在体外分化的小鼠胚胎干细胞（MES）使用悬滴法

摘要

本视频演示了如何在小鼠胚胎干细胞体外分化胚体采用悬滴法进行。

摘要

干细胞具有显着的潜力发展成许多不同的细胞类型。当一个干细胞分裂时，每个新细胞的潜力仍然是一个干细胞，或成为另一个类型的细胞与一个更专业的功能，这是有前途的科学顶尖科学家研究细胞疗法来治疗疾病的可能性。当没有暂停antidif​​ferentiation因素文化时，胚胎干细胞自发分化和形成立体的多细胞聚集。这些细胞聚集被称为胚体（EB）。悬滴文化是一种广泛使用的EB形成诱导方法。悬滴的圆形底部，使胚胎干细胞，它可以提供一个良好的环境，形成EBS mES细胞的聚集。在悬滴aggregatied的ES细胞的数量是可以控制的不同细胞的数量在最初的细胞悬液，将挂在培养皿的盖子下降。使用这种方法，我们可以再现的形式从同质分化的ES细胞的预定人数。

方案

1. 涂胶T75烧瓶中，在37℃，5％的_CO 2组织培养箱培养过夜之一的前一天使用0.1％的明胶溶液和孵化板。
2. 取出孵化mES细​​胞，吸出培养基，用PBS冲洗胚胎干细胞培养，加入0.05％胰蛋白酶溶液大衣的菜（2 ml/100mm板）底部。
3. 孵育在37 ° C约1分钟，待细胞塌板。
   
4. 轻轻磨碎（吸管向上和向下）的4至6倍，以分散与巴斯德吸管插入的ES细胞的胰酶消化细胞，。分散的ES细胞转移到15毫升锥形离心管预热（37℃）MES中等。
   
5. 离心收集细胞。吸弃上清液，加入10毫升的MES培养基和吸管向上和向下，形成一个单细胞悬液。
   
6. 转移细胞悬液，在37 °成T75容量瓶中，用0.1％的明胶和孵化预涂C的_5％CO 2为一小时
   
   *一小时后，成纤维细胞附着到板材，但干细胞的培养基中保持。移液器中期收集干细胞。
   
   
7. 在5分钟1000转的旋转细胞和吸MES的介质。然后添加另一个MES分化培养基10毫升和重复吹打重悬细胞，直到出现被罚款的细胞悬浮液。
8. 计数与血球使用分化培养基中的细胞，干细胞悬液，以稀释浓度20ul（20ul/drop）的400至500个细胞，在无菌盆地。
9. 提起盖子，小心地倒置和地方菜含有10毫升的PBS上。使用多道移液器，20ul滴行的组织培养皿的盖子向上翻内表面上。
10. 2天，小心地在孵....

讨论

悬滴法的缺点如下:不超过50ul，由于维持表面张力的盖子上悬滴一滴的液体的体积是有限的，它不可能改变中期挂滴。形成胚滴直接用显微镜观察也很难在种植。更进一步，悬滴法是由两个步骤组成，因此，悬滴法的一系列步骤可能会很麻烦。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11965-092
胎牛血清（FBS）	试剂	Hyclone	SH30070.03
L-谷氨酰胺	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	25030
非必需氨基酸	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11140-050
青霉素/链霉素	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	15140-122
丙酮酸钠	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11360-70
β巯基–乙醇	试剂	Chemicon International	ES-007-E
白血病抑制因子（LIF）	试剂	Chemicon International	LIF2005
96孔超低吸附板	工具	Corning	3474