网络药理学和分子对接表明，Rhizoma Drynariae 可作用于多个靶点和通路，通过抗炎、抗凋亡和促血管生成作用缓解肩袖损伤。
本文内容
摘要
摘要
肩袖损伤（RCI）是一种难治性肌肉骨骼系统疾病，其特征为慢性炎症、肌腱细胞凋亡、血管生成受损以及细胞外基质（ECM）失调，目前临床治疗手段有限。本研究采用网络药理学与分子对接方法，系统探究其活性成分、关键靶点及信号通路 骨碎补 (RD) 对抗 RCI。从 TCMSP、ETCM 和 SymMap 中鉴定了 RD 的 18 种活性成分和 213 个非冗余靶点，从 GeneCards 和 OMIM 中检索到 870 个与 RCI 相关的靶点，获得 71 个重叠的候选靶点。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析和 cytoHubba 筛选揭示了 10 个核心基因，包括 TNF, IL6, VEGFA, PTGS2, CASP3, AKT1, CCL2, PPARG, MAPK3，以及 HMOX1基因本体富集分析揭示了炎症反应、氧化应激、血管生成、细胞增殖及细胞外基质（ECM）组织等过程，KEGG通路分析则表明TNF、PI3K-Akt、MAPK和HIF-1信号通路的参与。分子对接证实了木犀草素、芹菜素、儿茶素、柚皮素和金鱼草素与这些核心蛋白之间存在稳定且高亲和力的结合。综上，RD通过多成分、多靶点、多通路的网络机制发挥抗放射性脑损伤（RCI）作用，可能通过抑制炎症与细胞凋亡、促进血管生成以及增强ECM修复来缓解RCI，为其临床应用及实验验证提供了理论基础。
引言
肩袖损伤（RCI）是骨科和运动医学中最常见的肩部疾病之一，影响约20%年龄超过20岁的成年人，以及高达54%年龄超过60岁的老年人1,2。RCI在病理上表现为肌腱退变、炎性细胞浸润、腱细胞过度凋亡、新生血管化不足以及细胞外基质合成紊乱，导致慢性肩痛、活动受限、肌肉萎缩，甚至关节不稳3。若不及时治疗，RCI可显著降低生活质量，并带来沉重的社会经济负担4。目前针对RCI的治疗策略包括保守治疗和手术修复5。非甾体抗炎药（NSAIDs）和皮质类固醇注射可缓解疼痛，但存在胃肠道损伤、肾功能障碍、软骨退变和骨质疏松等风险6,7。手术修复虽可改善短期功能，但仍受限于较高的再撕裂率、术后粘连以及长期愈合质量不佳等问题8,9。因此，亟需开发安全、有效且具有多靶点作用的RCI治疗药物。
传统中医（TCM）在治疗肌肉骨骼疾病方面具有多组分、多靶点和低毒性的优势，拥有悠久的历史10。Rhizoma Drynariae（RD）是Drynaria fortunei（Kunze）J. Sm.的干燥根茎，是一种具有代表性的强骨中药，可促进血液循环、祛除血瘀，并加速肌腱和骨骼的修复11,12。现代药理学已证实，黄酮类化合物是RD的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、促骨生成及软骨保护作用13。RD已被广泛应用于骨质疏松症、骨关节炎、股骨头坏死和椎间盘退行性病变的治疗14,15,16。然而，目前尚无系统性研究探讨RD对抗放射性骨损伤（RCI）的疗效及其作用机制。网络药理学是一种新兴的交叉学科方法，整合了生物信息学、系统生物学和药理学，非常适合解析传统中药的整体作用机制17,18。该方法能够系统构建“药物–成分–靶点–通路–疾病”调控网络，并高通量预测潜在的治疗靶点19。本研究结合网络药理学与分子对接技术，旨在探索RD治疗RCI的活性成分、核心基因及关键信号通路，为临床应用及后续实验研究提供理论依据。
方案
本研究仅使用匿名的公共生物信息学数据库，未涉及人类或动物实验。根据中国国家伦理审查法规第32条及《赫尔辛基宣言》，本研究免除了伦理审批和知情同意的要求。本研究中使用的所有材料均列于材料表中。
研究设计与工作流程图
本项网络药理学研究的完整工作流程，包括成分筛选、靶点获取、网络构建、富集分析及分子对接验证，每一步均遵循统一的生物信息学标准进行，以确保所有预测数据的可重复性（图1）。
RD中活性成分的筛选
传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）是一个基于草药系统药理学建立的在线平台20。该平台全面收集了天然化合物的药代动力学参数，包括口服生物利用度（OB）、药物相似性（DL）、血脑屏障穿透能力及相关靶点信息。研究人员输入关键词“Rhizoma Drynariae”以检索TCMSP数据库中存储的骨碎补（RD）全部化学成分，并依据吸收、分布、代谢、排泄（ADME）指标筛选符合条件的活性成分，设定OB ≥ 30% 且 DL ≥ 0.18。满足上述两项标准的化合物被保留，作为候选活性成分用于探索骨碎补对抗放射性脑损伤（RCI）的治疗机制。数据库访问日期：TCMSP V2.3 [2025-12-08]。导出字段包括化合物名称、OB值、DL值及相应靶蛋白条目。重复的化合物条目已通过人工方式去除。
RD 潜在靶点的收集
研究人员从三个独立数据库中获取了雷公藤（RD）的作用靶点：TCMSP、《中药系统药理学数据库与分析平台》（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）21 和 SymMap（http://www.symmap.org/）22。TCMSP 是一个专门的中药系统药理学平台，记录了中药、小分子化合物、蛋白靶点与人类疾病之间的相互关系。ETCM 整合了常用中药药材和方剂的标准化信息，收录了中药成分、靶基因、通路及疾病相关数据。SymMap 通过分子机制和症状映射，整合了中医理论与现代医学。在提取药物靶点时，物种统一设定为 Homo sapiens。在获得原始靶蛋白序列后，通过 UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）23 将所有靶点条目转换为统一的标准基因符号。去除重复的靶基因后，保留去重后的 RD 靶点集合，用于与疾病靶点进行交叉分析。数据库访问日期：ETCM V2.0 [2025-12-10]，SymMap V2.0 [2025-12-11]，UniProt 发布版本 [2025-12-12]。作者从 TCMSP、ETCM 和 SymMap 导出原始的靶蛋白条目，并利用 UniProt 将蛋白标识符映射为官方的人类 HUGO 基因符号。来自多个数据库的重复靶点被去除，每个靶点仅保留一个唯一的基因符号。
寻找RCI的潜在靶点
采用两个权威数据库，以“rotator cuff injury”为检索关键词筛选与肩袖损伤（RCI）相关的人类基因。GeneCards（https://www.genecards.org/）整合了来自150多个遗传学平台的多组学数据，并提供基因功能注释24。在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/）记录了人类遗传性疾病，揭示了基因变异与临床表型之间的关联25。提取所有与肩袖损伤相关的基因条目，包括基因名称和基因ID。将两个数据库的数据合并并去除重复项，以获得用于维恩交集分析的完整致病基因集合。数据库访问日期：GeneCards [2025-12-15]，OMIM [2025-12-21]。检索词：“rotator cuff injury”。导出字段包含与疾病相关的人类基因名称及基因ID。合并后已去除两个数据库间的重复基因条目。物种筛选限定为智人（Homo sapiens）。
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建
将筛选的罕见病（RD）靶标数据集和RCI致病基因数据集上传至Venny在线平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），以生成维恩图并筛选重叠的共有基因。将交集基因导入STRING v11.5（https://cn.string-db.org/）进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建26。STRING收录了来自5000多个物种的超过2400万种蛋白质的已验证和预测的蛋白质相互作用信息。设置物种为Homo sapiens，置信度评分阈值设为0.7，以过滤低可信度的相互作用对。导出的PPI文件被导入Cytoscape 3.8.0进行可视化和拓扑分析27。Venny 2.0于[2025-12-24]访问用于维恩图计算。STRING v11.5访问日期：[2025-12-28]。作者导出了完整的TSV格式的蛋白质-蛋白质相互作用表，包含蛋白质标识符、基因符号以及综合相互作用置信度评分。
枢纽基因分析
使用 Cytoscape 3.8.0 中嵌入的 cytoHubba 插件分析每个网络节点的拓扑特征。筛选出 Maximal Clique Centrality (MCC) 评分最高的前 10 个枢纽基因。MCC 是 cytoHubba 内置的一种排序算法，MCC 评分越高，表明该基因在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中的拓扑位置越关键。这些基因在整个网络中发挥核心调控作用。
基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
将RD对抗RCI的所有重叠治疗靶点导入R x64 4.0.3软件，并将物种设定为Homo sapiens。利用Bioconductor的clusterProfiler软件包进行GO和KEGG富集分析。GO分析包含三个模块：生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），分别注释靶蛋白的生物学行为、亚细胞定位和生化功能28。KEGG分析将基因映射至细胞内信号级联通路，以观察靶点在不同生物学通路中的分布情况29。提取在RD干预RCI中显著富集的BP、CC、MF条目及相关核心通路，并导出所有富集结果用于作图，以p < 0.05作为显著性阈值。
分子对接模拟
通过PPI分析筛选出的枢纽基因被定义为蛋白质受体，将RD活性成分设定为小分子配体。通过分子对接模拟探索枢纽蛋白与相应成分之间的天然结合相互作用。三维配体结构从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）30下载，受体晶体结构从RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）31获取。受体结构在AutoDock 432中进行预处理，包括去除冗余水分子和添加极性氢原子。批量对接计算由AutoDock Vina结合Open Babel软件完成。结合自由能≤ −7.0 kcal/mol的复合物被定义为具有高分子间亲和力的稳定结合结构。该经验阈值常用于基于AutoDock Vina的植物源生物活性化合物的计算机研究中，但不能替代蛋白质-配体相互作用的实验验证33。亲和力排名前20的对接复合物被导入PyMOL以绘制三维结合构象图34。PubChem访问日期：[2026-02-10]；RCSB-PDB访问日期：[2026-02-03]。小分子结构通过化合物名称检索获得；蛋白质受体结构通过基因对应的PDB登录号检索获得。
统计学分析
使用 R x64 4.0.3、Cytoscape 3.8.0 和 PyMOL 完成所有生物信息学统计分析和作图。p < 0.05 表示所有富集项目的差异具有统计学显著性。
结果
RD 的活性成分
以“Rhizoma Drynariae”为关键词，从TCMSP数据库中共检索出71种原始化学成分。根据ADME标准（OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18）进行二次筛选，最终获得18种具有较好口服吸收性和成药性的生物活性成分。表1汇总了这18种活性成分的详细基本信息。这18种化合物构成了骨碎补抗放射性脑损伤的多组分物质基础。
RD 的相关基因靶点
通过检索TCMSP、ETCM和SymMap数据库，获得了与RD活性成分匹配的靶基因，共收集到327个原始靶点条目。在整合数据并去除重复的基因符号后，共获得213个非冗余的RD潜在靶基因，用于后续交集分析。
RCI 的相关基因靶点
使用关键词“rotator cuff injury”在Genecards和OMIM数据库中进行检索，共获得989条与RCI相关的原始基因条目。经过数据整合与去重后，获得了870个与RCI进展密切相关的独特人类致病基因。
蛋白质相互作用网络的构建
213 个 RD 靶基因与 870 个 RCI 致病基因的交集分析共识别出 71 个重叠基因，这些基因被定义为 RD 治疗 RCI 的潜在治疗靶点。使用 Venny 2.0 软件生成了显示交集关系的维恩图（图 2）。将这 71 个重叠靶点导入 STRING 数据库，构建 RD 干预 RCI 的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图 3）。完整的 PPI 数据被导入 Cytoscape，通过 cytoHubba 筛选出 MCC 评分最高的前 10 个枢纽基因：TNF、IL6、VEGFA、PTGS2、CASP3、AKT1、CCL2、PPARG、MAPK3、HMOX1。它们的 MCC 拓扑信息汇总于 表 2，并在 图 4 中进行了可视化展示。这 71 个交集基因代表了介导 RD 对抗 RCI 治疗效应的核心靶点。
GO 和 KEGG 富集分析
为了探究RD候选靶点在治疗RCI中的分子机制，使用clusterProfiler软件包对重叠的治疗靶点进行GO和KEGG富集分析。分别对BP、CC和MF进行GO富集统计。图5A–B、图6A–B和图7A–B展示了BP、CC和MF中前10个显著富集的条目，各图的子图B显示了每个功能术语的基因分布。进一步开展KEGG富集分析，以挖掘RD干预RCI所涉及的核心通路，并在图8中可视化展示了前30条富集通路。
分子对接模拟
将排名前10的枢纽基因设定为蛋白质受体，并将全部18种RD活性成分作为配体，通过AutoDock Vina和Open Babel进行对接计算。PyMOL用于可视化配体-受体结合构象。对接结果表明，大多数枢纽靶标蛋白与RD活性成分形成了稳定的结合结构。表3和图9记录了结合亲和力最优的前20个复合物的完整对接参数及其三维结合图谱。
在本项网络药理学分析中，共检索到RD的18种生物活性成分及213个非冗余的药物相关靶点。与870个RCI相关基因取交集后，获得71个共同的治疗候选靶点。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并利用cytoHubba-MCC算法筛选，得到10个核心基因：TNF、IL6、VEGFA、PTGS2、CASP3、AKT1、CCL2、PPARG、MAPK3和HMOX1。基因本体（GO）功能富集分析涵盖生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），KEGG通路富集分析则识别出多条显著富集的信号通路。分子对接模拟验证了RD主要活性成分与这些核心靶点蛋白之间具有良好的结合亲和力。
数据可用性：
本研究中生成的所有原始数据和处理后的数据，包括靶点列表、蛋白质-蛋白质相互作用网络文件、GO 和 KEGG 富集分析结果以及分子对接矩阵，均已存入科学数据银行。原始数据访问链接为 https://www.scidb.cn/anonymous/alVOVlJu。
图1：本研究中应用的生物信息学分析流程示意图。 从左侧开始，从TCMSP、ETCM和SymMap数据库中获取候选生物活性化合物及其对应的RD靶点；在右侧，从GeneCards和OMIM数据库中获取与RCI相关的基因。通过维恩图鉴定这两个数据集的交集基因靶点，并将其定义为潜在治疗靶点。随后将共有靶点分为两个独立分支进行分析：一个分支使用STRING和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用网络；另一个分支使用R软件包clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析。从PPI网络中提取的核心基因进一步通过分子对接进行验证，其中结构准备和模拟分析使用PubChem、PDB、AutoDock Vina和PyMOL完成。缩写：RD = Rhizoma Drynariae，RCI = rotator cuff injury，TCMSP = The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，ETCM = The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，OMIM = The Online Mendelian Inheritance in Man，GO = gene ontology，KEGG = Kyoto encyclopedia of genes and genomes。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：RD 与 RCI 之间重叠靶点的维恩图。 蓝色圆圈代表与 RCI 相关的靶点。黄色圆圈代表 RD 的潜在治疗靶点。重叠的橄榄绿色区域表示 RD 与 RCI 共享的靶点。各区域内的数字和百分比表示独特或共享靶点的数量及其比例。缩写：RD = Rhizoma Drynariae，RCI = 肩袖损伤。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：通过关联RD与RCI的71个重叠基因靶点构建的PPI网络。 网络中的每个圆圈代表一个靶基因，标注为其官方基因符号。连接两个圆圈的线条表示从公共生物信息学数据库中挖掘出的蛋白质-蛋白质相互作用关系。节点的大小和颜色饱和度反映了各个基因在网络中的拓扑重要性。圆圈越大、绿色越深的基因具有更高的拓扑得分，并处于更中心的位置；而较小、呈浅黄色的圆圈表示拓扑重要性较弱的基因。缩写：RD = 骨碎补，RCI = 肩袖损伤，PPI = 蛋白质-蛋白质相互作用。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：利用 cytoHubba 插件从 PPI 网络中鉴定出的前10个枢纽基因。 矩形框代表枢纽基因，每个框均标注其官方基因符号。连接矩形框的黑线表示这些核心靶点之间的蛋白质相互作用。从亮红色经橙色到黄色的颜色梯度表示根据 cytoHubba 插件计算的 MCC 评分对枢纽基因进行的排序；亮红色框表示 MCC 评分最高、在网络中重要性最大的基因，而黄色框表示评分相对较低的基因。缩写：PPI = protein-protein interaction，MCC = Maximal Clique Centrality。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：RD 对 RCI 的71个共有靶基因的生物过程（BP）富集分析。（A）针对生物过程（BP）的潜在治疗靶点的GO富集分析。该图为横向条形图，显示前10个显著富集的GO生物过程术语。横轴（X轴）表示基因数量，即注释到每个GO术语的靶基因数目；纵轴（Y轴）列出各个富集的GO术语。右侧连续色带编码-log10(p值)；偏红的暖色调表示更高的-log10(p值)和更强的统计学显著性，而偏紫和蓝色的冷色调表示显著性较低。（B）潜在治疗靶点与生物过程（BP）之间的关系。图B为弦图，展示富集的GO术语与其对应靶基因之间的成对关联。外圈被分为两类：彩色区块代表不同的GO生物过程术语，灰色矩形刻度标记各个靶基因符号。圆内弯曲的带状连接线将GO术语与其匹配的靶基因相连，每条带状线表示一个基因参与某一GO术语的过程。每条带状线的颜色继承自外圈对应GO术语的颜色。底部图例将每种颜色与相应的GO术语对应。缩写：RD = Rhizoma Drynariae，RCI = 肩袖损伤，BP = 生物过程，GO = 基因本体论。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：基于RD治疗RCI的71个候选靶点所获得的GO-CC术语。（A）针对细胞组分（CC）的潜在治疗靶点的GO富集分析。（B）潜在治疗靶点与细胞组分（CC）之间的关系。图A为横向条形图，展示了前10个显著富集的GO细胞组分条目。横轴（X轴）表示被分配至各GO术语的靶基因数量，标注为“Counts”（计数）。GO细胞组分的富集描述沿纵轴（Y轴）排列。右侧的颜色条表示颜色变化与-log10(pvalue)值的对应关系；亮红色代表较高的-log10(pvalue)值和更强的统计学显著性，而蓝色调则表示显著性水平较低。图B为弦图，用于可视化富集的GO细胞组分术语与其相关靶基因之间的连接关系。外圈被划分为两个部分：彩色区块代表不同的GO细胞组分术语，灰色刻度线代表各个靶基因符号。圆内弯曲的带状连接线将每个基因与其匹配的GO术语相连，每条带状线采用外圈对应GO术语的颜色。底部图例定义了所有GO细胞组分类别的颜色编码。缩写：RD = Rhizoma Drynariae，RCI = 肩袖损伤，CC = 细胞组分，GO = 基因本体论 请点击此处查看该图的放大版本。
图7： 基于RD治疗RCI干预的71个重叠靶基因进行的分子功能（MF）富集分析。（A）分子功能（MF）潜在治疗靶点的GO富集分析。（B）潜在治疗靶点与分子功能（MF）之间的关系。图A为横向条形图，展示了显著富集的前10个GO分子功能条目。横轴（X轴）上的数值表示基因数量，对应于注释到每个分子功能条目的靶基因总数。纵轴（Y轴）列出各个GO分子功能的描述。右侧的颜色梯度条将颜色变化转换为-log10(pvalue)指标；亮红色代表较高的-log10(pvalue)值和更强的统计学显著性，而蓝色则表示显著性较弱。图B为弦图，用于描绘富集的GO分子功能类别与其相关靶基因之间的关系。外环上的区段包含两类标签：彩色方块表示不同的GO分子功能条目，灰色小矩形刻度标记各个靶基因符号。从外环向内延伸的弧形带将每个基因与其对应的分子功能条目连接，每条带的颜色继承其对应GO条目的颜色。底部图例定义了图中所有GO分子功能类别的颜色编码。缩写：RD = Rhizoma Drynariae，RCI = rotator cuff injury，MF = 分子功能，GO = 基因本体 请点击此处查看该图的放大版本。
图8：RD 对抗 RCI 的71个共有靶基因的 KEGG 通路富集分析。 该点图展示了富集最显著的 KEGG 通路。纵轴（Y轴）列出各个富集通路的名称。横轴（X轴）表示 GeneRatio，定义为映射到某通路的靶基因数与该通路总基因数的比值。每个圆点代表一个富集通路。圆点大小对应基因数量，较大的圆圈表示注释到该通路的靶基因更多。圆点颜色反映 p 值：红色表示 p 值较低，统计学显著性更强；深蓝色表示 p 值较高，统计学显著性较弱。两个侧边图例分别定义了基因数量和 p 值颜色映射的尺度。缩写：RD = Rhizoma Drynariae，RCI = 肩袖损伤，KEGG = 京都基因与基因组百科全书。 请点击此处查看该图的高清版本。
图9：排名靠前的分子对接复合物。（A）（PTGS2，木犀草素，-9.7 kcal/mol）。（B）（PTGS2，芹菜素，-9.6 kcal/mol）。（C）（PTGS2，儿茶素，-9.5 kcal/mol）。（D）（PTGS2，柚皮素，-9.5 kcal/mol）。（E）（PTGS2，金合欢素，-9.4 kcal/mol）。（F）（PTGS2，山奈酚，-9.2 kcal/mol）。（G）（PTGS2，色原烷，-9.1 kcal/mol）。（H）（TNF，儿茶素，-9.1 kcal/mol），（I）（PTGS2，没食子酸双酯，-9 kcal/mol）。（J）（TNF，没食子酸双酯，-9 kcal/mol），（K）（PPARG，色原烷，-8.9 kcal/mol）；（L）（PPARG，柚皮素，-8.9 kcal/mol），（M）（TNF，金合欢素，-8.9 kcal/mol）；（N）（TNF，山奈酚，-8.8 kcal/mol）；（O）（MAPK3，色原烷，-8.7 kcal/mol）；（P）（MAPK3，柚皮素，-8.7 kcal/mol）；（Q）（PPARG，金合欢素，-8.7 kcal/mol）；（R）（PPARG，山奈酚，-8.7 kcal/mol）；（S）（PTGS2，22-豆甾烯-3-酮，-8.7 kcal/mol）；（T）（MAPK3，芹菜素，-8.6 kcal/mol）。图A至图T分别展示了各个小分子化合物在相应蛋白质靶标结合腔内的计算结合构象。青色棍状模型表示构成蛋白质结合腔的氨基酸残基。小分子配体以品红或绿色棍状模型呈现，以区分不同的化学结构。黄色虚线标示配体与结合位点残基之间的分子间氢键，数值标注表示氢键距离（单位为埃，Å）。半透明白色表面描绘了各蛋白受体的整体三维拓扑结构。所有结合构象的计算均通过AutoDock Vina软件进行刚性受体分子对接完成。请点击此处查看该图的放大版本。
| 分子编号 | 分子名称 | 口服生物利用度 (OB) (%) | 类药性 (DL) |
| MOL001040 | (2R)-5,7-二羟基-2-(4-羟苯基)色原酮-4-酮 | 42.36 | 0.21 |
| MOL001978 | Aureusidin | 53.42 | 0.24 |
| MOL002914 | Eriodyctiol (黄烷酮) | 41.35 | 0.24 |
| MOL000449 | Stigmasterol | 43.83 | 0.76 |
| MOL000358 | beta-sitosterol | 36.91 | 0.75 |
| MOL000422 | kaempferol | 41.88 | 0.24 |
| MOL004328 | naringenin | 59.29 | 0.21 |
| MOL000492 | (+)-儿茶素 | 54.83 | 0.24 |
| MOL005190 | eriodictyol | 71.79 | 0.24 |
| MOL000569 | digallate | 61.85 | 0.26 |
| MOL000006 | 木犀草素 | 36.16 | 0.25 |
| MOL009061 | 22-豆甾烯-3-酮 | 39.25 | 0.76 |
| MOL009063 | Cyclolaudenol acetate | 41.66 | 0.79 |
| MOL009075 | cycloartenone | 40.57 | 0.79 |
| MOL009076 | cyclolaudenol | 39.05 | 0.79 |
| MOL009078 | davallioside A_qt | 62.65 | 0.51 |
| MOL009087 | marioside_qt | 70.79 | 0.19 |
| MOL009091 | xanthogalenol | 41.08 | 0.32 |
表1： 源自骨碎补的18种候选生物活性成分的药代动力学特征。 化合物从TCMSP数据库中获取，并通过两个与ADME相关的阈值进行筛选：口服生物利用度（OB）≥ 30%，药物相似性（DL）≥ 0.18。表格各列列出TCMSP数据库中的化合物编号（Mol ID）、化合物名称、计算得到的OB值（%）以及各筛选成分的DL评分。缩写：RD = Rhizoma Drynariae，RCI = 肩袖损伤，ADME = 吸收、分布、代谢、排泄，TCMSP = 传统中药系统药理学数据库与分析平台，OB = 口服生物利用度，DL = 药物相似性。
| 排名 | 基因 | 名称 | 得分 |
| 1 | TNF | 肿瘤坏死因子 | 328291218366500 |
| 2 | IL6 | 白细胞介素6 | 328291215913592 |
| 3 | VEGFA | 血管内皮生长因子A | 328291215896284 |
| 4 | PTGS2 | 前列腺素内过氧化物合酶2 | 328288656326402 |
| 5 | CASP3 | Caspase 3 | 328288180323600 |
| 6 | AKT1 | AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1 | 328287745700516 |
| 7 | CCL2 | C-C基序趋化因子配体2 | 328161521686320 |
| 8 | PPARG | 过氧化物酶体增殖物激活受体γ | 325302724852296 |
| 9 | MAPK3 | 丝裂原活化蛋白激酶3 | 308779166166218 |
| 10 | HMOX1 | 血红素加氧酶1 | 299171945318400 |
表2：从PPI网络中鉴定出的前10个枢纽基因。 基因根据Cytoscape中cytoHubba插件计算的MCC评分进行排序。MCC是cytoHubba的一种拓扑学指标，数值越大表示在网络中的拓扑重要性越高。各列表示排序、官方基因符号、基因全称以及每个枢纽基因对应的原始MCC评分。缩写：PPI = 蛋白质-蛋白质相互作用，MCC = 最大团中心性。
| 受体 | 配体 | 自由能 (kcal/mol) | 图9中的对应序号 |
| PTGS2 | 埃里奥狄酮 | -9.7 | A |
| PTGS2 | 木犀草素 | -9.6 | B |
| PTGS2 | 儿茶素 | -9.5 | C |
| PTGS2 | 柚皮素 | -9.5 | D |
| PTGS2 | 金黄色素 | -9.4 | E |
| PTGS2 | 山奈酚 | -9.2 | F |
| PTGS2 | 色原 | -9.1 | G |
| TNF | 儿茶素 | -9.1 | H |
| PTGS2 | 没食子酸双酯 | -9 | I |
| TNF | 没食子酸双酯 | -9 | J |
| PPARG | 色原 | -8.9 | K |
| PPARG | 柚皮素 | -8.9 | L |
| TNF | 金黄色素 | -8.9 | M |
| TNF | 山奈酚 | -8.8 | N |
| MAPK3 | 色原 | -8.7 | O |
| MAPK3 | 柚皮素 | -8.7 | P |
| PPARG | 金黄色素 | -8.7 | Q |
| PPARG | 山奈酚 | -8.7 | R |
| PTGS2 | 22_Stigmasten_3_one | -8.7 | S |
| MAPK3 | 木犀草素 | -8.6 | T |
表3：20个选定受体-配体复合物的分子对接结合亲和力结果。 每行列出了受体蛋白、小分子配体、计算得到的结合自由能（kcal/mol）以及图9中对应的子图标签。更负的自由能值表示蛋白结合口袋与配体化合物之间的结合更稳定。缩写：PTGS2 = 前列腺素-内过氧化物合酶2，TNF = 肿瘤坏死因子，PPARG = 过氧化物酶体增殖物激活受体γ，MAPK3 = 丝裂原活化蛋白激酶3。
讨论
肩袖损伤是一种复杂的肌肉骨骼系统疾病，涉及慢性炎症、肌腱细胞过度凋亡、血管生成受损以及细胞外基质重塑不足，这些病理变化共同导致肌腱-骨愈合不良和临床预后不佳35。该疾病常由急性创伤或肩部长期过度使用引起，持续的炎症反应会破坏肌腱细胞外基质的代谢平衡36。临床上，现有治疗方法无法同时靶向多个病理环节，导致疗效有限且复发率较高37。续断是一种经典的中药药材，具有强筋健骨、活血通络、促进组织修复的作用，长期以来被用于治疗骨与肌腱损伤38。然而，目前研究尚未系统分析续断对抗肩袖损伤的精确分子调控机制。
基于上述研究背景，本研究通过网络药理学和分子对接技术，系统揭示了RD对抗RCI的多成分、多靶点、多通路作用机制。既往植物化学与药理学研究已充分证实，来源于RD的黄酮类化合物具有显著的抗炎、抗氧化、抗凋亡及促血管生成等生物学活性，是其组织修复功能的核心物质基础39。与既往研究结果一致，本研究共鉴定出RD中的18种活性成分，其中柚皮黄素（eriodictyol）、木犀草素（luteolin）、儿茶素（catechin）、柚皮素（naringenin）和金鱼草素（aureusidin）被认定为核心成分。大量植物化学研究表明，黄酮类化合物是RD主要的药效物质40。此类小分子化合物可穿透组织屏障，对受损肌腱的修复微环境发挥综合调控作用41。其良好的ADME特性保证了较高的口服生物利用度（OB）和类药性，支持其作为治疗RCI的天然候选药物。与单靶点化学合成药物不同，这些天然黄酮类化合物可同时干预炎症反应、氧化损伤、细胞存活及血管生成等多个过程，在慢性退行性肌腱病变中展现出独特优势42。
越来越多的研究证实，RCI 的发生与发展与多种功能基因的异常表达密切相关，已有多种核心基因被证明参与了肌腱炎症、细胞凋亡及组织重塑等病理过程43。基于目前公认的 RCI 基因调控机制，本研究进一步探索了 RD 的治疗靶点。共筛选出 71 个交集靶点，作为 RD 抗 RCI 的潜在治疗靶点。通过 PPI 网络分析筛选出 10 个核心基因：TNF、IL6、VEGFA、PTGS2、CASP3、AKT1、CCL2、PPARG、MAPK3 和 HMOX1。其中，TNF 和 IL6 是关键的促炎性细胞因子，可触发炎症级联反应，抑制肌腱细胞增殖，并阻碍细胞外基质合成，从而加重肌腱损伤44。这两种细胞因子的大量释放会招募免疫细胞，放大炎症反应，并抑制肌腱干细胞的增殖45。VEGFA 可促进损伤部位新生血管形成，改善局部血液供应，增强愈合组织的机械强度46。肌腱-骨界面天然血管稀少，新生血管不足是导致损伤后愈合质量不理想的主要因素之一47。PTGS2 介导炎症性疼痛和前列腺素的生成，而 CASP3 是肌腱细胞凋亡的关键执行分子48,49。PTGS2 的过表达会加剧炎症性肿胀和疼痛，而 CASP3 的高度活化则会导致功能性肌腱细胞持续丢失50,51。AKT1 和 MAPK3 是调控细胞存活、增殖和分化的关键激酶，对肌腱再生至关重要52,53。适度激活这两种激酶可维持修复细胞的活力，并加速细胞外基质的沉积54。CCL2 可招募炎症细胞，而 PPARG 和 HMOX1 则发挥抗炎和抗氧化作用55,56,57。这两个基因可缓解氧化应激，减少局部肌腱组织中的过度炎症浸润58。综上所述，这些核心基因共同构成了一个核心调控网络，调节 RCI 中的炎症反应、细胞凋亡、血管生成及组织重塑过程。
现有的病理学研究已阐明，RCI 的病理进展主要由炎症反应、氧化应激、细胞异常增殖以及细胞外基质紊乱所驱动，这些是贯穿 RCI 发生与修复全过程的关键病理环节59。在此基础上，本研究进行了 GO 富集分析，以探讨 RD 干预 RCI 的潜在生物学机制。这些生物学过程正是 RCI 病变发生与修复过程中的关键病理环节，提示 RD 可同时靶向多个病理过程60。大量既往机制研究表明，TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路以及 HIF-1 信号通路是调控肌腱炎症、细胞修复和组织重建的关键信号通路61,62,63,64。为进一步探究 RD 治疗 RCI 的潜在信号机制，本研究基于上述研究基础开展了 KEGG 通路富集分析。结果表明，RD 抗 RCI 主要涉及上述四条通路。TNF 信号通路促进炎症反应和腱细胞凋亡，是肌腱炎症性退变的上游驱动因素65。PI3K-Akt 通路增强细胞存活和血管生成，有利于肌腱愈合，并可协调多种生长因子促进成纤维细胞的胶原分泌66,67。MAPK 信号通路调控细胞增殖、分化及细胞外基质合成，参与肌腱重建的全过程68。HIF-1 信号通路响应缺氧环境并促进血管再生，可有效改善损伤肌腱的缺氧微环境69。这些通路之间相互串扰，形成复杂的调控网络，充分体现了 RD 治疗 RCI 的多通路特性。
分子对接已成为网络药理学研究中常规且辅助性的验证方法，可直接表征活性成分与核心靶点之间的结合活性。因此，本研究采用分子对接方法对网络药理学的预测结果进行验证70。结果表明，热毒宁的核心黄酮类成分能够稳定地结合于枢纽蛋白的活性口袋，进一步验证了网络药理学预测结果的可靠性。这些稳定的结合模式提示，热毒宁可能通过直接作用于关键靶点而发挥治疗作用。黄酮类配体与枢纽蛋白活性位点之间的紧密结合，为后续细胞功能验证实验提供了直观的分子相互作用证据，同时也提供了候选化合物。
本研究存在若干局限性。首先，预测依赖于公共数据库的生物信息学分析，这可能引入对研究较充分的蛋白质的注释偏差。未纳入肩袖肌腱特异性基因表达及蛋白质异构体信息，且基于STRING构建的无向蛋白质相互作用网络无法充分再现肌腱特异性生物学特征。富集通路如TNF、PI3K-Akt和MAPK代表的是常见的炎症级联反应，而非肩袖疾病（RD）特有的分子特征。公共组学资源无法完全再现 体内 人类肩袖组织的动态病理变化和个体差异。未来的研究可整合单细胞RNA测序数据集，以进一步优化对作用机制的解读。其次，化合物筛选采用了经验性的ADME阈值（口服生物利用度≥30%，药物相似性≥0.18），这可能导致一些具有生物活性但口服生物利用度较低的化合物被排除。分子对接采用刚性受体模型，未考虑蛋白质的构象灵活性和结构水分子的影响，且缺乏生物物理实验验证（如表面等离子共振SPR、等温滴定量热法ITC）。研究未设置阳性药物对照，也未开展敏感性分析、毒性评估及全面的药代动力学表征。所有结果均为计算预测。 体外 细胞和 体内 动物实验对于验证靶点通路功能以及成分-枢纽基因调控关系至关重要。第三，多种红豆（RD）成分之间的协同作用及其 体内 药代动力学行为仍不明确。需要系统的实验工作来解析该中药的成分间相互作用及其代谢特征。本研究系统揭示了雷公藤（RD）通过多成分、多靶点、多通路调控网络治疗跟腱病（RCI）。RD可能通过TNF、PI3K-Akt、MAPK和HIF-1信号通路抑制炎症、减少肌腱细胞凋亡、促进血管生成以及增强细胞外基质修复，从而发挥治疗作用。这些发现为RD在跟腱病中的临床应用及作用机制研究提供了坚实的理论基础。
披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
作者感谢本研究所使用的公共生物信息学资源（包括 TCMSP、ETCM、SymMap、GeneCards、OMIM、STRING、UniProt、PubChem 和 RCSB‑PDB）的开发与维护人员。这些开放获取数据库提供了公开可用的数据集，支持了本研究中描述的计算分析。本研究未获得外部资金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AutoDock Vina | 斯克里普斯研究所 | V1.2.0 | 用于蛋白质-配体结合模拟的分子对接软件；RRID：不可用。网址：https://github.com/ccsb-scripps/AutoDock-Vina |
| clusterProfiler | Bioconductor | V3.2.14 | 用于GO和KEGG富集分析的R软件包；兼容R 4.0.3；RRID: SCR_016884。网址：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html |
| cytoHubba | 中国台湾大学（Cytoscape 插件） | V0.1 | 基于拓扑参数筛选枢纽基因的 Cytoscape 插件；RRID: SCR_006556。网址：https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba |
| Cytoscape | 系统生物学研究所 | V3.8.0 | 用于网络可视化与分析的软件； RRID: SCR_003032。网址：https://cytoscape.org/ |
| ETCM（传统中医药百科全书） | 中国中医科学院中药研究所 | V2.0 | 中医药成分、靶点与方剂 curated 数据库；RRID：不可用。网址：http://www.tcmip.cn/ETCM2/front/#/ |
| GeneCards | 魏茨曼科学研究所 | — | 整合型人类基因数据库，定期发布主要版本并进行增量更新；数据获取日期：2025-12-15；RRID：不可用。URL：https://www.genecards.org |
| Open Babel | Open Babel 开发团队 | — | 每日更新的基因-表型数据库，无全局发布版本；数据获取日期：2026-02-16；RRID：不可用。网址：https://omim.org |
| OMIM（在线人类孟德尔遗传数据库） | 约翰斯·霍普金斯大学 | — | 开源化学信息学工具包，用于分子文件格式转换；数据获取日期：2025-12-21；RRID：不可用。URL: https://openbabel.org/ |
| PubChem | 国家生物技术信息中心（NCBI） | — | 公共化学数据库，持续更新，无全球统一固定发布时间；化合物数据获取于2026-02-10；RRID：不可用。URL: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov |
| PyMOL | 施ödinger, LLC | V2.5 | 用于蛋白质-配体结构可视化与渲染的软件；RRID: SCR_000305。URL: https://pymol.org |
| R 软件 | R 统计计算基金会 | V4.0.3 | 统计计算与图形环境；RRID: SCR_001905。URL: https://cran.r-project.org |
| RCSB PDB | RCSB 蛋白质数据库 | — | 三维蛋白质结构公共数据库；每个PDB条目具有独立版本；结构文件获取于2026-02-03；RRID: SCR_012820。网址：https://www.rcsb.org |
| STRING | ELIXIR | V11.5 | 已知与预测蛋白质-蛋白质相互作用数据库；RRID: SCR_005223。URL: https://string-db.org |
| SymMap | 中国中医科学院 | V2.0 | 整合型数据库，关联中药、成分、靶点与症状；RRID：不可用。URL：http://www.symmap.org |
| TCMSP | 中国西北部 A&F 大学 | V2.3 | TCM 系统药理学数据库，包含成分、靶点及 ADME 性质；RRID：不可用。URL：https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php |
| UniProt | 欧洲生物信息研究所（EMBL-EBI） | — | 综合性蛋白质序列与注释数据库，定期发布并持续更新；数据获取日期：2025-12-12；RRID: SCR_002380。网址：https://www.uniprot.org |
| Venny | BioinfoGP，西班牙国家生物技术中心 | V2.0 | 用于生成维恩图及分析重叠基因集的网络工具；RRID: SCR_016561。网址：https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index2.0.2.html |
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