本实验旨在介绍如何对非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞进行膜片钳记录，内容包括卵黄膜的去除、吉欧姆级封接（gigaseal）的形成，以及可选地将膜片转换为外翻式构型（outside-out topology）。
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本文内容
摘要
摘要
自Sakmann和Neher建立该技术以来1, 2，膜片钳技术已成为细胞中单个或多个离子通道电生理测量的一种极为有用的方法。该技术既可用于研究离子通道在其天然环境中的功能，也可用于研究在异源表达系统（例如从非洲爪蟾Xenopus laevis中获取的卵母细胞）中表达的离子通道。本文中，我们描述了在Xenopus卵母细胞上进行膜片钳记录的成熟技术。该技术可用于测量表达的离子通道的特性，无论是以群体形式（大斑片记录）还是单个通道形式（单通道记录）。我们重点介绍如何优化卵母细胞制备和封接形成质量的技术。在所有因素均优化的情况下，该技术成功形成封接的概率超过90%。每位研究人员可根据自身认为最重要的因素对实验流程进行不同的优化，本文介绍的是我们在实践中取得最佳效果的方法。
方案
第1部分：去除卵黄膜
- 准备两把镊子。我们推荐使用5号镊子，其中一把需用锉刀稍作 sharpen（修锐）。同时，通过剪切并火焰抛光一支7英寸巴斯德吸管，制备一支玻璃转移移液管。
- 建议： 为防止卵母细胞滑动，可剪裁一片网格（1 mm方格）并粘贴于60 mm培养皿底部。若每次使用后保持清洁，该培养皿可无限次重复使用。
- 向培养皿中加入约一半体积的高渗溶液（见配方），并将培养皿置于解剖显微镜下。
- 用经抛光的巴斯德吸管从孵育液中取出1–3个非洲爪蟾卵母细胞，并转移至培养皿中。
- 等待15秒至2分钟，使细胞开始皱缩。等待时间较长时，细胞更易于剥离；时间较短则有助于获得更适合封接的健康细胞。
- 随着细胞皱缩，卵黄膜将逐渐显现为覆盖在细胞表面的一层透明薄膜。选择一个无漩涡状结构或缺陷的健康细胞进行剥离操作。
- 用一把镊子轻轻夹住卵黄膜，注意不要损伤细胞质膜；用另一把镊子夹住相近位置，轻柔地将透明膜撕开并从细胞上完全分离。
- 使用巴斯德吸管小心地将细胞转移至记录槽中。请注意，去除卵黄膜后的细胞较为脆弱。
第二部分：吉密封形成
- 用生理盐水填充记录电极。使用能与电极丝良好接触的最小体积溶液，以尽量减少电极电容。
- 多次轻弹电极，使气泡上浮并滑向电极丝。
对已填充的电极施加压力。可通过口吸或使用宠物店购买的水族泵实现。该压力至关重要，可确保电极在穿过液面并移向细胞时保持清洁。 - 在记录室中找到卵母细胞，并清晰聚焦于细胞边缘。
- 在电极未进入浴液的情况下，将（失焦的）尖端置于细胞正上方居中。这可最大限度缩短在浴液中移动至形成封接前的时间。
- 将电极缓慢下移至细胞旁并调至清晰聚焦位置，使其靠近细胞（约50微米）。此时应可见由背压推动从电极尖端排出的溶液产生轻微扰动。
- 使用膜片钳软件检测电极电阻（目标值约为3–4 MΩ），并通过电压偏移将电流归零。
- 在电极施加正压的同时，缓慢将尖端移向细胞，并通过视觉或音频监测器（其发出音调频率与电阻成正比）监控电阻变化。当电极尖端开始接触细胞时，电阻将上升。
- 迅速但轻柔地从正压切换为绝对值相近的负压。电阻应进一步上升，直至形成封接。
- 大多数情况下，封接在数秒内形成；偶尔需要30–60秒。
- 当电阻达到1 GΩ时，可将压力释放至中性。此时已形成细胞附着式膜片。若要形成内面向外膜片，需快速将电极拉离细胞；外面向外膜片操作见下文。
第5部分：外翻式构型（可选）
- 形成吉欧姆密封后，立即破裂细胞膜。可通过短暂施加负压实现，但我们更倾向于使用 1 V 脉冲持续 1 ms。此时电阻应下降至略高于初始电极电阻的水平。
- 缓慢而平稳地将电极从细胞上移开。应可见部分细胞膜随电极被拉出。随后在数秒内，细胞膜会突然回缩，同时电阻立即恢复至吉欧姆（GΩ）级别。
- 此时已形成外向式膜片（outside-out configuration）。任何包含在内的离子通道的胞外结构域均暴露于灌流液环境中。
第6部分：预期结果
通常，电阻更高的封接更理想，且持续时间更长。10 GΩ 是高质量封接的一个良好参考标准。根据我们的经验，获得此类质量封接的概率受多种因素影响，尤其是细胞和移液管的质量。在细胞状态良好、移液管洁净且操作者经验丰富的条件下，封接成功率可超过 95%。此类封接可持续数分钟，适用于对非洲爪蟾卵母细胞中表达的离子通道进行的各种电生理学研究，包括单通道记录。
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讨论
此处未讨论电生理记录的许多参数。良好的实验结果还依赖于仪器设置、系统噪声管理、通道表达以及记录方案等因素。
根据我们的经验，形成可靠封接最关键的参数包括：高质量的卵母细胞、快速去除卵黄膜（即“剥膜”）、使用新拉制并防尘保护的移液管、表面光滑的移液管、进入浴液时施加正压、在封接前于浴液中停留时间宜短。需要指出的是，不同实验者的经验差异较大，其他人可能有各自认为最重要的因素组合。
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致谢
缩溶液配方来自 R.W. Aldrich 实验室。感谢以下资助机构和基金会的支持：美国国立卫生研究院、国家科学基金会、美国心脏协会、肌肉萎缩症协会、唐纳德·B·和黛莉娅·E·巴克斯特基金会、克林斯坦因基金以及麦克奈特神经科学捐赠基金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 膜片钳放大器 &和软件 | 仪器 | HEKA Instruments | EPC-10 | 或其他类似设备（例如 HEKA EPC-9 或 Axopatch 200B） |
| 5号镊子（两对） | 工具 | Fine Science Tools | ||
| 卵母细胞收缩液 | 试剂 | 成分 含量 N-甲基-D-葡糖胺 (N-methyl-D-glucamine) 220 mM HEPES 10 mM MgCl2 1 mM EGTA 10 mM 天冬氨酸 (Aspartic Acid) 220 mM KCl 2 mM 用 N-甲基-D-葡糖胺调 pH 至 7.4 | ||
| 编织网 | 800 um | Spectrum Labs | 146481 |
参考文献
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
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重印与许可
