本视频演示了如何利用悬滴法在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为类胚体。
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摘要
摘要
干细胞具有分化为多种不同类型细胞的显著潜力。当干细胞分裂时，每个新细胞都有可能保持干细胞特性，或转变为具有更特化功能的其他类型细胞。这一科学前景正促使研究人员探索基于细胞的疾病治疗策略。
在缺乏抗分化因子的悬浮培养条件下，胚胎干细胞会自发分化并形成三维多细胞聚集体，这些细胞聚集体被称为拟胚体（embryoid bodies, EB）。悬滴培养法是一种广泛使用的诱导EB形成的方法。悬滴的圆底结构有利于胚胎干细胞的聚集，可为小鼠胚胎干细胞（mES细胞）提供利于EB形成的良好环境。通过调整初始细胞悬液中细胞的数量，进而控制从培养皿盖上悬挂成滴的细胞数目，即可调控悬滴中聚集的胚胎干细胞数量。利用该方法，我们能够以预定数量的胚胎干细胞可重复地生成均一的拟胚体。
关键词：干细胞，胚胎干细胞，拟胚体，EB，悬滴培养，细胞分化，细胞聚集，mES细胞
方案
- 使用 0.1% 明胶溶液对 T75 培养瓶进行明胶化处理，并于前一天晚上将其置于 37°C、5% CO2 的组织培养箱中过夜孵育。
- 从培养箱中取出 mES 细胞，吸除培养基，用 PBS 清洗 ES 细胞培养物，加入 0.05% 胰蛋白酶溶液覆盖培养皿底部（2 ml/100 mm 培养皿）。
- 在 37°C 下孵育约 1 分钟，直至细胞开始从培养皿上脱落。
- 用带棉塞的巴斯德移液管轻轻吹打胰酶消化后的细胞 4 至 6 次，以分散 ES 细胞。将分散后的 ES 细胞转移至含有 预热（37°C）mES 培养基的 15 ml 圆锥形离心管中。
- 通过离心收集细胞，吸除上清液，加入 10 ml mES 培养基，并上下吹打形成单细胞悬液。
- 将细胞悬液转移至预先用 0.1% 明胶包被的 T75 培养瓶中，在 37°C、5% CO2 条件下孵育 1 小时
*1 小时后，成纤维细胞已贴附于培养瓶表面，而干细胞仍悬浮于培养基中。用移液器吸取培养基以收集干细胞。 - 以 1000 rpm 离心 5 分钟，吸除 mES 培养基。然后加入 10 ml mES 分化培养基，反复吹打重悬细胞，直至形成均匀的细小细胞悬液。
- 使用血细胞计数板计数细胞，并用分化培养基将干细胞悬液稀释至每 20 µl 含 400 至 500 个细胞的浓度（20 µl/滴），在无菌培养皿中进行操作。
- 打开培养皿盖，小心将其倒置并放置在含有 10 ml PBS 的培养皿上方。 使用多通道移液器，在组织培养皿盖内侧倒置的表面上逐行滴加 20 µl 的液滴。
- 小心将培养皿放入培养箱中孵育 2 天。两天后，小心翻转培养皿盖，吸除 180 µl 新鲜分化培养基，并将数滴细胞悬液转移至 96 孔超低吸附培养板的孔中。然后用移液器逐个拾取液滴并转移至 96 孔板中。将培养板放入培养箱中静置培养 3 天。
- 用 300 µl 0.1% 明胶溶液包被 48 孔组织培养板的每个孔。加入明胶后，于前一天晚上在 37°C 下过夜孵育，以备后续接种胚状体（EBs）。
- 次日，吸除 48 孔板中的明胶溶液，然后向每孔加入 300 µl 分化培养基。将 96 孔板中的胚状体（EBs）逐个转移至 48 孔明胶包被的培养板中。次日更换培养基，之后每隔一天更换一次培养基以维持细胞生长。
- 自发性心肌细胞收缩应在 7 天内明显可见。
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讨论
悬滴法的缺点如下：由于需要依靠表面张力使液滴悬挂在盖子上，液滴体积受限，通常小于50 µL；此外，无法对悬滴中的培养基进行更换。在培养过程中，直接通过显微镜观察液滴中拟胚体（EBs）的形成也非常困难。此外，悬滴法包含两个步骤，因此该方法的一系列操作可能较为繁琐。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11965-092 | |
| 胎牛血清（FBS） | 试剂 | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-谷氨酰胺 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 25030 | |
| 非必需氨基酸 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11140-050 | |
| 青霉素/链霉素 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15140-122 | |
| 丙酮酸钠 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11360-70 | |
| β巯基–乙醇 | 试剂 | Chemicon International | ES-007-E | |
| 白血病抑制因子（LIF） | 试剂 | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96孔超低吸附板 | 工具 | Corning | 3474 |
参考文献
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
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