成年小鼠的嗅觉行为测试

摘要

啮齿类动物嗅觉系统具有基本而独特的特性，这使其在生物学研究中受到日益广泛的关注。因此，也需要一种相对简单的功能评估方法。本文描述了用于表征小鼠嗅觉敏感性和偏好的高灵敏度检测方法。

摘要

啮齿类动物的嗅觉系统正日益引起科学家的关注，部分原因在于其具有高度保守且易于研究的神经环路，因此成为系统生物学的研究对象之一。此外，该系统在生物体整个生命周期中持续生成新神经元的独特能力，也使其成为发育生物学和再生生物学研究的理想模型。这些研究需求促使人们需要一种快速且可靠的嗅觉功能评估方法。目前许多嗅觉功能检测方法较为复杂、结果变异性大，或并非专门为小鼠设计。此外，一些检测方法对记忆缺陷和嗅觉功能障碍均敏感，导致实验结果难以准确解读。

本文介绍了一套简单的测试方法，旨在识别嗅觉敏感性和偏好的缺陷。首先，通过初步的一般健康评估，筛选出适合进一步测试的动物。其次，将小鼠暴露于不同浓度的气味中，以确定是否存在感知阈值的差异。第三，向小鼠呈现多种气味刺激，包括具有吸引力和厌恶性的气味，以评估其嗅觉偏好。这些简单的研究方法可使不同资源条件和专业技术水平的实验室均能开展对嗅觉行为的初步表征分析。

方案

一般健康检查

更全面的常规健康检查相关内容可参见 Jacqueline Crawley 优秀的动物行为表型分析资源， 我的小鼠出了什么问题？ ¹我们首先采用改良的观察性测试组合来评估受试者的一般健康状况。该测试组合包含塞缪尔·欧文（Samuel Irwin）综合评估方案中的项目。² 快速识别出不适合进一步测试的个体。简言之，改良版检测程序可识别出存在身体异常（如严重体重过轻或过重、毛发凌乱、呼吸困难）或表现出异常姿态、运动能力或行为的动物，这些均可能是疾病的临床表现。任何能够类似地识别出不健康个体的初步评估方法均适用。

还需要注意的是，在进行一般健康检查以及后续各项测试时，均以人道方式对待动物。由于这些测试不涉及任何可能引起疼痛的操作，因此无需使用麻醉或镇痛剂。

嗅觉敏感性测试

本实验旨在检测两组小鼠（例如野生型与突变型动物组）之间嗅觉敏感性的差异。实验中需制备多种浓度梯度的气味溶液。一只未经训练的小鼠将对其中一种浓度的气味进行探索，记录其在3分钟内的总探索时间。使用不同未经训练的个体测试多种浓度的气味，利用各组小鼠的总探索时间数据绘制剂量-反应曲线。测试过程应由两名研究人员共同完成，其中一人需对受试动物的基因型和/或实验条件保持盲态。

主要研究人员

1. 准备四个洁净的笼子（高 8 英寸 × 宽 10 英寸 × 长 18 英寸），均不加垫料。将这四个笼子排放在生物安全柜中。
2. 使用不透明滤纸在每个区域之间设置隔板。将一张黑色海报纸置于最末端的隔板上，使黑色面紧贴笼子的侧面和底部。用一块透明的有机玻璃盖住区域顶部，以便光线照射整个实验区域。
   (a) (b)
   图 1. 实验区域设置。 (a) 正确铺设的空置实验区域 (b) 包含实验动物和带气味滤纸的实验区域。


3. 开始对实验动物进行适应性训练。将第一只实验动物放入第一个笼子中进行适应。15 分钟后，将第一只实验动物转移至第二个笼子。用 Quatricide TB 清洁第一个笼子。随后，将第二只实验动物放入已清洁的第一个笼子中。以此类推，继续对后续实验动物进行相同操作。最终，每只实验动物都应在前三个笼子中完成适应过程，然后进入第四个（即最后一个）实验区域笼子，再进行 15 分钟的适应，之后开始正式实验。

盲人研究人员

1. 为气味样本准备适当数量的 2 英寸 × 2 英寸滤纸方块。
2. 使用预先选定的气味样本，进行适当稀释。对于花生酱等疏水性样品，使用油作为溶剂；对于其他所有样品，使用蒸馏水。涡旋混匀。
3. 在生物安全柜远端放置一台数码视频记录设备，确保整个笼子末端处于清晰对焦范围内。先录制一段初步视频，以确认参数设置合适。
4. 记录将要测试的稀释液顺序，并注意随机化各次试验的顺序。
5. 记录受试动物的窝别及编号。
6. 待受试动物在实验区域内适应 15 分钟后，开始准备第一次试验。在将第一次稀释液移液至滤纸方块前，先在锥形管中上下吹打混匀。滤纸表面应理想覆盖约 85%（约 0.50 mL 溶液）。使用吸水纸（kimwipe）确保滤纸不过度饱和。
7. 开始视频录制。
8. 将滤纸方块放置于笼内动物当前位置的对侧端。
9. 开始计时。
10. 3 分钟后，停止录制并移除稀释后的气味样本。
11. 如果仅测试一种气味（例如肉桂），则将第一位受试动物从实验区域中移出。对每只动物重复步骤 6–11，并为每位受试动物适当稀释气味样本。然而，如果需要测试多种气味，则不要将受试动物从实验区域中移出，而是直接开始计时。
12. 使用上述相同方法，对下一种气味进行适当稀释。
13. 1 分钟后，开始视频录制。将含有下一种气味稀释液的滤纸方块放置于笼内动物当前位置的对侧端。
14. 对每种气味重复步骤 6–13，并记录每次试验对应的视频文件编号。
15. 对每位受试动物重复步骤 6–14。
    
    图 2. 嗅觉敏感性测试一次实验的代表性结果。 对照组（A 组）或实验组（B 组）中的每只小鼠均暴露于滤纸上五种不同稀释度的肉桂提取物中，持续一次 3 分钟的实验。评估小鼠探索滤纸的总时间。A 组小鼠的嗅觉敏感性高于 B 组小鼠。

嗅觉偏好测试

该实验旨在识别特定的检测缺陷，即感知吸引性或厌恶性气味的能力。以下实验步骤大量借鉴了Kobayakawa, K. 等人3的实验方案。同样，测试过程中应由两名研究人员参与，其中一人对受试对象的基因型和/或实验条件保持盲态。通过回看视频记录不同气味下的总探索时间。与水相比，总探索时间更长的气味被定义为“吸引性”气味，而探索时间更短的则称为“厌恶性”气味。随后，研究人员需判断相同气味对不同受试对象是否表现为“吸引性”或“厌恶性”。

请按照主要研究人员的嗅觉敏感性测试部分中的步骤1-3进行操作。

盲人研究者

嗅觉偏好测试的步骤基本相同，仅对步骤2和步骤4进行轻微修改。请遵循“盲法研究者嗅觉敏感性测试”部分中的步骤1-15，但作如下调整：在步骤2中，使用预先选定的气味（包括吸引性和厌恶性气味的组合），在锥形管中用适当溶剂配制每种气味的稀释液。对于花生酱等疏水性样品，使用油作为溶剂；对于其他所有样品，使用蒸馏水。涡旋混匀。在步骤4中，不再记录待测试的稀释度，而是记录将要测试的不同气味的顺序，并对试验顺序进行随机化。

该实验旨在识别特定的检测缺陷，即感知吸引性或厌恶性气味的能力。以下实验步骤大量借鉴了 Kobayakawa, K. et al.³ 的实验方案。同样，应由两名研究人员参与测试，其中一人对受试对象的基因型和/或实验条件保持盲态。通过回看视频记录不同气味的总探索时间。与水相比，总探索时间更长的气味被定义为“吸引性”气味，而探索时间更短的则称为“厌恶性”气味。随后，研究人员需判断相同气味对不同受试对象是否表现为“吸引性”或“厌恶性”。

主要研究人员请按照嗅觉敏感性测试部分的步骤1-3进行操作。

盲人研究者

嗅觉偏好测试的步骤基本相同，仅对步骤2、4和13进行轻微修改。请遵循“盲法研究者嗅觉敏感性测试”部分中的步骤1-15，并作如下调整：在步骤2中，使用预先选定的气味（包括吸引性和厌恶性气味的组合），在锥形管中用适当溶剂将每种气味稀释成相应浓度的溶液。对于花生酱等疏水性样品，使用油作为溶剂；对于其他样品，均使用蒸馏水。涡旋混匀。在步骤4中，不再记录待测试的稀释度，而是记录待测试的不同气味的顺序，并在每次试验中随机化该顺序。在步骤13中，将浸有下一个待测试气味的滤纸片放置于动物当前所在位置的笼子对侧端。

图3. 嗅觉偏好测试一次实验的代表性结果。 每只小鼠分别在一次持续三分钟的实验中接触置于滤纸上的不同气味。评估小鼠探索滤纸的总时间。花生酱和香草为吸引性气味（气味探索时间_气味 > 水探索时间_水），而2-甲基丁酸为厌恶性气味（气味探索时间_气味 < 水探索时间_水）。

嗅觉测试评分

在获取所有嗅觉敏感性和偏好视频后，需要分析每种稀释浓度/气味的总探索时间。应由盲法研究人员对所有视频进行分析，以确保一致性。

1. 预览视频时请注意以下时间点：a）滤纸被放入实验区域时，b）小鼠接近滤纸时，c）小鼠开始探究滤纸时，以及 d）自滤纸放入实验区域起三分钟时间已到时。明确这些关键时间点有助于在回看时准确记录小鼠探索行为的总时长。
2. 观看视频，记录小鼠首次探究滤纸的时间（潜伏期）。
3. 使用秒表计时，在将滤纸放入实验区域后三分钟内开始所有观察。探究时间定义为小鼠鼻孔朝向滤纸的任何时段 < 距离滤纸1 mm处。在分析时，必须排除小鼠虽靠近滤纸但并未主动探究的时间段。总计探索时间时，不得包含啃咬或舔舐滤纸的行为片段，也不得包含坐在滤纸上的行为片段。为准确分析嗅觉行为，必须严格且一致地遵守这些规则。
4. 记录潜伏期时间、滤纸探索总时间及视频文件编号。

讨论

上述测试可用于快速、可靠地评估基本的嗅觉功能。然而，不应忽视的是，这种可靠性依赖于受试对象的正确选择和准备。患病或处于其他功能障碍状态的动物通常不适合作为稳定的测试对象。此外，受试动物的适应（驯化）过程至关重要。我们发现，在适应过程中使用多个笼子，有助于动物适应实验人员的操作以及环境的变化。我们还发现，短于规定时间的适应期不足以有效降低动物的焦虑水平。焦虑的动物往往表现出不可预测的行为反应，可能掩盖真实的差异。

在实际的小鼠测试中，不仅在采集数据时需要保持一致性，在分析受试动物的行为时也同样重要。我们发现，仅将受试小鼠的鼻尖距离滤纸小于<1 mm 的时间计入总的探索时间是较为有效的方法。此外，咬或咀嚼滤纸等行为不应计入总的探索时间。另外，对于具有吸引力的气味，潜伏期时间也可作为一个有用的指标。不同遗传背景的小鼠可能需要对气味进行不同的稀释，以便在对照组和实验组之间实现有效的区分。配对时也必须确保性别和年龄相匹配。我们发现，在对未经训练的小鼠进行正式实验测试之前，先在与对照组相似的受试动物上通过经验确定合适的气味稀释度是很有帮助的。最后，选择这些测试的目的在于尽量减少其他认知...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-甲基丁酸	试剂	Sigma-Aldrich	W269506	使用浓度：9.16 × 10-1 – 10-8 H中的M20)
纯香草精	试剂	McCormick & Co.	n/a	使用浓度：10-1 – 10-5 稀释（在 H2O 中）
花生酱（Skippy，超粗粒）	试剂	联合利华	n/a	使用浓度：10%（w/v），矿物油中
肉桂提取物	试剂	麦科密克 & Co.	n/a	使用浓度：10-1 – 10-5 稀释（在 H20)
矿物油，轻质	试剂	Fisher Scientific	O121-1	使用浓度：N/A