检测转基因食品

1. 从食品样品中提取DNA

1. 使用移液管或200–1,000 µL可调移液器，向2个螺旋盖管中各加入500 µL市售PCR混合液基质。每次分装之间需用移液器反复吹打混匀PCR基质，使其均匀混合。
2. 将其中一个螺旋盖管标记为“非转基因”，另一个标记为“检测”。
3. 称取0.5 g经认证的非转基因食品，放入研钵中。
4. 加入2.5 mL蒸馏水，用研杵研磨2分钟，形成浆液。
5. 再加入2.5 mL蒸馏水，继续用研杵研磨，直至浆液变得足够均匀，便于移液。
6. 使用刻度移液管的50 µL刻度，将50 µL研磨后的浆液转移至含有500 µL标记为“非转基因”的PCR预混液的螺旋盖管中。盖紧管盖。
7. 重复步骤1.3–1.6，制备待测食品样品。
8. 将50 µL研磨后的待测食品浆液移入标记为“检测”的螺旋盖管中。盖紧管盖。
9. 将非转基因食品和待测食品的PCR管涡旋振荡1分钟，然后放入95 °C水浴中加热5分钟。若无涡旋振荡器，可在放入水浴前反复弹击管体数次以混匀内容物。
10. 将管子放入离心机中离心5分钟。管底应形成固体沉淀。若5分钟后仍未形成沉淀，以2分钟为间隔继续离心，直至沉淀形成。
11. 制备好的管子可立即用于PCR扩增，或在冰箱中保存最多1周。

2. 设置 PCR 反应

1. 将 PCR 管编号为 1–6 并标注姓名缩写。编号应与表 1中列出的各管内容相对应。
2. 将每支标记好的 PCR 管放入微量离心管架中，管盖打开。
3. 每次添加时均使用新的吸头，根据表 1所示，向每支 PCR 管中加入 20 µL 对应的引物。加完后盖上管盖。
4. 每支管使用新的吸头，根据表 1所示，向每支 PCR 管中加入 20 µL 对应的 DNA 样品，注意仅从上清液中移液，避免触及管底的沉淀物。
5. 每份 DNA 样品加入对应 PCR 管后，用移液器轻柔吹打数次以混匀 DNA 与引物；随后盖上管盖。
6. 将 PCR 管放入热循环仪中，并设置如下程序：
   初始变性：94 °C 下 2 分钟，1 个循环。
   扩增：94 °C 下 1 分钟（变性）、59 °C 下 1 分钟（退火）、72 °C 下 2 分钟（延伸），共 40 个循环。
   最终延伸：72 °C 下 10 分钟，1 个循环。
   保存：4 °C 长时间保存。

3. 3% 琼脂糖凝胶的制备

1. 使用实验室胶带或遮蔽胶带，牢固地封住凝胶托盘的开放两端。确保胶带完全密封托盘边缘，防止熔化的琼脂糖泄漏。
2. 称取 3 g 琼脂糖，放入 250 mL 或更大容量的锥形瓶中。
3. 加入 100 mL 的 1× TAE 缓冲液（可购买或由浓缩液配制）。
4. 使用带磁力搅拌子的加热磁力搅拌器，加热烧瓶直至琼脂糖在缓冲液中完全溶解，溶液沸腾并变为透明。或者，也可使用微波炉：将烧瓶放入微波炉中，以每次 30 秒的间隔加热，并每隔 10 秒用玻璃棒搅拌一次，重复操作直至溶液沸腾并变得透明。
5. 将一个 50 mL 锥形瓶倒置插入 250 mL 锥形瓶口，作为回流装置，防止琼脂糖溶液蒸发。
6. 让琼脂糖溶液冷却至 60 °C，然后将 30–50 mL 溶液倒入每个已贴胶带的凝胶托盘中。
7. 将凝胶梳插入第一对凹槽中，以形成凝胶加样孔。
8. 待凝胶完全冷却后再移除胶带和梳子。当凝胶由透明变为浑浊时即已凝固，通常需要约 10–20 分钟。

4. PCR 产物的电泳

1. 将预制的3%琼脂糖凝胶放置于凝胶托盘上，或使用已浇注3%琼脂糖凝胶的凝胶托盘。
2. 将凝胶托盘滑入电泳槽中，使加样孔一端靠近阴极（黑色）端。
3. 向电泳槽中加入1×TAE缓冲液，直至液面高出凝胶托盘表面约2 mm。
4. 从PCR仪中取出PCR管，并放入微量离心管架中。
5. 每次使用新的移液枪头，向每个样品中加入10 µL购入的橙G加样染料（LD），并充分混匀。
6. 按照指定顺序（表2）将20 µL分子量标准和每个样品的20 µL上样至凝胶孔中。
7. 在100 V电压下进行凝胶电泳，运行30分钟。
8. 将凝胶托盘从电泳槽中取出，滑出凝胶并从托盘上剥离，将凝胶放入染色托盘中。
9. 将凝胶浸入购入的DNA凝胶染料中染色5分钟，并轻轻振荡托盘以使染料均匀分布。
10. 将凝胶转移至漂洗容器中，用自来水（40–55 °C）漂洗约10秒。
11. 用温自来水漂洗3次，每次6分钟，轻轻振荡以获得最佳脱色效果。如有必要，可继续在温水中脱色，直至达到理想的对比度。

试管编号	引物	DNA 样本
1	20 µL 植物引物（绿色）	20 µL 非转基因食品对照 DNA
2	20 µL 转基因引物（红色）	20 µL 非转基因食品对照 DNA
3	20 µL 植物引物（绿色）	20 µL 待测食品 DNA
4	20 µL 转基因引物（红色）	20 µL 待测食品 DNA
5	20 µL 植物引物（绿色）	20 µL 转基因阳性对照 DNA
6	20 µL 转基因引物（红色）	20 µL 转基因阳性对照 DNA

表1. 适用的管号、引物和DNA样本列表。

1号孔	样品1 非转基因食品对照组，加入植物引物 20 µL。
2号孔	样品2 非转基因食品对照组，加入转基因引物 20 µL。
3号孔	样品3 待测食品，加入植物引物 20 µL。
4号孔	样品4 待测食品，加入转基因引物 20 µL。
5号孔	样品5 转基因阳性DNA，加入植物引物 20 µL。
6号孔	样品6 转基因阳性DNA，加入转基因引物 20 µL。
7号孔	PCR分子量标准 20 µL。
8号孔	留空。

表2. 将20 µL分子量标准品和每种样品各20 µL加入凝胶的正确加样顺序。