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一种基于细胞培养小室的简化多细胞构建方案 体外 乳腺癌脑转移的血-肿瘤屏障模型

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DOI：

10.3791/73693

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2026年10月21日

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1Department of Breast Oncology and Surgery, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2State Key Laboratory of Medical Proteomics, Dalian Institute of Chemical Physics, 3Department of Pathology, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究建立了一种简化的多细胞体系 体外 结合Transwell共培养与3D肿瘤球体的血-肿瘤屏障（BTB）模型，为研究乳腺癌脑转移及筛选靶向治疗药物提供了具有生理相关性的实验平台。

摘要

目前，乳腺癌脑转移（BCBM）的有效治疗手段仍然有限，主要原因在于血-肿瘤屏障（BTB）限制了多种化疗药物和靶向药物进入中枢神经系统内的转移病灶。为了在体外模拟这一复杂微环境的特定特征，本研究提出了一种标准化的简化多细胞三维BTB模型构建方案。该方法包括三个核心步骤。首先，使用孔径为0.4 μm的细胞培养小室构建血-脑屏障（BBB）结构。人脑微血管内皮细胞（HBMECs）接种于多孔膜的基底侧，1天后，将人星形胶质细胞（HA）和 人小胶质细胞HMC3系（HMC3）接种于膜的顶端侧。以SK-BR-3细胞为例，采用悬滴法培养乳腺癌细胞，经3天培养后形成大小均一、形态规则的三维肿瘤类球体。随后将类球体转移至涂有基底膜基质的多孔膜顶端侧，该设计在物理上实现分隔的同时，允许屏障细胞与肿瘤类球体在共培养过程中进行化学信号交流。该平台可精确控制实验时间进程，并能诱导星形胶质细胞出现与肿瘤周围反应性状态一致的形态学改变和标志物表达变化，同时支持对内皮屏障完整性和旁细胞通透性的评估。

引言

脑转移是多种恶性实体肿瘤晚期常见的并发症，包括乳腺癌和肺癌1,2。其预后极差，治疗选择有限1,2。在健康的中枢神经系统中，血脑屏障（BBB）主要由紧密连接的脑微血管内皮细胞构成，是一种高度特化且动态的界面，其完整性和功能依赖于血管基底膜以及与周细胞、星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞谱系细胞和神经血管单元其他组分之间的协调相互作用3。通过内皮细胞之间的紧密连接以及外周胶质细胞的辅助，血脑屏障严格限制外来物质进入中枢神经系统4。一旦乳腺癌细胞扩散并在脑内定植，脑转移病灶会不断扩展，局部缺氧加剧，炎症信号增强，神经血管单元（NVU）发生重构，逐步形成血肿瘤屏障（BTB）5。尽管BTB的局部通透性高于BBB，但其对不同分子大小物质的通透性存在差异，加之血流灌注不均，导致药物在脑肿瘤中的蓄积效果不佳6。因此，深入了解BTB的生物学特性，并开发能够穿越该屏障的药物递送策略，已成为神经肿瘤学领域的重要研究方向。

迄今为止，血-肿瘤屏障（BTB）的特征及其转化机制仅被部分阐明，临床上针对乳腺癌脑转移（BCBM）的有效药物选择仍然有限。其中一个挑战是脑转移病灶来源的临床样本稀缺，同时现有的BTB模型在可及性方面也存在局限，且其功能表征尚不完善。体内动物模型，尤其是小鼠模型7,8，目前在BTB研究中仍被广泛使用。然而，这些模型存在诸多局限性，包括种属差异、通量较低，以及在标准化和可重复性方面的困难，这些因素可能阻碍机制研究和药物开发9,10。此外，当前的体外BTB模型通常采用肿瘤细胞与屏障相关细胞在细胞培养插入系统或微流控芯片中进行共培养。

这些现有模型通常缺乏肿瘤的三维结构，因此在模拟与脑转移相关的空间特征方面存在局限性，包括细胞密度梯度、缺氧/坏死区域、分子扩散受限以及细胞分布的异质性11,12为了引入明确的三维肿瘤组分，我们采用了一种简单、可重复且适用于筛选应用的球状体模型。在此基础上，我们建立了一种简化的多细胞人类 体外 血脑屏障（BBB）室与肿瘤类球体整合，构建简化的血脑肿瘤屏障（BTB）模型（图1A) 该模型可捕获脑转移微环境中特定的结构和细胞特征，操作简便，支持血脑屏障功能的定量测量，并可实现对肿瘤相关星形胶质细胞和小胶质细胞群体空间变化的可视化观察。

本方案详细介绍了从细胞准备和接种到肿瘤类球体生成、基底膜基质覆盖、配对对照制备以及类球体转移的关键步骤，为构建这一简化的血-肿瘤屏障（BTB）模型提供了标准化的工作流程。

方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并经大连医科大学附属第二医院伦理委员会批准（批准文号：JW2026-019-01）。所有与患者相关的数据在分析前均已匿名化处理。本方案中使用的研究工具列于材料表中。

1. 血脑屏障（BBB）模型的制备

  1. 一般要求
    1. 所有操作均须在无菌层流柜中进行，并严格遵守无菌技术。
    2. 使用带有孔径为 0.4 µm、有效膜面积为 1.12 cm2 的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的 12 孔细胞培养小室。
  2. Ⅰ型胶原蛋白包被
    1. 向每个培养瓶或培养皿中加入 1–2 mL Ⅰ型胶原蛋白包被液，并均匀覆盖底部表面。
    2. 分别向每个细胞培养小室的顶端和基底端加入 200 µL 和 800 µL 包被液。轻轻振荡培养板，确保膜完全接触液体，同时避免膜下产生气泡。
    3. 将包被后的容器和小室置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时。去除包被液，并用 PBS 洗涤两次。
    4. 将包被后的培养瓶、培养皿和细胞培养小室保存在 37 °C、5% CO₂ 条件下，并在 3 天内使用。使用前立即用 PBS 冲洗一次。
    5. HBMEC 和 HA 细胞的培养容器需在接种前用Ⅰ型胶原蛋白包被。HMC3-RFP 细胞无需Ⅰ型胶原蛋白包被。
  3. Ⅰ型胶原蛋白包被液的配制
    1. 将 60 µL 冰醋酸溶解于 50 mL 超纯水中，并在 4 °C 下冷却。
      注意：冰醋酸具有腐蚀性。操作时应在化学通风橱中进行，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、实验服和眼部防护装置。醋酸废液应按照机构规定的化学废弃物处理程序进行处置。
    2. 将溶液经 0.22 µm 注射器滤器过滤，加入 500 µL Ⅰ型胶原蛋白（9.45 mg/mL），充分混匀后于 4 °C 保存备用。
  4. 细胞准备
    1. 将 HBMEC、HA 和 HMC3-RFP 细胞培养至使用前达到 80%–90% 汇合度。
      注意：人源性细胞系及与人体组织相关的材料应视为潜在生物危害物处理。应遵循机构的生物安全规程，并穿戴适当的个人防护装备。受污染的培养材料应作为生物危害废物处置。
  5. 第 0 天接种 HBMEC
    1. 使用重组类胰蛋白酶（1×）消化 HBMEC，离心收集细胞，并重悬沉淀以获得单细胞悬液。
    2. 测定细胞密度，并调整悬液浓度，使每 120 µL 悬液中含有 1.5 × 105 个 HBMEC，用于每个细胞培养小室。
    3. 将培养板倒置，向多孔膜的基底侧加入 120 µL HBMEC 悬液。接种过程中避免形成气泡（图 1B）。
    4. 盖上培养孔，保持 12 孔板倒置状态，孵育 6 小时。
    5. 将培养板恢复至正立位置，分别向顶室和底室加入 200 µL 和 800 µL 完全 ECM 培养基，继续孵育。
  6. 第 1 天接种 HA 和 HMC3-RFP 细胞
    1. 使用重组类胰蛋白酶（1×）消化 HA 细胞，使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 HMC3-RFP 细胞。分别离心并重悬两种细胞。
    2. 测定细胞密度，并为每个细胞培养小室混合 2.0 × 105 个 HA 细胞和 4.0 × 103 个 HMC3-RFP 细胞。
    3. 将混合细胞离心，弃去上清液，将沉淀重悬于 200 µL 混合完全培养基（AM 完全培养基 : MEM 完全培养基 = 5:1）中。将 200 µL 悬液均匀加入顶室，避免产生气泡（图 1B）。 
    4. 向底室加入 800 µL 完全 ECM 培养基，将培养板正立置于培养箱中，并每日更换培养基。

三维肿瘤球体的制备

  1. SK-BR-3 细胞的准备
    1. 培养 SK-BR-3 细胞，直至细胞融合度达到 80%–90%，然后进行类球体形成。
    2. 使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化并解离 SK-BR-3 细胞，离心收集细胞，并重悬沉淀以获得单细胞悬液。
    3. 测定细胞密度，并调整悬液浓度，使每个 30 µL 液滴中含有 2 × 104 个细胞。
  2. 悬滴的形成
    1. 将 10 cm 细胞培养皿倒置，在皿盖上滴加 30 µL 的细胞悬液液滴，每个皿盖上放置约 20 个液滴。
    2. 将培养皿底部放回并迅速翻转组装好的培养皿（图 1B）。如果液滴从皿盖滴落或失去形状，需重新制备液滴。
  3. 类球体培养
    1. 向培养皿中加入 5 mL PBS，并将培养皿放入培养箱中。在培养的前两天内不要扰动培养皿。
    2. 对于长期培养，每隔 2 天向每个液滴中添加 10 µL 完全培养基。
    3. 使用移液器枪头从每个液滴边缘添加培养基，避免接触肿瘤类球体。

3. 简化血液-肿瘤屏障（BTB）模型的制备

  1. 材料准备
    1. 用I型胶原蛋白包被所需的细胞培养器皿和细胞培养小室（PET膜，0.4 µm孔径），并将其置于培养箱中保存至使用。
    2. 用剪刀剪去200 µL移液器吸头的末端，并通过高压灭菌对改造后的吸头进行灭菌处理。
  2. 模型建立
    1. 第0–1天：构建血脑屏障（BBB）模型，并按上述方法制备肿瘤类球体。
    2. 第2天：将基底膜基质置于冰上解冻。移除上下室中的培养基，并用PBS清洗两个腔室。
    3. 向下方腔室加入800 µL ECM完全培养基，向上方腔室加入30 µL解冻后的基底膜基质。将基底膜基质均匀铺展在多孔膜表面。
    4. 将培养板在37 °C孵育20分钟，然后沿上方腔室壁缓慢加入200 µL混合完全培养基（AM:MEM = 5:1）。将培养板放回培养箱中（图1B）。
    5. 保持基底膜基质处于冰上操作，并快速进行。吸取基底膜基质时应使用预冷的移液器吸头。
  3. 配对无类球体/基底膜基质对照
    1. 制备对照组小室，使用与BTB条件相同的基底膜基质体积（30 µL）、培养基成分、洗涤步骤、孵育时间及每日换液程序，但在第3天不进行肿瘤类球体的转移。因此，该配对对照与BTB条件的差异仅在于是否存在肿瘤类球体，而非基底膜基质暴露或操作差异。
  4. 第3天肿瘤类球体的转移
    1. 在直立显微镜下观察肿瘤类球体，确认其形态规则且已形成致密的球状结构。
    2. 使用截短的移液器吸头将肿瘤类球体吸至1.5 mL微量离心管中，并用PBS洗涤两次。操作过程中应轻柔处理类球体，避免破坏。
    3. 更换下方腔室中的培养基，并移除上方腔室中的培养基。
    4. 使用截短的移液器吸头将五个肿瘤类球体转移至每个上方腔室中。
    5. 向每个上方腔室加入200 µL混合完全培养基（AM:MEM = 5:1），并轻轻振荡培养板，防止类球体相互接触或融合（图1B）。
    6. 将培养板置于培养箱中继续培养，并每日更换培养基。
  5. 样品采集
    1. 在第7天采集样品用于后续实验，或根据实验需求调整采集时间。

4. 跨内皮细胞电阻（TEER）测量

  1. 电极制备
    1. 将TEER仪充满电，并将筷子式电极浸入75%乙醇中15分钟。
      警告： 乙醇易燃。75%乙醇应远离明火、火花及其他点火源，并按照机构的化学品安全规程操作。
    2. 将生物安全柜暴露于紫外光下30分钟以进行灭菌。切勿将电极直接暴露于紫外照射下。
    3. 将电极从乙醇中取出，在PBS中平衡15 min，并在无菌条件下干燥。
  2. 细胞培养插件的平衡
    1. 从培养箱中取出含有细胞培养小室的12孔板，室温下静置15 min后再进行测量。
  3. 电阻测量
    1. 准备一个无细胞的空白细胞培养小室 200 µL 和 800 µL 上室和下室分别加入等量的完全培养基。
    2. 将筷子状电极轻轻插入细胞培养插件的边缘，避免接触多孔膜或孔板底部。
    3. 用 PBS 冲洗电极并将其干燥。使用相同步骤测量每个含细胞的插入式培养小室，并记录电阻值为 R₍测量₎.
  4. TEER 计算
    1. 使用以下公式计算跨内皮细胞电阻（TEER）值13:
      TEER（Ω·cm²) = (R(测量) − R(空) × S    (1.1)
    2. R(测量) 是穿过含有细胞层的多孔膜的电阻Ω); R(空) 是一种无细胞多孔膜上的电阻（Ω）；S 为有效膜面积（cm2). 本研究中使用的有效膜面积为1.12 cm2.

5. FITC-葡聚糖细胞旁通透性检测（顶侧至基底侧方向）

  1. FITC-葡聚糖的制备
    1. 实验前配制2 mg/mL的FITC-葡聚糖（4 kDa）工作液，并避光保存。
  2. 实验方向的解释
    1. 将本实验解读为从顶侧到基底侧的旁细胞屏障完整性检测，因为人脑微血管内皮细胞（HBMECs）附着在膜的基底面，而星形胶质细胞、小胶质细胞和肿瘤类器官位于顶侧室。
      注意： 对于旨在模拟系统暴露的研究，应将FITC-葡聚糖或待测化合物加入下层/基底侧内皮细胞面向的室中，并采用已单独验证的取样方案和Papp计算方法，从上层/顶侧室收集样品。
  3. 洗涤与平衡
    1. 移除上下两个腔室中的全部培养基。向上层和下层腔室分别加入400 µL和1 mL预热的无葡萄糖DMEM基础培养基，轻轻洗涤一次后弃去液体。
    2. 向上层和下层腔室分别加入400 µL和1 mL新鲜预热的无葡萄糖DMEM基础培养基。在37 °C、5% CO₂条件下平衡15分钟，然后吸除所有液体。
  4. 通透性测定
    1. 向顶侧加入200 µL的2 mg/mL FITC-葡聚糖工作液，向下层腔室加入800 µL无葡萄糖DMEM基础培养基。在37 °C、5% CO₂条件下避光孵育30分钟。
    2. 30分钟后，从每个实验插入物的下层腔室中收集100 µL培养基。将每个插入物中的三份等分试样转移至黑色96孔板中，并避光保存。
  5. FITC-葡聚糖标准曲线的制备
    1. 配制浓度为0、0.5、1.0和1.5 mg/mL的FITC-葡聚糖标准品。将每种标准品各100 µL以每组三个复孔的方式加入黑色96孔板，并避光保存。
  6. 荧光测定与Papp计算
    1. 使用多功能微孔板读数仪在激发波长492 nm、发射波长520 nm条件下测定荧光强度。记录数据，并使用以下公式14计算表观通透系数（Papp）。
    2. 首先，将FITC-葡聚糖标准溶液的浓度（C）与其对应的荧光强度（A）进行线性拟合，生成标准曲线：
       A = kC + b    (1.2)
    3. 其中，k 表示标准曲线的斜率，b 表示截距。
    4. 接着，将时间t时测得的样品荧光强度（At）代入标准曲线方程，得到时间t时基底侧的FITC-葡聚糖浓度（Ca）。然后将Ca代入以下公式计算Papp（cm/s）：
    5. Papp = (Ca × Va)/(t × S × C0)  (1.3)
    6. 其中，Va为基底侧总体积（mL）；t为渗透时间（s）；S为多孔膜的有效面积（cm2）；C₀为顶侧初始浓度。

6. 免疫荧光染色

  1. 固定、洗涤与通透
    1. 移除细胞培养插件中的所有培养基，用 PBS 洗涤两次，并吸除所有残留液体。
    2. 分别向插入室的上室和下室加入 200 µL 和 800 µL 的 4% 多聚甲醛，在 4 °C 下固定细胞过夜。
      注意：多聚甲醛具有危害性，应在经认证的化学通风橱中操作，并佩戴手套、实验服和眼部防护装备。多聚甲醛废液应单独收集，并按照机构规定的危险废物处理程序进行处置。
    3. 移除多聚甲醛溶液，分别向插入室的上室和下室加入 200 µL 和 800 µL 的 PBS，在摇床上洗涤三次，每次 5 分钟。
    4. 分别向插入室的上室和下室加入 200 µL 和 800 µL 的 0.5% 非离子型表面活性剂，在室温下通透 10 分钟。
    5. 移除非离子型表面活性剂溶液，并用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
  2. 膜的切除与封闭
    1. 将细胞培养插件倒置在细胞培养皿盖上，用手术刀沿边缘小心切除多孔膜，并将其转移至 24 孔板中。
    2. 每张膜加入 200 µL 含 3% BSA 的 PBS 溶液以完全覆盖膜表面，在室温下封闭 90 分钟。如有需要，可将膜切成更小的片段以进行分别染色。
  3. 一抗孵育
    1. 用标准抗体稀释液稀释一抗，并加入足够体积的溶液以完全覆盖每张膜。
    2. 在周围空孔中加入超纯水以减少蒸发，在 4 °C 下避光孵育过夜。以不加特异性一抗的样品作为阴性对照。
    3. 次日移除一抗溶液，在摇床上用 1 mL PBS 洗涤膜三次，每次 10 分钟。
  4. 二抗与 DAPI 染色
    1. 在避光条件下，用荧光抗体稀释液稀释二抗，完全覆盖膜表面，在室温下孵育 90 分钟。避光条件下用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
    2. 加入即用型 DAPI 染色液以覆盖膜表面，在室温下孵育 15 分钟。避光条件下用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
  5. 透明、封片与成像
    1. 加入适量 3D 细胞培养透明试剂以完全覆盖膜，在避光条件下于室温孵育 15 分钟。
    2. 用眼科镊将膜转移至载玻片上，加入抗荧光淬灭封片剂，在避光条件下封片。使用共聚焦激光扫描显微镜观察并采集图像。

7. 统计报告

  1. 在功能比较实验中，n = 3 表示每种条件下进行三次独立的生物学重复，每次生物学重复被视为独立的实验单位。展示全部三次生物学重复的单个数据点。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。采用双尾非配对 Student t 检验进行比较，并提供确切的 t 值和 p 值。

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图1：BTB模型的示意图及构建流程。（A）将HBMEC接种于多孔细胞培养小室膜的基底侧，而HA细胞和HMC3-RFP细胞则分布于顶侧。使用一层基底膜基质将肿瘤类球体与屏障细胞区隔开。对于配对的无类球体对照组，采用相同的基底膜基质覆盖和操作步骤，但不加入肿瘤类球体。（B）顶部的圆圈数字表示相应的培养天数。血脑肿瘤屏障（BTB）的构建与肿瘤类球体的制备同时进行。在向细胞培养小室的上表面添加一层基底膜基质后，使用截短的移液枪头将肿瘤类球体转移至上方腔室。随后将BTB模型继续培养至多1周，之后进行样本收集。通常可在第7天收集样本用于后续实验。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

在铺有等量基底膜基质的无球体匹配血脑屏障对照组中，HMC3-RFP信号相对广泛地分布在顶端细胞层。图 2在血脑屏障条件下，终点图像显示HMC3-RFP信号主要出现在未被肿瘤球覆盖的区域，而在肿瘤球下方及其紧邻区域信号减弱。图 2这些数据表明肿瘤球体的存在与HMC3-RFP细胞的终点分布之间存在空间关联。由于未评估引入肿瘤球体前的基线HMC3-RFP分布及进行纵向细胞追踪，现有数据尚不能确立小胶质细胞的主动迁移、排斥反应或肿瘤驱动的排他性行为。

星形胶质细胞在血脑屏障条件下也表现出标志物信号和形态学的差异。图 2与匹配的无球体/基底膜基质对照组相比，代表性图像显示球体周围区域和远端区域的GFAP荧光均更强。位于球体边缘的星形胶质细胞表现出胞体增大、突起增厚且伸长，且突起朝向球体边缘定向生长。图 2）。这些终点特征与反应性星形胶质细胞样表型相符，但其本身并不足以确立特定的反应性星形胶质细胞增生程序或其潜在机制。在人乳腺癌脑转移组织切片中观察到了形态学相似的瘤周星形胶质细胞结构，其免疫荧光染色显示的特征与瘤周反应性星形胶质细胞增生一致。图 3A为进一步表征AQP4相关的星形胶质细胞特征，在匹配的无球体血脑屏障模型以及血脑肿瘤屏障模型的远端和球体周围区域进行了AQP4免疫荧光染色。图 3B血脑屏障模型、血肿瘤屏障模型远端区域以及紧邻肿瘤球体的球周区域代表性图像分别展示于第一、第二及第三行（图 3B在血脑屏障模型中，与远端星形胶质细胞相比，周球状体星形胶质细胞表现出形态学差异。综上所述，GFAP/AQP4 观察结果与形态学观察结果共同支持了该模型中存在肿瘤球状体相关的星形胶质细胞重塑；其与患者组织的相似性应被解读为表型相似性，而非该模型完全重现了人类瘤周星形胶质细胞增生的证据。

为评估肿瘤球体对内皮细胞连接结构的影响，我们在简化的血脑屏障和血脑肿瘤屏障模型中对基底人脑微血管内皮细胞层的紧密连接蛋白 ZO-1 进行了免疫荧光染色。实验采用匹配的无球体与含球体条件，并覆盖等量的基底膜基质。共聚焦成像聚焦于与肿瘤球体对应的区域。图 4A在匹配的无球体对照组中，HBMECs间的ZO-1信号呈相对连续、线性的分布，细胞间边界清晰可辨。而在BTB条件下，对应肿瘤球体区域的ZO-1荧光则显得更为稀疏，出现局灶性中断和不连续现象。图 4A这些终点图像与紧密连接结构的局部缺失相符。然而，由于缺乏额外的血睾屏障特异性分子标记物或机制性扰动实验，现有数据无法区分特异性的血睾屏障重塑与非特异性的肿瘤相关内皮损伤或屏障破坏。

在功能层面，于第7天在匹配的无球体/基底膜基质对照组和含球体的血脑屏障（BTB）条件下同时进行了跨上皮电阻（TEER）测量和FITC-葡聚糖渗透性测定。图 4B）。所有三个独立生物学重复的个体值均以散点形式展示于 图 4B，汇总数据以平均值呈现 ± SD。BTB 条件下的 TEER 值为 106.0 ± 9.5255 Ω·厘米2, n = 3 个独立生物学重复）低于匹配对照组的 168.0 ± 5.1325 Ω·厘米2，n = 3 个独立生物学重复）。一致地，在顶侧-基底侧 FITC-葡聚糖实验中测得的表观渗透系数（Papp）在 BTB 条件下更高（5.851 ± 1.2080 × 10⁻3 厘米/秒，n = 3 个独立生物学重复），而匹配对照组的迁移速度为 2.656 厘米/秒。 ± 1.0937 × 10⁻3 厘米/秒，n = 3 个独立生物学重复）。双尾非配对 Student’t 检验显示存在统计学显著差异 [TEER：t(4) = 9.920, p = 0.0006；表观渗透系数：t(4) = 3.395, p = 0.0274] (图 4B在此实验配置中，电阻的一致降低与FITC-葡聚糖通透性的一致增加，共同证明了在肿瘤球体存在下屏障完整性的降低。仅凭这些测量结果并不能确立一种特定的血脑屏障向血肿瘤屏障重塑的机制，且顶侧-基底侧FITC-葡聚糖实验不应被解读为生理性的血液至肿瘤药物递送实验。

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图 2免疫荧光染色在血睾屏障模型中的应用。 匹配的无球体血脑屏障对照模型与血脑肿瘤屏障模型中顶端细胞层的泛细胞角蛋白与胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色代表性图像，两者均覆盖等量基底膜基质，并同时显示HMC3-RFP信号。首列为示意图，黑色方框标示共聚焦成像观察区域。首行显示无肿瘤球体的匹配对照模型（无球体组）；第二行显示血脑肿瘤屏障模型中远离肿瘤球体的区域（远端区域）；第三行显示血脑肿瘤屏障模型中毗邻肿瘤球体的区域（球体周区域）。箭头指示呈现反应性表型特征星形胶质细胞形态的区域。细胞核经DAPI复染（蓝色），肿瘤细胞经泛细胞角蛋白标记（绿色），表达RFP的小胶质细胞显示为红色，胶质纤维酸性蛋白染色显示为青色。比例尺 = 100 μm µm. 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 3免疫荧光染色显示，在 BTB 模型中存在符合瘤周反应性星形胶质细胞增生的形态学特征。(A) 乳腺癌脑转移患者的脑组织切片进行了H&伊红染色。肿瘤组织与脑实质或血管交界处的星形胶质细胞结构显示出与瘤周反应性星形胶质细胞增生一致的形态学特征。黑色箭头指示代表性区域。免疫荧光染色进一步显示星形胶质细胞具有与反应性表型一致的形态学特征；红色箭头突出显示一个代表性区域。比例尺：50 µH 的 m&第一行中的 E 染色图像，10 µH 的 m&第二行中的E染色图像，以及50 µ第三行免疫荧光图像的放大倍数为m。 (B) 在匹配的无球体血脑屏障模型以及血瘤屏障模型的远端区域和球体周围区域进行了AQP4免疫荧光染色。第一行显示血脑屏障模型的代表性图像，第二行显示血瘤屏障模型远端区域的代表性图像，第三行显示邻近肿瘤球体的球体周围区域的代表性图像。箭头指示球体周围区域的星形胶质细胞形态变化。细胞核用DAPI染色，显示为蓝色，而AQP4显示为黄色。比例尺 = 100。 µm. 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 4BTB 模型的功能表征。(A) 血脑屏障（BBB）与血肿瘤屏障（BTB）模型中基底内皮细胞层ZO-1的免疫荧光染色图，其上覆盖了等量的基底膜基质。第一列为示意图，其中黑色方框标示了共聚焦成像的选定区域。第一行展示了不含肿瘤球体（No Spheroid）的BBB模型中基底细胞层的代表性图像，第二行展示了含有肿瘤球体（With Spheroid）的BTB模型中基底细胞层的代表性图像。红色箭头突出了一个ZO-1荧光稀疏且存在局灶性不连续的区域。细胞核经DAPI染色显示为蓝色，ZO-1显示为绿色。比例尺 = 50 µm. (B) 匹配的无球体血脑屏障对照（无球体）与血脑肿瘤屏障条件（有球体）的跨内皮电阻值及FITC-葡聚糖（4 kDa）表观渗透系数，两者均覆盖等量基底膜基质。每个条件n = 3个独立生物学重复。图中显示所有三个生物学重复的独立数据点，汇总数据以平均值呈现。 ± SD。FITC-葡聚糖的表观渗透系数值是在顶侧至基底侧方向测得的。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

类球体模型被用于引入三维肿瘤组分，该模型提供了传统二维肿瘤细胞培养无法模拟的空间结构和扩散限制。其简单性和可重复性也使其适用于以筛选为导向的工作流程。将类球体与包含脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的三细胞人源屏障室相结合，构建出简化的多细胞人源模型 体外 BTB模型。该系统操作简便，可与多孔培养板兼容，并支持屏障功能的定量检测（图1），并可通过免疫荧光染色实现细胞形态和空间分布的可视化。所观察到的GFAP/AQP4相关星形胶质细胞改变及其在形态学上与乳腺癌脑转移组织中瘤周星形胶质细胞的相似性，支持该模型在研究特定肿瘤-胶质-内皮相互作用中的相关性。5尽管这些发现并不能证明其与完整的人类血睾屏障具有等效性。

采用悬滴法生成肿瘤类球体，并与人脑微血管内皮细胞、人星形胶质细胞和人小胶质细胞共培养，以建立简化的多细胞人源模型 体外 BTB平台。在所测试的条件下，肿瘤类球体与降低的TEER、增加的顶端至基底侧FITC-葡聚糖通透性、ZO-1结构的改变以及星形胶质细胞标志物和形态学变化相关。TEER和通透性测量是评估屏障完整性的 established 方法。 体外 屏障系统13,14这些发现表明，在该明确的系统中存在与肿瘤球体相关的血脑屏障功能障碍及胶质细胞重塑。然而，该血脑肿瘤屏障（BTB）平台并未实现完整的血脑屏障（BBB）向血脑肿瘤屏障（BTB）的转化、小胶质细胞的主动迁移，或BTB重塑的特定分子机制。因此，该平台应被视为一种适用于生成假设并开展对肿瘤–胶质–内皮细胞相互作用进行可控研究的可行实验模型，在模拟全身药物递送时需采用方向性正确的转运实验。

该简化模型存在若干重要局限性。首先，它不包含完整的神经血管单元或脑-肿瘤微环境。模型中缺乏周细胞、神经元、生理上完整的基底膜/细胞外基质以及循环免疫细胞。周细胞是神经血管功能和屏障功能的重要调节因子15,16,17，但将其整合到标准化的人类 体外 由于原代人源周细胞的获取受限且存在批次间差异，该模型的建立仍具挑战性。因此，不应将该模型描述为完整的人血-肿瘤屏障（BTB），而应视为一种简化的实验平台。其次，本研究仅采用SK-BR-3这一种乳腺癌细胞系，所观察到的表型因此不能推广至乳腺癌脑转移（BCBM）生物学的整体情况。为建立普适性与患者相关性，有必要使用其他乳腺癌亚型、嗜脑转移模型以及患者来源的BCBM类球体或类器官进行验证。第三，当前HMC3-RFP数据为终点观察结果，无法判断空间分布模式是源于主动迁移、存活差异，还是预先存在的分布状态。要区分这些可能性，需进行纵向活细胞成像。第四，ZO-1、TEER和FITC-葡聚糖数据证实了屏障功能受损，但无法区分血-肿瘤屏障特异性重塑与非特异性内皮损伤；需要进一步的分子表征和机制对照实验。第五，由于在此装置中HBMECs接种于膜的基底侧，所报道的顶-基底向FITC-葡聚糖检测实际上反映的是屏障完整性，而非生理性的血液至肿瘤转运过程。系统性递送研究应将示踪剂或药物引入下方/基底侧的内皮面向腔室，并验证其向上方/顶侧肿瘤腔室的转运情况。最后，当前功能检测每种条件仅基于三个独立的生物学重复。尽管该设计可区分生物学重复与技术重复，但增加独立生物学重复的数量将进一步增强可重复性的评估。整合上述改进措施，包括引入周细胞和患者来源材料，可逐步提升该平台的生理相关性与转化应用价值。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由辽宁省教改项目（JG24DB110）、大连市生命健康指导计划项目（2025ZDJH01PT101）、大连医科大学附属第二医院1+X项目（2024LCJSYL07），以及中国科学院大连化学物理研究所与大连医科大学联合基金（DMU-2&DICP UN202509）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1×)（用于分离 HMC3-RFP 细胞）NCM BiotechC100C1在细胞制备过程中用于分离 HMC3-RFP 细胞。
1.5 mL 离心管Jet BiofilCFT001015用于收集、洗涤和处理肿瘤类球体。
12 孔细胞培养板Jet BiofilTCP011012在 BBB/BTB 模型构建过程中用于承载 12 孔细胞培养小室。
3D 细胞培养透明试剂Thermo FisherV11326在封片和共聚焦成像前用于透明染色的细胞培养膜。
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔二抗ProteintechRGAR002用于免疫荧光检测兔源一抗的荧光二抗。
Alexa Fluor 647 标记的山羊抗鼠二抗ProteintechRGAM005用于免疫荧光检测鼠源一抗的荧光二抗。
抗体稀释液SolarbioA1800用于免疫荧光染色中一抗的稀释。
抗荧光淬灭封片剂SolarbioS2100用于封固染色膜并减少成像过程中的荧光淬灭。
星形胶质细胞生长添加剂 (AGS)ScienCell1852用于人星形胶质细胞培养的添加剂。
星形胶质细胞培养基 (AM)ScienCell1801用于人星形胶质细胞的培养基，也是混合上室培养基的组分之一。
细胞培养皿ServicebioCCD-100用于常规细胞培养和悬滴法肿瘤类球体制备。
I 型胶原蛋白Corning354249用于细胞接种前对培养容器和细胞培养小室进行包被。
盖玻片Citotest10212450C用于封片和显微镜样品制备。
DAPI 染色液ServicebioG1012-10ML用于免疫荧光染色中的细胞核复染。
DMEM 基础培养基 (1×)GibcoC11995500BT作为 FITC-葡聚糖通透性实验中的基础培养基。
内皮细胞生长添加剂 (ECGS)ScienCell1052用于人脑微血管内皮细胞培养的添加剂。
内皮细胞培养基 (ECM)ScienCell1001用于 HBMECs 培养以及 BBB/BTB 模型的下室培养。
胎牛血清 (FBS)GibcoA5669701用于完全细胞培养基中的血清添加剂。
FITC 标记的葡聚糖（分子量 4,000）BeyotimeST2930-50mg作为荧光示踪剂用于评估旁细胞通透性并计算 Papp 值。
荧光抗体稀释液SolarbioA1840用于免疫荧光染色中荧光二抗的稀释。
冰醋酸Sigma27225用于配制 I 型胶原蛋白包被液。
HA人星形胶质细胞NA用于评估肿瘤相关形态学和标志物反应的星形胶质细胞组分
HBMEC人脑微血管内皮细胞NABBB/BTB 模型中的内皮屏障组分
HMC3-RFPRFP 标记的人小胶质细胞系 HMC3NA用于荧光追踪的小胶质细胞组分
MatrigelCorning354230作为基底膜基质覆盖层，用于分隔肿瘤类球体与屏障细胞区室。
MEM（含 NEAA）完全培养基 (10)Procell SystemPM150410B作为混合上室培养基的组分之一。
载玻片Citotest188105用于固定切除的染色膜以进行共聚焦成像。
鼠抗人 GFAP 抗体EMD MilliporeMAB360-25μL通过免疫荧光法检测星形胶质细胞中 GFAP 的一抗。
多聚甲醛ServicebioG1101-500ML用于免疫荧光染色前的细胞固定。
PBS 磷酸盐缓冲液粉末ServicebioG0002-2L用于整个实验流程中的洗涤、平衡和配制步骤。
青霉素-链霉素溶液 (P/S)ServicebioG4003-100ML用于完全细胞培养基中的抗生素添加剂。
移液器Eppendorf3123000250用于整个细胞培养和检测过程中的液体操作。
移液器吸头MWM Bio800201用于常规液体操作；经剪切改造的吸头用于肿瘤类球体的转移。
兔抗人 PAN-CK 多克隆抗体MedChemExpressHY-P81164通过免疫荧光法鉴定肿瘤细胞的一抗。
兔抗人 ZO-1 抗体Proteintech21773-1-AP通过免疫荧光法评估内皮细胞紧密连接结构的一抗。
SK-BR-3人乳腺癌细胞系NA用于 BTB 构建的肿瘤类球体组分
组织培养板小室（0.4 μm，PET 膜），12 孔板Jet BiofilTCS016012用于构建 BBB/BTB 共培养模型的多孔细胞培养小室。
跨上皮电阻（TEER）测量仪MillicellERS-2用于测量细胞培养小室上的电阻，作为屏障完整性的读数指标。
TrypLE Express (1×)（用于分离 HBMECs 和 HA 细胞）Gibco12605-010在细胞制备过程中用于分离 HBMECs 和 HA 细胞。

参考文献

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