土壤样品中细菌的培养与计数

1. 土壤稀释液的制备

1. 开始实验时，称取10 g土壤样品，加入95 mL去离子水中。充分振荡混匀，标记为“A”。
2. 在土壤未完全沉降前，用无菌移液器吸取1 mL悬液，转移至9 mL去离子水空白管中。充分涡旋混匀，标记为“B”。
3. 重复此稀释步骤三次，每次取前一管悬液1 mL，加入9 mL去离子水空白管中。依次标记为C、D和E管。最终获得每毫升含10^-1至10^-5克土壤的系列稀释液。

2. 细菌培养的涂布平板制备

1. 为了培养细菌菌落，取三个预先制备好的蛋白胨-酵母提取物琼脂平板，分别标记为 C、D 和 E。将样品 C、D 和 E 涡旋振荡，然后各取 0.1 mL 滴加到对应的平板上。此步骤可进一步将稀释倍数增加十倍（C = 10^-3，D = 10^-4，E = 10^-5）。
2. 接下来，将玻璃涂布棒浸入乙醇中，然后将其置于火焰中数秒钟，以点燃并烧尽乙醇，从而实现涂布棒的灭菌。
3. 将涂布棒悬于第一个平板上方，待火焰熄灭后，迅速打开平板，同时将皿盖靠近操作。先将涂布棒接触接种区域以外的琼脂表面以冷却，然后将接种液滴均匀涂布于整个琼脂表面，直至自由流动的液体痕迹消失，随后盖上平板皿盖。
4. 重新用火焰灭菌涂布棒，并对下一个平板重复上述操作，操作过程应迅速，以避免空气中的微生物污染琼脂表面。
5. 将细菌平板在室温下倒置培养一周，确保培养过程中平板倒置，以防止冷凝水滴落到琼脂表面。

3. 放线菌涂布平板的制备

1. 为了培养放线菌，取三块预先制备好的甘油-酪蛋白培养基平板，分别标记为B、C和D。采用先前展示的技术，将0.1 mL的B、C和D稀释液分别涂布于对应的平板上。使用较低稀释度的原因是放线菌通常以1/10的比例存在^th 细菌种群数量（B = 10^-2，C = 10^-3，D = 10^-4).
2. 将放线菌平板（倒置）于室温下孵育2周。

4. 细菌与放线菌计数

1. 孵育结束后，仔细观察所有细菌平板，记录菌落大小和形状的差异。在琼脂培养基上生长时，细菌形成的菌落呈黏液状，颜色从无色到鲜橙色、黄色或粉红色不等。相比之下，放线菌菌落呈粉质、质地较硬、革样，受压时会碎裂，而其他细菌菌落则会涂抹开。因此可通过无菌接种环轻触菌落，根据触感加以区分。
2. 计数并记录细菌菌落的数量，包括所有放线菌菌落。仅对每平板菌落数在30–200之间的平板进行计数。

5. 纯培养物的分离

1. 从任一平板上挑选单个细菌菌落。若对土壤样本有特别研究兴趣，可多挑选若干菌落。应选用高稀释度的平板，因其通常含有分离良好且较为纯净的菌落。仅挑选与邻近菌落分离清晰、且形态上彼此明显不同的菌落。
2. 将接种环浸入酒精中灭菌，随后通过火焰灼烧。迅速打开目标培养皿，将接种环接触琼脂表面无菌落的区域以冷却。然后，用接种环挑取少量目标菌落。
3. 取一块新的蛋白胨-酵母提取物平板，在一侧划一条数厘米长的直线。再次灭菌并冷却接种环，然后划第二条线，使其仅在第一次划线的起始处与第一条线相交。以相同方式重复此操作两次。这种划线“稀释”法可使接种环上的细胞逐渐分散。将平板置于避光处，在室温下培养两周。