一种在特定时间点采集和测定手术伤口生化介质的技术。
本文内容
Retraction Notice
This article has been retracted at the request of the authors due to duplication of text in J Pain (Carvalho B, Clark DJ, Angst MS (2008) Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. J Pain 9: 650-657.) due to an honest mistake of the authors. View Retraction Notice
摘要
摘要
我们介绍一种能够采集并测定手术切口部位炎症和伤害性生化介质的方法。通过采集特定部位的生化标志物，我们可以评估手术切口与血清水平之间的关系；确定介质释放、疼痛程度及镇痛药消耗之间的关联；并评价全身性及外周药物给药对手术切口生化环境的影响。
该方法已应用于接受择期剖宫产并实施脊髓麻醉的健康女性。在剖宫产后1、6、24和48小时，测定伤口渗出液和血清中的介质水平，并结合疼痛评分及镇痛药物消耗量进行分析。检测到的生化介质包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、TNFα、INFγ、G-CSF、GM-CSF、MCP-1和MIP-1β、神经生长因子（NGF）、前列腺素E2（PG-E2）以及P物质。我们未发现伤口与血清细胞因子浓度或其时间释放曲线之间存在显著相关性（J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7）。本文描述并验证了在特定时间点采集和检测手术伤口中伤害性刺激及炎症介质的可行性。血清与伤口局部水平之间缺乏显著相关性，表明在研究手术伤口及局部病理状态时，确定局部特异性释放具有重要意义。
方案
伤害性与炎症生化介质采集
- 手术团队在关闭切口前，将 On-Q® PainBuster® 疼痛缓解系统置入皮下层。该系统以 2 ml/h 的速率持续向切口部位皮下输注生理盐水（或局部麻醉药）。
- 该系统配备三通旋塞阀，以便在指定时间点抽吸伤口渗出液。
- 根据方案规定的时间点（例如剖宫产术后 1、6、24 和 48 小时），将 1 ml 伤口渗出液抽吸至含有 30 μl 蛋白酶抑制剂的聚乙烯杯中。
- 在同一时间点，采集 10 ml 血液至含有锂肝素的绿色头盖采血管中，随后向血液样本中加入 300 μl 蛋白酶抑制剂。
- 样本采集后 1 小时内置于冰上，并在 3000 rpm 条件下离心 10 分钟。
- 分离血清和伤口上清液，转移至标准微量离心管中，于 -20°C 保存。
检测分析
- 所有样本采集完成后，将同时进行解冻和分析。
- 随后使用17重联珠阵列免疫测定板检测细胞因子。多重免疫测定技术可在低至50 μl的体液样本中同时检测多达100种分析物，其结果与ELISA方法获得的结果具有可比性。该检测板可测定白细胞介素1ß（IL-1ß）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素7（IL-7）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素13（IL-13）、白细胞介素17（IL-17）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、干扰素α（INFα）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和巨噬细胞炎症蛋白1β（MIP-1β）。
- 神经生长因子（NGF）使用抗体DY256进行检测，通过Bio-Plex胺偶联试剂盒将其添加至17重联检测板中。
- 每项检测均设置复孔，并严格按照制造商说明书操作。每种分析物的标准曲线采用制造商提供的参考分析物建立，浓度分别为0.20、0.78、3.13、12.5、50、200、800、3200 pg/ml，另设零标准品（仅正常生理盐水）。每次实验均包含标准曲线，样本浓度由Bio-Plex Manager软件计算得出。
- 前列腺素E2和P物质采用高灵敏度ELISA试剂盒进行检测，每项检测均按制造商说明书设置复孔。
图1： 剖宫产术前基线、术后6小时及24小时时，渗出液和血清中多种促炎与抗炎细胞因子（白细胞介素1ß（IL-1ß）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素5（IL-5）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素7（IL-7）、白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素13（IL-13）、白细胞介素17（IL-17）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（INFγ）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和巨噬细胞炎症蛋白1β（MIP-1ß））、神经生长因子（NGF）、前列腺素E2（PG-E2）和P物质（SP）的水平（pg/mL）。
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讨论
在缝合伤口前，应将On-Q® PainBuster®镇痛系统置入皮下层，并贯穿整个切口。这有助于在规定的时间间隔通过三通旋塞进行抽吸。On-Q®系统以2 ml/h的速度持续向伤口皮下输注生理盐水，防止导管堵塞，提高系统获取渗出液样本的可靠性。如果渗出液抽吸困难（约5%的病例），可考虑调整受试者体位（例如让患者坐起或平卧）、在切口上方轻柔按压、使用0.5–1 ml生理盐水冲洗，或回撤导管1–2 cm。
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
Carvalho 博士的工作得到了美国国立卫生研究院妇女健康研究办公室和儿童健康与人类发展国家研究所资助的女性健康跨学科职业发展研究项目（5K12 HD043452）的支持。Angst 博士从 I-Flow 公司（加利福尼亚州莱克福雷斯特）获得了实验用品（On-Q® PainBuster® 术后镇痛系统）以及进行生物化学检测的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| On-Q® PainBuster® 术后镇痛系统 | I-Flow, Lake Forest, CA | ||
| 完全蛋白酶抑制剂 | Roche Group | ||
| 17重磁珠免疫检测试剂盒 Bio-PlexTM 板 | Bio-Rad | ||
| Bio-Plex 胺偶联试剂盒 | Bio-Rad | ||
| NGF 抗体 DY256 | R&D Systems | ||
| 前列腺素 E2 和 P 物质 ELISA 试剂盒 | Assay Designs |
参考文献
- Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
- Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
- Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
- Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).
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