利用聚合酶链式反应与凝胶电泳检测环境微生物

聚合酶链式反应（PCR）是一种基本的生物学技术，广泛应用于检测和鉴定存在于土壤、水体及其他环境样本中的微生物。

传统上，微生物在实验室中通过使用特定的培养基进行培养。然而，自然界中的许多微生物是“不可培养的”——这可能是因为它们的新陈代谢活性或生长速率极低，或因为其生长条件极为苛刻，无法在培养皿中复制。微生物之间在可培养性上的差异还意味着，当对环境样本中的微生物进行培养时，其在培养物中的相对丰度可能无法反映其在自然环境中的实际水平。

聚合酶链式反应（PCR）的出现能够特异性扩增混合样品中即使含量极少的DNA，使得人们能够快速检测并鉴定环境样本复杂生物群落中特定的目标微生物，包括那些不可培养的微生物。

本视频将介绍聚合酶链式反应（PCR）的基本原理。随后，将讨论一种通用方案，用于对从环境样本中分离的DNA进行PCR扩增，以检测目标生物的存在。最后，将探讨基于PCR的微生物鉴定技术的若干应用。

PCR 的基本原理是利用反复的温度循环变化来实现 DNA 的指数级扩增，通常使用一种称为热循环仪的仪器自动完成不同温度阶段的循环。DNA 合成由 DNA 聚合酶催化完成，这些酶来源于生活在温泉中的细菌，例如水生栖热菌（Thermus aquaticus）或简称“Taq”。这些聚合酶具有耐热性，能够耐受 PCR 过程中所使用的高温。

目标序列（称为扩增子）通过两种短核苷酸片段（称为“引物”）从DNA模板中扩增而来。由于互补核酸结合具有高度特异性，引物能够实现对特定目标序列的精准扩增。通过设计仅能扩增来自目标生物体的独特序列或独特序列组合的引物，聚合酶链式反应（PCR）可用于在复杂环境样本所包含的全部遗传物质中，特异性地检测该生物体DNA的存在。

每个PCR循环分为三个阶段。第一阶段称为“变性”，通常设置在92 °C以上，持续约30秒。变性用于将DNA分子解离为单链，以使扩增反应能够进行。

第二阶段“退火”的温度设定为两种引物中较低熔解温度以下 2 至 3 °C，通常在 50 至 65 °C 之间，持续时间也约为 30 秒。熔解温度是指 50% 的双链 DNA 分子解离为单链的温度，因此退火步骤可使引物与 DNA 模板上的靶序列结合。

PCR 循环的第三阶段是“延伸”或“延伸反应”，此时 DNA 聚合酶结合到引物-模板双链上，并催化新链的合成。对于最常用的 PCR 聚合酶 Taq，该阶段通常设定在 72 °C，持续时间取决于扩增片段的长度，一般为每 500 个碱基对 30 秒。每个循环结束后，扩增的 DNA 再次变性并作为新的模板，从而导致 PCR 产物数量呈指数增长。

反应完成后，可通过凝胶电泳将PCR产物按大小分离，凝胶通常由聚合物琼脂糖制成。在凝胶两端施加电场，DNA分子骨架上的负电荷使其向电场正极迁移。一般来说，较大的线性DNA分子穿过凝胶基质所需的时间更长。

现在您已经了解了 PCR 的工作原理，接下来让我们看看如何利用该反应来鉴定环境样本中的微生物。

首先，根据待处理的样本数量计算每种试剂所需的体积，并额外增加10%以弥补移液误差。应包括一个含有目标区域的阳性对照模板，以确保反应正常进行；同时应设置一个不加入DNA模板的阴性对照，以排除反应组分中是否存在污染。将Taq聚合酶置于冰上保存，其余试剂和DNA样本则在指定的超净工作台内于室温下解冻，以防止污染。

所有试剂解冻后，将每种试剂按计算好的体积加入低吸附微量离心管中，配制试剂“主混合液”，以尽量减少因分子吸附到管壁表面导致的试剂用量差异。添加前，每种试剂需轻轻涡旋混匀，并短暂离心。主混合液配制完成后，轻轻涡旋混匀，并通过离心收集。

标记一个8孔PCR条带，为每个样本（包括对照）指定一个单独的管。将适量的PCR预混液加入条带中的每个管中，然后将每个DNA样本分别加入对应的管中。

将条形管盖牢固地盖在条形管上，使用带条形管架的迷你离心机短暂离心。然后将管子放入热循环仪中，按照相应的PCR程序运行反应。

在进行 PCR 的同时，准备用于电泳分离 PCR 产物的琼脂糖凝胶。根据 PCR 产物的预期大小，称取适量的琼脂糖粉末，以配制合适浓度的凝胶。将琼脂糖加入一个 125 mL 的锥形瓶中，然后根据凝胶的体积加入适量的凝胶电泳缓冲液，轻轻旋转混匀。将琼脂糖溶液在微波炉中高火加热 1 分钟。加热结束后，通过旋转锥形瓶检查琼脂糖是否完全溶解；若未完全溶解，可每次加热 30 秒，重复微波处理直至完全溶解。

将瓶盖拧紧至烧瓶上，通过在流动的冷水下旋转烧瓶使琼脂糖溶液冷却至 50 °C。冷却后，向琼脂糖溶液中加入 1 µL 溴化乙锭。由于溴化乙锭具有潜在致癌性，务必佩戴个人防护装备，如护目镜、实验服以及耐溴化乙锭手套。

将琼脂糖溶液倒入电泳凝胶制胶槽中，确保琼脂糖内无气泡残留。将带有所需数量加样孔的梳子插入溶液中。室温下静置20至30分钟，使凝胶完全凝固。凝胶凝固后，小心移去梳子，注意不要在操作过程中撕裂凝胶。

将凝固的凝胶放入电泳槽中。向槽内加入LB缓冲液，直至凝胶完全浸没。在一块Parafilm上，用移液器点加适量范围的DNA Ladder，以匹配预期的PCR产物大小。从PCR仪中取出已完成扩增反应的PCR管。通过短暂离心收集PCR管中的冷凝液，然后将每份样品各8 µL加到Parafilm上的点样位置。向每份PCR产物样品点中加入2 µL的10x上样染料，使染料的终浓度为2x。

将样品和DNA分子量标准加入琼脂糖凝胶的指定加样孔中，注意不要刺穿凝胶。加样完成后，盖上电泳槽的盖子，并将电极连接至电源。由于DNA带负电荷，会向正极迁移，因此务必确保加样孔位于靠近负极的一侧。打开电源，根据电泳槽的大小和所用缓冲系统设置合适的电压。启动电泳，若电泳正常进行，可观察到小气泡沿电泳槽两侧向上移动。

当染料前沿在凝胶中迁移至足够远的距离时，关闭电源。小心地将凝胶转移至凝胶成像仪以观察电泳产物。使用防护罩开启紫外光，观察凝胶上的DNA条带。分析条带的位置，判断其是否与预期模式相符，从而确定环境样本中是否存在目标物种。

现在您已经了解了 PCR 的操作过程，接下来让我们探讨如何将 PCR 应用于检测环境中感兴趣的微生物。

基于PCR的环境微生物检测用途之一是鉴定致病生物，例如“食脑变形虫”福氏耐格里阿米巴原虫（Naegleria fowleri）。这是一种存在于淡水水体和未加氯消毒泳池中的单细胞生物，可侵袭人类神经系统，常导致致命后果。通过使用靶向该变形虫基因组中特异性DNA序列的引物进行PCR扩增，可检测水样或疑似患者脑脊液中是否存在这种致命微生物。

基于PCR的微生物鉴定的另一个应用是检测在食品经营场所附近捕获的蝇类中是否存在致病性细菌，这属于公共卫生监测和疾病暴发调查的一部分。

在此，研究人员首先从蝇类的体表和消化道中分离细菌，然后使用特定物种的培养条件富集目标菌种，以检测沙门氏菌（Salmonella）和李斯特菌（Listeria）等致病菌的存在。对培养出的细菌提取DNA后，采用市售的物种特异性PCR检测试剂盒鉴定其种类。

最后，可以利用 PCR 鉴别和区分不同菌株的耐药性致病细菌（例如金黄色葡萄球菌），这些细菌对公共卫生构成了重大威胁。

在此示例中，研究人员从临床样本中分离并培养了金黄色葡萄球菌（S. aureus），随后从细菌菌落中提取DNA，并进行PCR扩增。此处的扩增反应采用“多重”方式，即针对细菌基因组不同特异性区域的多对引物被组合在同一反应体系中。每对引物经过设计，仅能对部分菌株的DNA产生扩增产物，而不能扩增其他菌株的DNA，因此通过组合使用，每种菌株均呈现出独特的扩增条带模式。

您刚刚观看了 JoVE 关于基于 PCR 的微生物检测的视频。我们探讨了聚合酶链式反应（PCR）背后的基本原理；介绍了对从环境微生物中提取的 DNA 进行 PCR 扩增的实验方案；最后，还展示了该技术在不同类型环境或临床样本中检测特定目标微生物的若干具体应用。感谢观看！