利用聚合酶链式反应与凝胶电泳检测环境微生物

1. 样品采集

1. 使用土钻或铲子采集至预定深度的土壤。若采集根际土壤（受植物根系及其相关微生物影响的根系周围狭小区域），仅需从植物根系周围直接采集，并将土壤敲入收集桶中。
2. 手持浸入杆末端，将无菌塑料瓶浸入水中以采集水样。

2. 核酸提取与制备

1. 从样本中收集生物体和病毒，并从中提取 DNA 和 RNA。具体操作细节，请参阅 JoVE 科学教育视频中关于群落核酸提取的内容。
2. 将提取的 DNA 储存在标记好的微量离心管中。如果 DNA 需要过夜或更长时间储存，请在 -20 °C 冷冻保存；使用前在室温下解冻。
3. 如果待检测的遗传物质为 RNA（无论是 RNA 病毒的基因组，还是细胞生物转录的 RNA），在进行 PCR 前需对样本进行逆转录（RT），以生成互补 DNA（cDNA）。具体细节，请参阅 JoVE 科学教育视频中关于 RT-PCR 的内容。

3. 聚合酶链式反应

1. 加入PCR酶（例如, Taq 将聚合酶置于冰上，其余试剂（PCR缓冲液、dNTPs、引物）在室温下于指定的“洁净”超净台内解冻。该酶储存于-20 °C，但不会冻结。酶对温度敏感，因此必须保持低温，并尽量减少其暴露于室温环境。
2. 计算每种试剂所需的体积，以配制所有反应中保持不变的试剂“主混合液”表1）。务必考虑阳性（例如，已知含有目标区域的模板）以及阴性（例如，无模板对照）纳入计算。为补偿移液误差，最终体积额外增加10%。引物用量取决于针对特定生物体的检测方法；请参考已发表文献获取相应数值。 
3. 使用低吸附微量离心管（可最大限度减少试剂分子与管壁塑料的黏附），加入经计算所得体积的各试剂以配制预混液。添加前，每种试剂均需轻轻涡旋混匀并离心。预混液配制完成后，再次涡旋混匀，并通过离心收集
4. 准备8联管PCR管条。为每个样本指定一个管，包括阳性对照和阴性对照
5. 将适量体积的PCR混合液加入到条状管的每个管中
6. 向各自的PCR管中加入样品中适量体积的DNA模板，以及5 μL阳性模板和5 μL分子生物学级水作为阴性对照。
7. 将管盖牢固地盖在8联管上，使用小型离心机离心数秒
8. 将8联管放入热循环仪中
9. 设置合适的PCR程序以在热循环仪上运行。一个典型的程序包括以下步骤
   1. 94 °C 变性 3 分钟。
   2. 30–40 个扩增循环：94 °C 变性 30 秒，引物特异性退火温度（通常为 50–60 °C）退火 30 秒，72 °C 延伸（每 500 bp 延伸 30 秒）。
   3. 72 °C 下终延伸 7–10 分钟。 

4. 琼脂糖凝胶制备

1. 根据所需的凝胶体积和凝胶浓度（表2），称取适量的琼脂糖粉末，放入125 mL锥形瓶中。
2. 向锥形瓶中加入适量的凝胶电泳缓冲液，并用手轻轻旋转混匀。
3. 将缓冲液-琼脂糖混合物放入微波炉中，高火加热1分钟。
4. 从微波炉中取出锥形瓶，用手轻轻旋转，确保所有琼脂糖完全溶解。如果琼脂糖未完全溶解，可每次加热30秒，重复微波处理。
5. 将瓶盖拧紧后，通过在流动的冷水下旋转冷却至50 °C。
6. 使用专用于溴化乙锭（EtBr）的微量移液器，向琼脂糖混合物中加入1 μL溴化乙锭（EtBr）。EtBr是一种可结合双链核酸并在紫外光照射下发出橙色荧光的染料。注意：EtBr具有潜在致癌性，因此必须佩戴个人防护装备（护目镜、实验服、耐EtBr手套）。
7. 将熔化的凝胶倒入电泳凝胶制胶槽中，确保琼脂糖中无气泡残留。将梳子插入凝胶中并牢固夹紧。静置约20–30分钟，使凝胶完全凝固。
8. 待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，避免在凝胶中造成撕裂。梳子可在凝胶中形成加样孔，用于上样。

5. 凝胶电泳

1. 将凝固的琼脂糖凝胶放入电泳槽中。
2. 向电泳槽中加入适量的电泳缓冲液，直至凝胶刚好被浸没。
3. 在一块Parafilm上，用移液器点加适量上样染料浓缩液。同时加入适用于预期PCR产物大小范围的DNA Marker。或者，也可使用一套新的微量离心管，每份样品使用一管。
4. PCR反应完成后，从PCR仪中取出8联管，短暂离心以收集管壁上的冷凝液。将适量的DNA扩增产物加入上样染料中，并反复吹打混匀。例如，将2 µL的10x上样染料与8 µL样品混合，得到终体积为10 µL、染料浓度为1x的混合液。
5. 将每种染料-样品混合物小心地移入琼脂糖凝胶的指定加样孔中，注意避免刺穿加样孔。
6. 将电极连接至电泳槽。DNA带负电荷，因此会向正极移动。因此，应将正极连接到加样孔的对侧。根据缓冲系统和凝胶槽尺寸设置合适的电压，并启动电泳。若电泳正常进行，应可见小气泡沿电泳槽两侧向上移动。
7. 当染料前沿在凝胶中迁移至足够距离时，关闭电源。小心将凝胶转移至凝胶成像系统或紫外透射仪中，打开紫外灯以观察凝胶上的DNA条带。
8. 分析凝胶上条带的大小和位置。将样品条带位置与阳性对照进行比较，以判断样品中是否含有目标生物的DNA（图1）。

组分	每管体积（μL）	5 管总体积（μL）	终浓度
10x Ex Taq 缓冲液	5.0	25	1x
2.5 mM dNTPs	4.0	20	0.2 mM
正向引物*	2.0	10	400 nM
反向引物*	2.0	10	400 nM
分子生物学 H2O	31.75	158.75	—
Ex Taq	0.25	1.25	2.5 U
PCR 混合液	45	225

表1. PCR反应主混合液的试剂用量。 *引物用量根据生物体检测方法的不同而变化。通过调整分子级水的用量，使最终体积达到45 μL。其他组分的用量不应改变。

推荐的琼脂糖百分比	线性 DNA 片段的最佳分辨率（碱基对）
0.5	1,000-30,000
0.7	800-12,000
1.0	500-10,000
1.2	400-7,000
1.5	200-3,000
2.0	50-2,00

表2. 不同琼脂糖凝胶浓度最适分离的DNA片段大小范围。