西格玛非特异性蛋白酶活性测定——以酪蛋白为底物

摘要

蛋白酶可断裂肽键。在实验室中，通常需要测定和/或比较蛋白酶的活性。Sigma 的非特异性蛋白酶活性检测法可作为标准化流程用于测定蛋白酶的活性。

摘要

蛋白酶可断裂肽键。在实验室中，通常需要测定和/或比较蛋白酶的活性。Sigma 的非特异性蛋白酶活性检测法可作为标准化流程用于测定蛋白酶活性，这也是我们在质量控制过程中所采用的方法。在此检测中，酪蛋白作为底物。当待测蛋白酶消化酪蛋白时，酪氨酸及其他氨基酸和肽片段被释放出来。福林-酚试剂（Folin and Ciocalteu's Phenol，即福林试剂）主要与游离的酪氨酸反应，生成蓝色的显色物，该显色物可通过分光光度计测定其吸光度值进行定量。从酪蛋白中释放出的酪氨酸越多，生成的显色物越多，表明蛋白酶的活性越强。由蛋白酶活性产生的吸光度值需与标准曲线进行比较，该标准曲线是通过将已知量的酪氨酸与福林-酚试剂反应，以关联吸光度变化与酪氨酸微摩尔数量的关系而建立的。通过标准曲线，可确定蛋白酶样品的活性，以“单位”（Units）表示，即每分钟从酪蛋白中释放的酪氨酸当量的微摩尔数。

如需查看本文的中文版本，请点击此处

方案

在开始实验之前，我们需要确保以下试剂已正确配制：

1. 50 mM 磷酸钾缓冲液，pH 7.5。使用11.4 mg/ml的磷酸氢二钾三水合物溶于纯水中，并用1M HCl调节pH值。使用前将该溶液置于37°C环境中。
2. 0.65% 质量/体积的酪蛋白溶液，通过将6.5 mg/ml酪蛋白加入50 mM磷酸钾缓冲液中制备。在温和搅拌下逐步升温至80–85 °C，持续约10分钟，直至形成均匀分散体系。切勿将溶液煮沸。如有必要，用NaOH或HCl调节pH值。
3. 110 mM 三氯乙酸溶液，通过将6.1N的储备液用纯水按1:55稀释制备。三氯乙酸为强酸，操作时应小心谨慎。
4. 0.5 mM Folin & Ciocalteu's试剂（又称Folin酚试剂），该试剂将与酪氨酸反应产生可测量的颜色变化，颜色变化程度与蛋白酶活性直接相关。Folin酚试剂具有酸性，操作时应小心。
5. 500 mM 碳酸钠溶液，使用53 mg/ml无水碳酸钠溶于纯水中制备。
   酶稀释液，由10 mM醋酸钠缓冲液含5 mM醋酸钙组成，pH 7.5，预热至37°C。该溶液用于溶解固态蛋白酶样品或稀释酶溶液。
6. 1.1 mM L-酪氨酸标准储备液。使用0.2 mg/ml L-酪氨酸溶于纯水中，轻轻加热至酪氨酸完全溶解。与酪蛋白溶液类似，切勿煮沸。让L-酪氨酸标准溶液冷却至室温。该溶液后续将被进一步稀释以制作标准曲线。
7. 蛋白酶溶液。使用前立即用第6步制备的酶稀释液溶解蛋白酶。

如有必要，使用已知活性的固体蛋白酶样品，用酶稀释液溶解至0.1–0.2 单位/毫升。该溶液作为质量控制实验的阳性对照，并用于验证我们将进行的酶活性测定计算。

建立蛋白酶活性测定及标准曲线

1. 开始本实验时，选择可容纳约 15 ml 的合适试管。每种待测酶需要 4 支试管：其中 1 支作为空白对照，其余 3 支用于检测蛋白酶三种稀释度的活性。采用三种稀释度有助于在最终计算时相互验证结果。
   1. 向每组四支试管中加入 5 ml 的 0.65% 酪蛋白溶液，并在 37°C 水浴中平衡约 5 分钟。
   2. 向三支测试样品管中分别加入不同体积的待测酶溶液（空白管不加），轻轻旋转混匀后，准确在 37°C 下孵育 10 分钟。本实验所测定并比较的指标，即为孵育期间蛋白酶活性及其导致的酪氨酸释放量。
2. 孵育 10 分钟后，向每支试管中加入 5 ml 三氯乙酸（TCA）试剂以终止反应。随后，向每支试管（包括空白管）中加入适量酶溶液，使各管中酶溶液的最终体积均为 1 ml。此步骤旨在校正酶自身对吸光度的影响，并确保各管总体积一致。将溶液在 37°C 下继续孵育 30 分钟。
   
   
   在此 30 分钟孵育期间，可同时配制酪氨酸标准品稀释液。使用可容纳 8 ml 的 6 dram 试管（也可用聚丙烯离心管替代）。向六支试管中分别加入 1.1 mM 酪氨酸标准储备液，体积（ml）依次为：0.05、0.10、0.20、0.40、0.50；空白管中不加酪氨酸标准品。对于颜色变化较小的不纯测试样品，可能需要更低浓度的标准品。加入酪氨酸标准溶液后，向各标准管中加入适量纯化水，使总体积达到 2 ml。
3. 30 分钟孵育结束后，使用 0.45 µm 聚醚砜（PES）注射器滤膜对各测试溶液及空白样品进行过滤，以去除样品中不溶性物质。
   1. 将过滤后的测试样品和空白滤液各取 2 ml，加入可容纳至少 8 ml 的 4 dram 试管中。该类试管与配制标准品所用者相同。
   2. 向所有含标准品及标准空白的试管中加入 5 ml 碳酸钠溶液。为获得最佳结果，应立即加入 1 ml 福林试剂（Folin's reagent）。
   3. 加入碳酸钠以调节因添加福林试剂所引起的 pH 下降。
   4. 向测试样品及测试空白管中加入碳酸钠溶液，加入后溶液会变浑浊。随后加入福林试剂，该试剂主要与游离酪氨酸发生反应。
   5. 轻轻旋转混匀 dram 试管，并在 37°C 下孵育 30 分钟。
   孵育结束后，应可观察到标准品管的颜色呈梯度变化，与所加酪氨酸量相对应，酪氨酸浓度越高颜色越深。测试样品管中也可观察到明显的颜色变化。取 2 ml 上述溶液，用 0.45 µm 聚醚砜注射器滤膜过滤至合适的比色皿中。至此，实验步骤已完成， 可进行分光光度计测定以记录吸光度值。

测定吸光度并计算酶活性

1. 使用分光光度计在660 nm波长下测定各样品的吸光度，光程设置为1 cm。记录各标准品、标准空白、不同测试样品及测试空白的吸光度值。待所有数据收集完毕后，可绘制标准曲线。为生成该曲线，需计算标准品与标准空白之间的吸光度差值，此差值对应于标准溶液中酪氨酸含量所引起的吸光度。完成该简单计算后，使用绘图软件绘制标准曲线：以5个标准品中每个的微摩尔数（μmol）为X轴，以其对应的吸光度变化值为Y轴进行作图。
   
   

   酪氨酸标准品体积	酪氨酸微摩尔
   0.05	0.055
   0.10	0.111
   0.20	0.221
   0.40	0.442
   0.50	0.553

2. 输入数据点后，生成最佳拟合直线及其对应的斜率方程。
   
   
   通过计算待测样品吸光度与试剂空白吸光度之间的差值，确定待测样品的吸光度变化。将其中一个待测样品的吸光度值代入斜率方程并求解，可得到该特定蛋白水解反应中释放的酪氨酸微摩尔数。为获得以单位每毫升（U/mL）表示的酶活性，请进行如下计算：
   
   
   （释放的酪氨酸当量，单位：μmol）×（11）
   酶的单位/毫升 = __________________________________________
   
   (1) × (10) × (2)
   
   
   11= 检测反应总体积（单位：毫升）
   10= 根据单位定义的检测时间（单位：分钟）
   1= 所用酶的体积（单位：毫升）
   2= 比色测定中使用的体积（单位：毫升）
   
   
   取由斜率方程得到的释放的酪氨酸当量微摩尔数，乘以测定反应的总体积（单位为毫升），本实验中为11毫升。将该值除以三个参数：测定反应时间（本实验为10分钟）、测定中使用的酶液体积（该体积可变，此处以1毫升为例）以及比色检测所用的体积（根据比色皿不同可能有所差异，本实验使用2毫升）。
3. 微摩尔酪氨酸除以时间（分钟）得到蛋白酶活性的测量值，称为“单位”。我们可以约去分子和分母中的体积单位，得到以单位/毫升（units/ml）表示的酶活性。为了确定溶解于酶稀释液中的固体蛋白酶样品的活性，我们将单位/毫升（units/ml）的活性值除以该测定中最初使用的固体浓度（毫克/毫升，mg/ml），最终得到以单位/毫克（units/mg）表示的活性。
   
   
   酶单位/毫升
   单位/毫克固体 = _____________________
   
   毫克固体/毫升酶
   
   

讨论

我们刚刚向您展示了如何使用Sigma的通用蛋白酶活性检测方法来分析蛋白酶活性。此外，该检测方法还可用于确保您收到的蛋白酶在用于实验前具有精确测定的活性。如您所见，在进行此操作时，至关重要的是要记住缓慢加热酪蛋白和酪氨酸溶液，切勿将其煮沸。同时，必须为标准品以及每个待测样品分别配制不同的空白对照。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶	Sigma-Aldrich	P4630
磷酸氢二钾三水合物	Sigma-Aldrich	P5504
酪蛋白	Sigma-Aldrich	C7078
三氯乙酸	Sigma-Aldrich	T0699
Folin & Ciocalteu 酚试剂	Sigma-Aldrich	F9252
无水碳酸钠	Sigma-Aldrich	S2127
乙酸钠三水合物	Sigma-Aldrich	S8625
乙酸钙	Sigma-Aldrich	C1000
L-酪氨酸，游离碱基	Sigma-Aldrich	T3754
蛋白酶谱分析试剂盒	Sigma-Aldrich	PP0500
蛋白酶荧光检测试剂盒	Sigma-Aldrich	PF0100