在体外分化的小鼠胚胎干细胞（MES）使用悬滴法

1. 涂胶T75烧瓶中，在37℃，5％的_CO 2组织培养箱培养过夜之一的前一天使用0.1％的明胶溶液和孵化板。
2. 取出孵化mES细​​胞，吸出培养基，用PBS冲洗胚胎干细胞培养，加入0.05％胰蛋白酶溶液大衣的菜（2 ml/100mm板）底部。
3. 孵育在37 ° C约1分钟，待细胞塌板。
   
4. 轻轻磨碎（吸管向上和向下）的4至6倍，以分散与巴斯德吸管插入的ES细胞的胰酶消化细胞，。分散的ES细胞转移到15毫升锥形离心管预热（37℃）MES中等。
   
5. 离心收集细胞。吸弃上清液，加入10毫升的MES培养基和吸管向上和向下，形成一个单细胞悬液。
   
6. 转移细胞悬液，在37 °成T75容量瓶中，用0.1％的明胶和孵化预涂C的_5％CO 2为一小时
   
   *一小时后，成纤维细胞附着到板材，但干细胞的培养基中保持。移液器中期收集干细胞。
   
   
7. 在5分钟1000转的旋转细胞和吸MES的介质。然后添加另一个MES分化培养基10毫升和重复吹打重悬细胞，直到出现被罚款的细胞悬浮液。
8. 计数与血球使用分化培养基中的细胞，干细胞悬液，以稀释浓度20ul（20ul/drop）的400至500个细胞，在无菌盆地。
9. 提起盖子，小心地倒置和地方菜含有10毫升的PBS上。使用多道移液器，20ul滴行的组织培养皿的盖子向上翻内表面上。
10. 2天，小心地在孵化器的菜。两天后，仔细地翻板盖，吸180 UL新鲜分化培养基放入96孔超低附件板以及数滴。然后用吸管和转让滴，一个接一个，96孔板皮卡下降。放入3天的孵化器不受干扰的板块。
    
11. 大衣，每孔48孔组织培养板，0.1％的明胶300ul。加入明胶后，板一夜之间在37 ° C提前一天之前转移的EBS。
    
12. 第二天，从48孔板吸明胶。然后分化培养基加入300 UL每口井。从96孔板的EBS转移到48以及明胶涂层板一。更改介质的第二天，然后改变中期隔日维持细胞。
    
13. 自发cardiaomyocyte收缩应在7天明显。

The disadvantages of hanging drop method are as follows: the liquid volume of a drop is limited to less than 50ul due to maintaining hanging drops on the lid by surface tension, and it’s impossible to change the medium for hanging drops. Observation of forming EBs in drops directly with microscopy is also very difficult during cultivation. Further more , the hanging drop method consists of two steps, therefore, a series of step of the hanging drop method may be troublesome.