环境科学中的无菌技术

1. 无菌操作的准备工作

1. 获取并穿戴以下个人防护装备（PPE）：实验服、无破损或孔洞的乳胶或丁腈手套，以及护目镜（图1）。若需使用明火，为安全起见，请将长发束起。
   
   图1：个人防护装备：实验服、乳胶手套和护目镜。
2. 无菌操作技术的另一个重要方面是正确灭菌和储存将在实验中使用的培养基/试剂。通过称取适量干燥基础粉末，并将其加入规定体积的去离子水中，配制液体肉汤培养基（例如，胰蛋白胨大豆肉汤）和基于琼脂的培养基（例如，R2A）。
3. 对于液体肉汤培养基，将粉末置于加热板上以低温加热溶解，并将液体分装至玻璃螺旋盖瓶中（每瓶100 mL）或玻璃螺旋盖试管中（每管10 mL）。使用磁力搅拌子，在加热板搅拌器上搅拌琼脂培养基，直至粉末完全溶解。
4. 在容器上贴上高压灭菌指示胶带，并按照制造商说明进行高压灭菌处理（例如，121 °C 下维持20分钟）（图2和图3）。注意，高压灭菌胶带上的条纹颜色应由白色（灭菌前）变为黑色（灭菌后）。尽管颜色变化通常表明灭菌成功，但仍可使用芽孢条检测工具进行无菌验证，以确认高压灭菌效果。
   
   图2：将高压灭菌指示胶带贴附于物品表面。
   
   图3：注意高压灭菌胶带上的条纹颜色由白色（灭菌前）变为黑色（灭菌后）。
5. 将液体肉汤冷却至室温，随后可在室温下保存，或于4 °C 冷藏保存。
6. 将琼脂培养基容器置于约50 °C 的水浴中冷却。冷却后，可将培养基倒入无菌培养皿中。待其冷却凝固后，按照制造商规定的温度条件集中储存。
7. 某些类型的培养基因高温会破坏关键成分而无法进行高压灭菌。此类培养基需采用真空过滤系统，通过0.22 µm 滤膜进行过滤除菌，随后在适当温度下储存。
8. 在实验台操作前，使用合适的消毒液（例如，500 ppm 次氯酸钠溶液）对台面进行消毒，以降低污染物从工作表面传播至培养物或无菌培养基的风险。
9. 为建立无菌区域，打开本生灯。用于灭菌金属接种环的最佳火焰类型为强烈的蓝色火焰，其中心应可见清晰的蓝色内锥（图4）。
   
   图4：将细菌从一个显示培养物生长的培养皿转移至另一个含有琼脂培养基但未接种的培养皿。
10. 缓慢将接种环通过火焰最热的部分（蓝色内锥尖端），使其烧至通红，以实现彻底灭菌。

2. 细菌转移：从一个培养皿到另一个培养皿

1. 一种常见的细菌转移场景是将已培养分离物生长的培养皿中的细菌，转移到另一个含有基于琼脂的培养基的无菌培养皿中。
2. 开始时，轻轻打开含有纯细菌培养物的培养皿，将灼烧灭菌后仍处于高温状态的接种环轻触琼脂表面。
3. 使用冷却后的接种环从培养皿表面挑取一个单一菌落，然后关闭培养皿。
4. 使用含有培养基的新鲜培养皿进行划线分离操作，操作时将皿盖微微打开。
5. 在进行每一区段的划线分离（每皿共3个区段）之前，均需用火焰对接种环进行灭菌。在完成最后一次划线后，也应立即对接种环进行火焰灭菌，以防止实验台面污染，并考虑到实验室中其他人员后续可能使用或接触接种环。
6. 将划线后的培养皿放入恒温培养箱中，过夜培养。

3. 细菌转移：从肉汤培养物到培养皿

1. 另一种细菌转移的情景是从表现出生长的液体培养物（通常通过浑浊现象观察到）转移到含有培养基的无菌培养皿中。
2. 取下装有纯细菌培养物的试管（或烧瓶）的瓶盖，并将容器开口处通过火焰最热部分2-3次。为防止污染，切勿将瓶盖放置在实验台面上。
3. 小心地将已灭菌的接种环插入试管/烧瓶中，并在接触液体培养物之前，轻轻触碰容器内壁以冷却接种环。
4. 取一环液体培养物（图5），并立即盖上瓶盖。
   
   图5：一环液体培养物。
5. 使用含有培养基的新鲜培养皿，将皿盖略微打开，进行划线分离操作。
6. 每段划线（每皿共3段）操作前，均需将接种环进行火焰灭菌。在完成最后一次划线后，也应立即对接种环进行火焰灭菌，以防止实验台面污染，并为实验室中后续使用接种环的人员提供安全考虑。
7. 将已完成划线的培养皿放入培养箱中，过夜培养以促进菌落生长。

4. 细菌转移：从长有菌落的培养皿到无菌液体培养基

1. 第三种细菌转移场景是从含有分离培养物的培养皿转移到含有无菌液体培养基的试管/烧瓶中。
2. 轻轻打开含有纯细菌培养物的培养皿，通过将灼热的接种环轻触琼脂表面以冷却。
3. 使用已冷却的接种环从培养皿表面挑取一个孤立菌落，并关闭培养皿。
4. 取下含有无菌液体培养基的试管（或烧瓶）的盖子，并将容器口在火焰最热部分通过2至3次。为防止污染，切勿将盖子放置在实验台面上。
5. 小心地将挑出的菌落放入液体培养基中，并轻轻搅动接种环以释放细菌。立即重新盖上盖子。
6. 对接种环进行火焰灭菌，以防止对实验台面造成污染，并考虑到实验室其他人员后续可能使用这些接种环。
7. 将烧瓶放入培养箱中过夜培养。
8. 次日从培养箱中取出烧瓶，进行梯度稀释以定量测定菌液浓度。
9. 将系列稀释液接种至琼脂糖培养基平板上，并将平板过夜培养。
10. 次日取出平板，观察是否存在任何污染。

5. 细菌转接：从肉汤培养物到无菌液体培养基

1. 第四种细菌转移场景是从处于生长状态的液体培养物转移到含有无菌液体培养基的试管或烧瓶中。
2. 取下装有纯细菌培养物的试管（或烧瓶）的瓶盖，将容器口通过火焰最热部分两次。为防止污染，切勿将瓶盖放置在实验台面上。
3. 小心地将接种环 lowered 放入试管/烧瓶中，并在插入液体培养物之前，轻轻接触容器壁以冷却接种环。
4. 吸取一环液体培养物后，立即盖上瓶盖。
5. 取下装有无菌液体培养基的试管（或烧瓶）的瓶盖，并将容器口通过火焰最热部分两次。 为防止污染，切勿将瓶盖放置在实验台面上。
6. 小心地将含有培养物的接种环放入无菌液体培养基中，轻轻搅动接种环以释放细菌，然后立即盖上瓶盖。
7. 对接种环进行火焰灭菌（图6），以防止实验台面污染，并考虑到实验室中其他后续使用接种环的人员。
   
   图6：接种环在本生灯火焰中灭菌时烧至通红。
8. 将烧瓶放入培养箱中，过夜培养。
9. 次日从培养箱中取出烧瓶，进行系列稀释以定量测定菌液浓度。
10. 将系列稀释液涂布于琼脂糖培养基平板上，并将平板过夜培养。
11. 次日取出平板，观察是否存在污染。