死亡轴^20,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BCA 蛋白检测试剂盒	Beyotime 生物技术研究所	P0010	用于归一化的蛋白定量。
Bioinformatics.com.cn	Bioinformatics.com.cn	在线平台；访问时间 2026 年	GO/KEGG 可视化与分析平台。
Caco-2 细胞系	ATCC	HTB-37	用于上皮损伤模型的人结肠直肠腺癌细胞系。
细胞计数试剂盒-8	GLPBio	GK10001	在 450 nm 处测定的细胞活力检测。
CIBERSORT 与 LM22 特征谱	CIBERSORT 开发者	LM22	22 种免疫细胞组分的反卷积分析。
ChEA3	Ma'ayan 实验室	在线平台；访问时间 2026 年	转录因子富集与调控网络预测。
CO2 培养箱	未记录	N/A	用于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养的加湿培养箱。
Cu2+ 荧光探针	BIOFOUNT	CAS 98907-26-7	细胞内 Cu2+ 荧光检测。
Cytoscape 与 CytoHubba 插件	Cytoscape 联盟	版本未记录	蛋白质相互作用网络可视化与核心节点排序。
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	11965092	Caco-2 细胞培养基。
二甲基亚砜	未记录	N/A	溶剂对照。
胎牛血清	未记录	N/A	以 10% 添加至培养基作为补充物。
Fe2+ 检测试剂盒	Abcam	ab83366	细胞内 Fe2+的测定。
FerrDB	FerrDB 开发者	在线数据库；访问时间 2026 年	铁死亡相关基因的数据来源。
铁抑素-1	Sigma-Aldrich	SML0583	铁死亡抑制剂；终浓度为 4 µM。
Harmony	Broad 研究所/社区	版本未记录	单细胞批次校正。
倒置荧光显微镜	Olympus	IX71	在 510/578 nm 激发/发射波长下进行 Cu2+荧光成像。
脂多糖	未记录	N/A	以 1 µg/mL 处理 24 小时，作为炎症损伤刺激物。
丙二醛检测试剂盒	Beyotime 生物技术研究所	S0131S	脂质过氧化的测定。
酶标仪	未记录	N/A	在 450 nm 处测定吸光度。
Monocle	Bioconductor/社区	版本 2	单细胞拟时序分析。
分子特征数据库	Broad 研究所	c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs	用于 GSEA 的参考基因集。
NetworkAnalyst	NetworkAnalyst 开发者	在线平台；访问时间 2026 年	整合转录因子与 miRNA 调控网络。
青霉素–链霉素	未记录	N/A	含 100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。
R	统计计算基金会	版本未记录	生物信息学分析环境。
R 软件包集合	CRAN/Bioconductor	软件包版本未记录	limma、WGCNA、clusterProfiler、glmnet、randomForest、e1071、pROC 和 rms 工作流程。
实时 PCR 系统	未记录	N/A	SYBR Green RT-qPCR 仪器。
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒	Thermo Fisher Scientific	K1622	由 1 µg RNA 合成第一链 cDNA。
Sangerbox	Sangerbox 开发者	3.0	标准化与 ComBat 批次校正。
Seurat	Satija 实验室/社区	版本 4	单细胞质量控制、标准化、聚类与可视化。
统计分析软件	未记录	N/A	原始细胞实验的统计分析。
STRING	STRING 联盟	在线数据库；访问时间 2026 年	蛋白质–蛋白质相互作用网络构建。
SYBR Green 实时 PCR 试剂	Takara	RR820A	定量实时 PCR。
TarBase	DIANA Tools	9.0	经实验验证的 miRNA–基因相互作用。
四硫钼酸盐	Sigma-Aldrich	323446	铜螯合剂；终浓度为 40 µM。
TRIzol 试剂	Takara	9108	总 RNA 提取。