方法文章

用于结核病及耐多药结核病诊断的MODS方法

DOI：

10.3791/845

⸱

2008年8月11日

 ,  ,  , 
1The Warren Alpert Medical School of Brown University, 2Laboratorio de Investigacion de Enfermedades Infecciosas, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 3Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 4Wellcome Trust Centre for Clinical Tropical Medicine, Imperial College London

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

显微镜观察药物敏感性（MODS）检测是一种低成本、低技术门槛的高效结核病（TB）及耐多药结核病（MDRTB）检测工具。本视频介绍了MODS液体培养基培养方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
活动性肺结核（TB）患者每年可传染10至15人，因此对活动性结核病的诊断对于治愈患者和防止新感染至关重要。此外，耐多药结核病（MDRTB）的出现意味着必须检测药物耐药性，以阻止耐药菌株的传播。显微观察药物敏感性（MODS）检测是一种低成本、低技术门槛但高性能的TB和MDRTB检测工具。MODS检测基于三个原理：1）结核分枝杆菌（MTB）在液体培养基中的生长速度快于固体培养基；2）与等待固体培养基上菌落的肉眼可见生长相比，可在液体培养基中更早通过显微镜观察到MTB的特征性生长，且该生长形态具有特异性，可将其与非典型分枝杆菌、真菌或细菌污染相区分；3）可将异烟肼和利福平两种药物加入MODS检测体系中，从而实现对MDRTB的同步直接检测，无需进行亚培养即可完成间接药物敏感性试验。目前现有的竞争性诊断方法存在诸多局限：痰涂片检测敏感性低；固体培养基培养诊断耗时长；现有液体培养方法成本过高；且检测MDRTB时需进行亚培养以完成间接药物敏感性试验。相比之下，非专利的MODS方法对TB和MDRTB具有高敏感性，是一种相对较快的培养方法，可同步提供MDRTB的药物敏感性检测结果，并且在资源有限的环境中每例TB和MDRTB检测成本不足3美元，具有良好的可及性。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. 配制储备液
    1. 磷酸盐缓冲液储备液
      1. 将950 ml 磷酸氢二钠溶液（9.47 g 磷酸氢二钠溶于1000 ml 蒸馏水中）与950 ml 磷酸二氢钾溶液（9.07 g 磷酸二氢钾溶于1000 ml 蒸馏水中）混合，搅拌；每种溶液各保留50 ml，以备必要时用于调节pH
      2. 调节pH至6.8 ± 0.2：加入磷酸氢二钠溶液以提高pH；加入磷酸二氢钾溶液以降低pH
      3. 在121–124°C下高压灭菌15分钟以达到灭菌效果
      4. 在培养皿中的营养琼脂培养基上接种100μl磷酸盐缓冲液样品，于37°C培养48小时，以确认无菌性
      5. 2-8°C 冰箱中保存，可存放长达一个月

        注意每个痰液样本需要10 ml磷酸盐缓冲液
    2. 去污储备液
      1. 将等体积的氢氧化钠溶液（8.0 g 氢氧化钠溶于 200 ml 无菌蒸馏水）与柠檬酸钠溶液（5.8 g 柠檬酸钠溶于 200 ml 无菌蒸馏水）混合
      2. 混合并在121–124°C下高压灭菌15分钟
      3. 2-8°C 冰箱中保存，可存放长达一个月

        注意每个痰液样本需要 2ml 去污染储备液
    3. 培养基储备液
      1. 向900 ....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MODS 检测主要针对资源有限的环境。  这是首次将结核分枝杆菌及耐多药结核分枝杆菌的快速液体培养检测能力引入资源有限地区，每个检测的成本不足 3 美元。  MODS 是一种非专有的、可迭代的方法，MODS 社区始终关注其他实验室所实现的改进。

人们普遍关注结核病液体培养基培养的生物安全性，因为液体可能发生溢出或形成气溶胶。  我们认为，与所有涉及间接药物敏感性试验的方法相比，MODS 检测具有更高的生物安全性，因为间接药物敏感性试验需要操作高浓度的分枝杆菌溶液，存在溢出和气溶胶产生的相关风险；而 MODS 仅需将痰标本接种到培养板中，随后将培养板密封于塑料袋内，此后不再打开。  韩国的数据（Kim 2007）支持这一观点，结果显示，仅进行痰标本接种但不进行药物敏感性试验的实验室工作人员，其职业暴露风险并不高于从事痰涂片显微镜检查的工作人员；相比之下，进行药物敏感性试验的人员患结核病的职业风险显著更高。

我们强烈建议，实验室工作人员在未采取适当防护措施的情况下，不得进行任何这些操作。.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Sean Fitzwater 和 Carmen Giannina Luna Colombo 提供结核病生长延时视频片段。  感谢 Marty Roper 在编辑和共同撰写用户指南过程中提供的全面而出色的反馈意见，本实验方案主要直接取自该用户指南。  本视频的制作由美国国立卫生研究院（NIH）/福格蒂国际中心（Fogarty International Center）资助，网址为 http://www.fic.nih.gov/。David A.J. Moore 以惠康信托（Wellcome Trust）热带医学临床研究员及伦敦帝国理工学院传染病学 Reader 的身份做出贡献（资助编号：078067/Z/05）。  Mark F. Brady 以 NIH/福格蒂国际中心研究学者的身份做出贡献。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冰箱/冷冻柜设备用于储存预配制的培养基和抗生素储备液
涡旋振荡器设备辅助痰液去污染
离心机设备用于痰液浓缩；可达到3000 g；d–s无需制冷，但必须具备生物安全性能（桶可密封）
恒温培养箱（37°C）设备用于培养；无需CO₂富集环境
倒置光学显微镜显微镜用于读取MODS培养板
高压灭菌器设备用于灭菌培养基、PBS及使用过的培养板
天平设备用于称量异烟肼、利福平和NALC
Middlebrook 7H9培养基（Difco）试剂Fisher ScientificDF0713-17-9500克/瓶；培养基基础成分
酪蛋白胰酶消化物（Casitone）试剂Fisher ScientificDF0259‐17‐9500克/瓶；培养基基础成分
甘油（甘油）冻干品试剂Sigma-AldrichG‐33‐500500毫升/瓶；培养基基础成分
PANTA（抗生素混合物，冻干，BD）试剂Fisher ScientificB43451146瓶/包；抗生素培养基补充剂
OADC（Middlebrook OADC营养补充剂，BD）试剂Fisher ScientificB1188610 × 20毫升/包；营养培养基补充剂
二甲基亚砜（Hibri-Max）试剂Sigma-AldrichD-2650100毫升/瓶；用于配制利福平储备液
抗生素储备液：异烟肼试剂Sigma-AldrichI-337750克/瓶；直接药敏试验
抗生素储备液：利福平试剂Sigma-AldrichR-35011克/瓶；直接药敏试验
氢氧化钠（颗粒）试剂Sigma-Aldrich221465500克/瓶；用于痰液去污染
柠檬酸钠（三钠盐二水合物）试剂Sigma-AldrichS-4641500克/瓶；用于痰液去污染
N-乙酰-L-半胱氨酸试剂Sigma-AldrichA-725050克/瓶；用于痰液去污染
磷酸二氢钾晶体，KH₂PO₄试剂Sigma-AldrichP0662500克/瓶；用于痰液去污染
磷酸氢二钠，无水，Na₂HPO₄试剂Sigma-AldrichS0876500克/瓶；用于痰液去污染
次氯酸钠试剂家用漂白剂用于处理污染性废弃物
15毫升离心管（聚丙烯，15毫升 Falcon 35‐2096）耗材Fisher Scientific14‐959‐49B500个/箱；用于痰液去污染和浓缩
24孔板（组织培养板，24孔，BD Falcon 35‐3047）耗材Fisher Scientific08-772-150块/箱；用于培养和观察
可密封聚乙烯袋，6 × 6 “（自封袋）耗材用于生物安全，容纳24孔板
带盖玻璃管（16 × 100毫米 和 18 × 145毫米）耗材VWR international47729-583500支/箱；用于储存分装的培养基
螺口微量离心管（1.5毫升）耗材Fisher Scientific05‐669‐221000个/箱；用于储存分装的抗生素储备液
0.22μm 滤膜（适用于水溶液）注射器滤器 Millex 蓝色耗材Fisher ScientificSLGL 025 OS50个/箱；用于过滤抗生素储备液
0.22μm 滤膜（适用于有机溶剂）注射器滤器 Millex 黄色耗材Fisher ScientificSLGV 033 RS50个/箱；用于过滤抗生素储备液
一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃，9″耗材Fisher Scientific13‐678‐20C720支/箱；用于混合PANTA与培养基混合液
气溶胶阻隔吸头，1000‐1300μl耗材Fisher Scientific02‐707‐511000个/包；用于将培养基分配至培养板
USA Scientific 吸头 One 1‐200μl 黄色吸头耗材Fisher Scientific1111‐00061000个/袋；用于稀释抗生素储备液

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arias, M. Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis. Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).
  2. Caviedes, L.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

MODS

相关文章