本文中，我们演示了如何从三龄黑腹果蝇幼虫中解剖出中枢神经系统。
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本文内容
摘要
摘要
果蝇幼虫的中枢神经系统（CNS）结构复杂且尚未被充分理解。研究CNS的一种方法是利用免疫组织化学技术检测多种新蛋白和标记蛋白的表达。对完整幼虫进行染色并不现实，因为坚硬的角质层会阻碍抗体进入体腔。为了对这些组织进行染色，必须在固定和染色前对幼虫进行解剖。本文演示了如何在不损伤中枢神经系统的情况下解剖果蝇幼虫。首先用一对精细镊子将幼虫撕成两半，然后将角质层“翻转”以暴露中枢神经系统。若操作细致，中枢神经系统将保持附着于角质层上。我们通常在固定和染色过程中始终使中枢神经系统附着于角质层，仅在将样本置于玻片上进行封片前才将其完全分离。我们还展示了一些代表性图像，显示了用Eve（一种在中枢神经系统部分神经元中表达的转录因子）染色的幼虫中枢神经系统。文章最后讨论了该技术的一些实际应用以及可能遇到的潜在困难。
关键词：果蝇幼虫，中枢神经系统，免疫组织化学，解剖，Eve，转录因子
方案
- 解剖 3rd 二龄幼虫，保留中枢神经系统与表皮相连。置于1.5 ml离心管中。
- 在含2%甲醛的PBS（1x）中固定，摇床上孵育40分钟；每5-10个解剖获得的中枢神经系统组织使用250 μl固定液。
- 去除甲醛，并用含0.1% Triton X-100的PBS（PBST）短暂清洗3次。使用拉细的巴斯德移液管以避免组织丢失。
- 在4°C下，将组织置于含5% BSA的PBST中孵育1–8小时，同时轻轻振荡，以阻断非特异性蛋白结合位点并通透细胞膜。
- 在含5% BSA的PBST中稀释一抗，4°C摇床孵育过夜。不同一抗的最佳稀释比例可能有所不同。
- 用PBST洗涤3次，随后在4°C下洗涤两次，每次30分钟。
- 在含5% BSA的PBST中稀释二抗，4°C摇床孵育1–3小时。用PBST漂洗3次，随后在4°C下用PBST洗涤两次，每次30分钟。若二抗偶联物对光敏感，需用铝箔包裹管子。
- 如有需要，进一步解剖组织并置于载玻片上。
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讨论
本视频展示了如何从三龄黑腹果蝇幼虫中解剖中枢神经系统。解剖完成后，可采用标准免疫组织化学方案对中枢神经系统进行染色。目前，关于成体神经系统如何发育形成，以及如何储存和传递信息，仍有许多未知之处。对发育中黑腹果蝇幼虫中枢神经系统的研究，将有助于增进我们对神经系统连接方式与功能的理解。
果蝇幼虫表现出多种刻板行为，例如对环境线索的反应。这些行为是如何在神经系统中被学习和储存的？对幼虫发育期间神经系统的研究所将有助于回答这一问题。
在此阶段的黑腹果蝇发育过程中，生物体正准备经历化蛹期间发生的巨大形态学变化。在此期间，随着生物体从爬行的幼虫转变为成虫，神经肌肉系统会发生大规模的重塑。确定神经元在此发育阶段如何变化，以及在更高等动物的神经元中是否能观察到相同类型的行为，将十分有意义。
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作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 镊子 | 尖头 | |||
| 9孔培养皿 | ||||
| 塑料培养皿 |
参考文献
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13, 507-523 (1994).
- Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S.
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