用于结核病及耐多药结核病诊断的MODS方法

摘要

显微镜观察药物敏感性（MODS）检测是一种低成本、低技术门槛的高效结核病（TB）及耐多药结核病（MDRTB）检测工具。本视频介绍了MODS液体培养基培养方法。

摘要

活动性肺结核（TB）患者每年可传染10至15人，因此对活动性结核病的诊断对于治愈患者和防止新感染至关重要。此外，耐多药结核病（MDRTB）的出现意味着必须检测药物耐药性，以阻止耐药菌株的传播。显微观察药物敏感性（MODS）检测是一种低成本、低技术门槛但高性能的TB和MDRTB检测工具。MODS检测基于三个原理：1）结核分枝杆菌（MTB）在液体培养基中的生长速度快于固体培养基；2）与等待固体培养基上菌落的肉眼可见生长相比，可在液体培养基中更早通过显微镜观察到MTB的特征性生长，且该生长形态具有特异性，可将其与非典型分枝杆菌、真菌或细菌污染相区分；3）可将异烟肼和利福平两种药物加入MODS检测体系中，从而实现对MDRTB的同步直接检测，无需进行亚培养即可完成间接药物敏感性试验。目前现有的竞争性诊断方法存在诸多局限：痰涂片检测敏感性低；固体培养基培养诊断耗时长；现有液体培养方法成本过高；且检测MDRTB时需进行亚培养以完成间接药物敏感性试验。相比之下，非专利的MODS方法对TB和MDRTB具有高敏感性，是一种相对较快的培养方法，可同步提供MDRTB的药物敏感性检测结果，并且在资源有限的环境中每例TB和MDRTB检测成本不足3美元，具有良好的可及性。

方案

1. 配制储备液
   1. 磷酸盐缓冲液储备液
      1. 将950 ml 磷酸氢二钠溶液（9.47 g 磷酸氢二钠溶于1000 ml 蒸馏水中）与950 ml 磷酸二氢钾溶液（9.07 g 磷酸二氢钾溶于1000 ml 蒸馏水中）混合，搅拌；每种溶液各保留50 ml，以备必要时用于调节pH
      2. 调节pH至6.8 ± 0.2：加入磷酸氢二钠溶液以提高pH；加入磷酸二氢钾溶液以降低pH
      3. 在121–124°C下高压灭菌15分钟以达到灭菌效果
      4. 在培养皿中的营养琼脂培养基上接种100μl磷酸盐缓冲液样品，于37°C培养48小时，以确认无菌性
      5. 2-8°C 冰箱中保存，可存放长达一个月
         
         注意每个痰液样本需要10 ml磷酸盐缓冲液
         
   2. 去污储备液
      1. 将等体积的氢氧化钠溶液（8.0 g 氢氧化钠溶于 200 ml 无菌蒸馏水）与柠檬酸钠溶液（5.8 g 柠檬酸钠溶于 200 ml 无菌蒸馏水）混合
      2. 混合并在121–124°C下高压灭菌15分钟
      3. 2-8°C 冰箱中保存，可存放长达一个月
         
         注意每个痰液样本需要 2ml 去污染储备液
         
   3. 培养基储备液
      1. 向900 ml无菌蒸馏水中加入3.1 ml甘油、1.25 g酪蛋白胨和5.9 g 7H9培养基粉末；持续搅拌至完全溶解
      2. 121–124°C 下高压灭菌 15 分钟
      3. 将无菌培养基冷却后，分装至无菌的16×100 mm玻璃试管中，每管4.5 ml，用于样品制备；另分装每管10.8 ml，用于抗生素溶液和内对照的制备。
      4. 37°C 下孵育 48 小时以验证无菌性（无浑浊）
      5. 2-8°C下避光保存，瓶盖需拧紧，可保存一个月
         
         注意每个痰液样本需要一支含有4.5 ml 7H9培养基的试管
         
   4. 抗生素储备液
      1. A. 异烟肼储备液（8 mg/ml）
         1. 将20 mg异烟肼完全溶解于2.5 ml无菌蒸馏水中
         2. 使用0.2 μm针头滤器过滤水相溶剂
         3. 置于无菌微量离心管中，每管20μl，于-20°C保存，可存放长达6个月
            
            注意：每个储存的20μl等分试样足以用于多达100个样品（包括损耗）
            
      2. B. 利福平储备液（8 mg/ml）
      1. 将20 mg利福平完全溶解于1.25 ml DMSO中
      2. 加入1.25 ml无菌蒸馏水并混匀
      3. 使用有机溶剂专用的0.2 μm注射器滤器过滤
      4. 在无菌微量离心管中以20μl分装，于-20°C保存，可稳定存放长达6个月
         
         注意：每个储存的20μl等分试样足以用于多达100个样品（包括损耗）
         
2. 配制工作液
   1. 去污工作液
      1. 每20 ml所需去污溶液中溶解0.1 g NALC晶体
         
         注意每个样本需要 2ml 去污溶液
         
         注意：将未使用的 NaOH-NALC 去污染溶液在 24 小时后弃置，因为 NALC 的黏液溶解活性会随时间下降
         
   2. 培养基工作液
      1. 设置：
         1. 每个痰样本处理所需的一管7H9培养基，以及每块平板额外增加的一管（用于阴性对照孔）
         2. 用于阳性对照的2管7H9培养基（若使用单耐药菌株则为3管）
         3. 用于抗生素溶液配制的1-2管含10.8 ml 7H9培养基的试管
      2. 向每个样品管中的4.5 ml 7H9培养基加入0.5 ml OADC
      3. 向含有10.8 ml 7H9的试管中加入1.2 ml OADC
      4. 留出2管含5 ml 7H9-OADC的试管用于阳性对照，另准备1管或多管含12 ml 7H9-OADC的试管用于抗生素溶液配制（这些试管无需添加PANTA）
      5. 重悬PANTA，并向每个样本管及阴性对照管中加入0.1 ml（7H9-OADC-PANTA：总体积=5.1 ml）
         
         注意含PANTA的完全培养基7H9-OADC-PANTA用于痰液样本和阴性对照；阳性对照及抗生素溶液配制使用不含PANTA的7H9-OADC
         
   3. 抗生素工作溶液
      1. 1. 在未使用的24孔板中配制抗生素工作液的步骤见图1
         
         注意: 准确的药敏结果取决于最终的抗生素浓度。以下步骤适用于配备微量移液器的实验室。若无微量移液器，可使用结核菌素注射器，并采用 modsperu.org 网站用户指南附录3中所述的不同稀释系列。
         
         注意: 不要重新冷冻或重复使用抗生素工作液或储存液，以免药物活性丧失。 在处理当天结束时丢弃所有未使用的抗生素溶液 图1. 制备抗生素工作溶液（来自 modsperu.org 用户指南）
         
3. 痰液样本与平板制备
   1. 去污
      1. 将2 ml痰液样本加入15 ml离心管中（若不足2 ml，用磷酸盐缓冲液补足至2 ml；若超过2 ml，仅取2 ml使用）
      2. 加入2 ml NaOH-NALC溶液
      3. 盖紧管盖，涡旋振荡20秒；倒置试管，确保NaOH-NALC溶液接触试管内壁及管盖的整个内表面
      4. 静置至少15分钟——若样品黏度较高，可适当延长几分钟。为避免过度处理， 不应超过20分钟
      5. 用磷酸缓冲液（pH 6.8）将试管补至14 ml，以中和碱性并终止去污过程，轻轻翻转试管4次充分混匀
      6. 在3000 g下离心15分钟（有关达到3000 g所需的每分钟转数计算公式，请参见modsperu.org用户指南中的附录2）
      7. 小心地将上清液倒入含有10%次氯酸钠或其他合适消毒剂的液体废液容器中，并保留沉淀物
   2. 最终样品悬液的制备与备份
      1. 使用含 5.1 ml 的 7H9-OADC-PANTA 培养基，用巴斯德吸管将离心管中的样品沉淀重悬于总体积为 2 ml 的培养基中，充分混匀
      2. 移取1 ml样品悬液，置于微量离心管中，于2–8°C保存作为备份
      3. 将第二份1 ml样品悬液加入含有剩余7H9-OADC-PANTA的离心管中，充分混匀。此即为可用于涂布的最终样品溶液。
   3. 将样品悬液加入24孔板
      1. 将900μl最终样品悬液分别加入24孔板中一列的4个孔内
      2. 用额外的样本重复上述步骤，直至除第3列外的所有列均被填满（或所有样本均完成点样）
      3. 加入900μl 7H9-OADC培养基 无样本 每个样本板第3列的4个孔中（阴性内对照）
   4. 向样品中添加抗生素
      1. 使用多通道移液器，小心吸取7H9-OADC和抗生素工作溶液（抗生素稀释板第2列——见图1）中的液体，将4个吸头各填充100μl。
      2. 将100μl等分试样加入含900μl样品溶液的第1列孔中 不接触培养板或样品
      3. 重复上述步骤，直至所有孔均加入额外的100μl培养基（无药物孔）或抗生素溶液（包括作为阴性对照的第3列）
      4. 用盖子盖好培养板，放入可密封的聚乙烯（Ziplock）袋中并封口从此时起，袋子不再被打开)
      5. 在37°C（CO₂）条件下孵育₂ 富集不是必需的
4.  质量控制
   1. 每次实验均在每块板上设置阴性对照。  阴性对照列中任意孔出现任何生长迹象均表明存在交叉污染，因此必须弃用整块板，并对样本重新接种。
   2. 阳性对照在当天结束前于单独的培养板上进行.  一列中运行一种完全药物敏感菌株，另一列中运行一种对异烟肼和利福平耐药的菌株。  如果对使用耐多药（MDR）菌株存在顾虑，可用异烟肼（INH）单耐药菌株和利福平（RIF）单耐药菌株分别替代敏感菌株和MDR菌株进行实验。  所有阳性对照在无药物的孔中均应有生长，以证明培养基支持微生物生长。  为验证药物浓度的准确性，敏感菌株不应在异烟肼（INH）或利福平（RIF）孔中生长，而耐多药（MDR）菌株则应在INH和RIF孔中均能生长。
      
5. 酶标仪读数
   1. 以铺板当天为“第0天”，从第5天开始读板；若第5天结果为阴性，则每天（或根据工作量隔天）读板一次，持续至第14天，随后在第15至21天期间每2-3天读板一次。  使用10倍物镜在倒置光学显微镜下观察培养板
   2. A 阳性培养 是指存在两个或更多个菌落形成单位（>2 CFU）在不含药物的两个孔中。  早期分枝杆菌生长形态呈小型弯曲的逗号状或螺旋状（第5-9天）。  菌落形成通常会发展为“索状”或“缠结状”结构（参见 modsperu.org 的图像库）
   3. 在培养物于两个无药孔中呈阳性当天，应读取含药孔的结果。  药物存在下出现任何生长均表明对该药物具有耐药性。
      
      注意：如果对含药物的孔进行读数 >在无药物孔中观察到阳性培养1周后，此现象可能并不代表耐药性，因为偶尔会出现突破性生长
      
   4. 在第21天未呈阳性的样本被视为阴性培养物
   5. 孔内出现浑浊是由于污染菌过度生长所致，而分枝杆菌的生长不会引起浑浊
   6. 完成21天培养后，可弃置培养物。  培养物保持在密封袋中，放入高压灭菌袋后，在121-124°C下高压灭菌45-60分钟

 

讨论

MODS 检测主要针对资源有限的环境。  这是首次将结核分枝杆菌及耐多药结核分枝杆菌的快速液体培养检测能力引入资源有限地区，每个检测的成本不足 3 美元。  MODS 是一种非专有的、可迭代的方法，MODS 社区始终关注其他实验室所实现的改进。

人们普遍关注结核病液体培养基培养的生物安全性，因为液体可能发生溢出或形成气溶胶。  我们认为，与所有涉及间接药物敏感性试验的方法相比，MODS 检测具有更高的生物安全性，因为间接药物敏感性试验需要操作高浓度的分枝杆菌溶液，存在溢出和气溶胶产生的相关风险；而 MODS 仅需将痰标本接种到培养板中，随后将培养板密封于塑料袋内，此后不再打开。  韩国的数据（Kim 2007）支持这一观点，结果显示，仅进行痰标本接种但不进行药物敏感性试验的实验室工作人员，其职业暴露风险并不高于从事痰涂片显微镜检查的工作人员；相比之下，进行药物敏感性试验的人员患结核病的职业风险显著更高。

我们强烈建议，实验室工作人员在未采取适当防护措施的情况下，不得进行任何这些操作。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冰箱/冷冻柜	设备			用于储存预配制的培养基和抗生素储备液
涡旋振荡器	设备			辅助痰液去污染
离心机	设备			用于痰液浓缩；可达到3000 g；d–s无需制冷，但必须具备生物安全性能（桶可密封）
恒温培养箱（37°C）	设备			用于培养；无需CO₂富集环境
倒置光学显微镜	显微镜			用于读取MODS培养板
高压灭菌器	设备			用于灭菌培养基、PBS及使用过的培养板
天平	设备			用于称量异烟肼、利福平和NALC
Middlebrook 7H9培养基（Difco）	试剂	Fisher Scientific	DF0713-17-9	500克/瓶；培养基基础成分
酪蛋白胰酶消化物（Casitone）	试剂	Fisher Scientific	DF0259‐17‐9	500克/瓶；培养基基础成分
甘油（甘油）冻干品	试剂	Sigma-Aldrich	G‐33‐500	500毫升/瓶；培养基基础成分
PANTA（抗生素混合物，冻干，BD）	试剂	Fisher Scientific	B4345114	6瓶/包；抗生素培养基补充剂
OADC（Middlebrook OADC营养补充剂，BD）	试剂	Fisher Scientific	B11886	10 × 20毫升/包；营养培养基补充剂
二甲基亚砜（Hibri-Max）	试剂	Sigma-Aldrich	D-2650	100毫升/瓶；用于配制利福平储备液
抗生素储备液：异烟肼	试剂	Sigma-Aldrich	I-3377	50克/瓶；直接药敏试验
抗生素储备液：利福平	试剂	Sigma-Aldrich	R-3501	1克/瓶；直接药敏试验
氢氧化钠（颗粒）	试剂	Sigma-Aldrich	221465	500克/瓶；用于痰液去污染
柠檬酸钠（三钠盐二水合物）	试剂	Sigma-Aldrich	S-4641	500克/瓶；用于痰液去污染
N-乙酰-L-半胱氨酸	试剂	Sigma-Aldrich	A-7250	50克/瓶；用于痰液去污染
磷酸二氢钾晶体，KH₂PO₄	试剂	Sigma-Aldrich	P0662	500克/瓶；用于痰液去污染
磷酸氢二钠，无水，Na₂HPO₄	试剂	Sigma-Aldrich	S0876	500克/瓶；用于痰液去污染
次氯酸钠	试剂	家用漂白剂		用于处理污染性废弃物
15毫升离心管（聚丙烯，15毫升 Falcon 35‐2096）	耗材	Fisher Scientific	14‐959‐49B	500个/箱；用于痰液去污染和浓缩
24孔板（组织培养板，24孔，BD Falcon 35‐3047）	耗材	Fisher Scientific	08-772-1	50块/箱；用于培养和观察
可密封聚乙烯袋，6 × 6 “（自封袋）	耗材			用于生物安全，容纳24孔板
带盖玻璃管（16 × 100毫米 和 18 × 145毫米）	耗材	VWR international	47729-583	500支/箱；用于储存分装的培养基
螺口微量离心管（1.5毫升）	耗材	Fisher Scientific	05‐669‐22	1000个/箱；用于储存分装的抗生素储备液
0.22μm 滤膜（适用于水溶液）注射器滤器 Millex 蓝色	耗材	Fisher Scientific	SLGL 025 OS	50个/箱；用于过滤抗生素储备液
0.22μm 滤膜（适用于有机溶剂）注射器滤器 Millex 黄色	耗材	Fisher Scientific	SLGV 033 RS	50个/箱；用于过滤抗生素储备液
一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃，9″	耗材	Fisher Scientific	13‐678‐20C	720支/箱；用于混合PANTA与培养基混合液
气溶胶阻隔吸头，1000‐1300μl	耗材	Fisher Scientific	02‐707‐51	1000个/包；用于将培养基分配至培养板
USA Scientific 吸头 One 1‐200μl 黄色吸头	耗材	Fisher Scientific	1111‐0006	1000个/袋；用于稀释抗生素储备液