我们在欧洲同步辐射设施（ESRF）利用同步辐射X射线断层扫描技术，以0.7µm的像素分辨率无创地获取三维断层扫描数据集。通过体渲染软件，可在无需组织学切片的情况下，以自然状态重建内部结构，避免了由组织学切片所导致的人工假象。
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本文内容
摘要
摘要
关于许多体长小于1毫米的微型节肢动物的内部结构，目前所知甚少。造成这一状况的原因在于其体型微小且具有坚硬的外骨骼，使得传统的组织学方法难以应用。此外，组织切片会破坏样本，因此无法用于珍贵或稀有的材料。因此，人们期望有一种非破坏性的方法，能够在无需切片的情况下观察小型样本的内部结构。
我们在法国格勒诺布尔的欧洲同步辐射装置（ESRF）利用同步辐射X射线断层扫描技术，以0.7µm的像素分辨率无损地获取三维断层数据集。通过体渲染软件，我们能够在不产生组织学切片伪影的情况下，重建样品在自然状态下的内部结构。这些数据可用于定量形态学分析、标志点定位，或生成动画以可视化隐藏身体部位的结构，并追踪贯穿样品的完整器官系统或组织。
方案
本研究中使用的动物
孤雌生殖的甲螨 Archegozetes longisetosus（Acari，Oribatida）样本取自本实验室的培养物。该培养物在塑料罐中以石膏粉与木炭混合物（比例为9:1）作为基质，在恒定黑暗条件下，于20-23°C、相对湿度约90%的环境中培养。
样品制备
- 从培养物中取出样本，用细刷清洁后，置于由80%乙醇、35%甲醛和100%乙酸按6:3:1比例配制的混合液中固定24小时。
- 随后，样本依次经70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%的梯度乙醇系列脱水，每个浓度更换三次，每次间隔10分钟。
- 最后，将样本置于新鲜的100%乙醇中过夜，随后在CO2临界点干燥仪（CPD 020, Balzers）中进行临界点干燥。干燥后的样本固定于塑料针尖端（长1.2 cm，直径3.0 mm）。
同步辐射X射线断层扫描
X射线断层扫描在欧洲同步辐射装置（ESRF，法国格勒诺布尔，实验编号SC-2127）的ID19光束线上进行。
- 将样品安装在样品架上，并调整至光束的中心位置。
- 使用 20.5 keV 的能量对样品进行测量。投影图像由一台冷却 CCD 相机（ESRF FReLoN 相机）采集，该相机具有 14 位动态范围、2048×2048 像素，有效像素尺寸为 0.7 μm。在样品旋转 180° 范围内共采集 1500 个投影，每个投影的曝光时间为 0.35 s。探测器与样品之间的距离为 20 mm。
通过在样品与探测器之间设置特定距离，可实现对X射线衰减系数较低的材料进行相位衬度成像（Cloetens等，1996），而这类材料在吸收成像中（即样品紧贴探测器放置时）会产生不足的对比度。大多数生物样品属于相位物体，由吸收能力较弱和/或原子序数差异较小的材料组成（Betz等，2007）。然而，相位增强型断层扫描需要具有高度空间相干性的均匀X射线束。因此，相较于台式扫描仪，同步辐射光源更适用于此类测量。
数据分析
- 采用滤波反投影算法（Cloetens 等，1997）将获得的二维放射图像转换为三维体素数据（8 位灰度值）。
- 使用 VGStudio Max 1.2.1 软件（Volume Graphics，德国海德堡）对体素数据进行分析。
- 从直方图中去除背景的灰度值，以实现三维可视化。
- 采用预定义的相机路径生成旋转动画和动态裁剪平面。
- 生成自定义相机路径以追踪 A. longisetosus 的消化系统。
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讨论
在本研究中，我们重点关注了一种螯肢亚门微型节肢动物内部解剖结构的三维可视化。同步辐射X射线成像的像素分辨率可低至0.3µm，具体取决于样本尺寸。本文展示的数据像素分辨率为0.7µm。通常情况下，同步辐射X射线断层扫描技术适用于分析X射线衰减较低的小型生物材料（或组织）。该技术的像素分辨率几乎可达到传统光学显微镜的水平。该方法可应用于任何需要了解其内部结构且不能通过切片方式破坏的材料。然而，组织学切片的优势在于可对不同组织进行差异性染色，而X射线断层扫描则无法实现这一点。但在X射线断层图像中，不同的灰度值对应于具有不同X射线衰减特性的组织，且可通过定量相位断层成像技术（全息断层成像；Cloetens等，1999；Heethoff & Cloetens，2008）扩展灰度值分布。同步辐射X射线断层扫描技术之所以极为重要，主要基于以下原因：
- 样品制备简单，仅需固定和干燥，无需进行组织学切片
- 该方法为非侵入性：可在自然状态下观察样品的内部结构
- 所得数据集可按任意所需方向进行分析，不同于组织学切片只能固定于单一方向
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Paavo Bergmann、Michael Laumann和Sebastian Schmelzle在欧洲同步辐射设施（ESRF）提供的帮助。本工作由欧洲同步辐射设施项目SC-2127通过分配光束时间提供支持。
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参考文献
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
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