培养和枚举从土壤样品的细菌

确定环境细菌的准确数量对于评估土壤生态系统的健康状况至关重要。这可以通过用适当稀释度培养细菌菌落来实现。

土壤细菌是健康土壤生态系统的重要组成部分，在分解、固氮和养分循环中发挥作用。表层土壤是有机和无机颗粒的基质，在充满空气或水的孔隙周围形成复杂的基质。这些条件为细菌创造了一个理想的生态系统，表层土壤通常每克含有超过 100 万个细菌。

由于细菌浓度高，因此在接种到生长培养基上之前必须进行稀释。连续稀释可以将原始土壤样品的浓度降低到足够低的水平，以便在培养基板上生长单个菌落，从而可以计算土壤样品中细菌的初始计数。

本视频将说明如何制备土壤样品的连续稀释液，如何接种这些细菌样品，以及如何根据稀释板计算土壤细菌计数。

细菌是简单的原核生物，但在物种和生态系统方面高度多样化。放线菌是细菌的一个亚群，由于其丝状结构，它们通常被认为是一个独特的组，它们在那里串在一起生长形成菌丝。

通常，放线菌占土壤中细菌总数的 10%。细菌和放线菌几乎存在于地球上的所有环境中，但在土壤中也具有无与伦比的多样性和丰富性。

对土壤细菌进行计数，并可能通过稀释板进行培养和鉴定。在这里，将土壤样品在水中连续稀释，然后分散到琼脂生长板上。然后对所得菌落进行计数。该值与稀释因子一起用于阐明土壤中细菌的初始浓度。

稀释电镀是一种常见、廉价且简单的细菌计数方法，但它确实存在几个缺点。在稀释过程中，不应让土壤沉降，这可能会导致生长偏斜。一些土壤细菌不会在平板上培养，或者生长太慢而无法观察到。此外，该方法假设菌落是由单个细菌形成的，但它们可能来自多个细胞的团块。

某些细菌种类在不同的生长培养基上生长得更好。培养多种细菌的常见基质是琼脂蛋白胨酵母板。放线菌优先生长在基于甘油-酪蛋白的平板上，这更适合这些丝状细菌的生长。

现在您已经了解了细菌计数背后的概念，让我们看看这个过程是如何在实验室中进行的。

要开始该程序，请称取 10 g 土壤样品，并加入 95 mL 去离子水中。充分摇晃悬浮液，并标记为"A"。在土壤沉淀之前，用无菌移液管去除 1 mL 悬浮液，并将其转移到 9 mL 去离子水中。彻底涡旋，并标记为 "B"。

重复此稀释步骤 3 次，每次使用 1 mL 先前的悬浮液和 9 mL 去离子水。依次将它们标记为管 C、D 和 E。这导致每 mL 10-1 到 10-5 克土壤的连续稀释。

为了培养细菌菌落，取 3 个预先准备好的蛋白胨酵母琼脂平板并将它们标记为 C、D 和 E。涡旋相应的样品，并将 0.1 mL 移液到每个平板上。由于每毫升报告的 CFU 是每毫升的，因此使用 0.1 mL 会进一步增加 10 倍的稀释度。

接下来，将玻璃涂抹器浸入乙醇中。将撒布器放入火焰中几秒钟，以点燃并燃烧掉乙醇。这将对撒布机进行消毒。

将撒布机保持在第一块板上方，直到火焰熄灭。快速打开板，将盖子放在身边。将撒布器接触远离接种物的琼脂以冷却，然后将接种物滴涂抹在表面，直到游离液体的痕迹消失。装回板盖。

重新燃烧撒布机并对下一个板重复该过程，快速工作，以免空气中的微生物污染板。倒置板以防止水分滴落到琼脂上，并在室温下孵育板一周。

要培养放线菌，取三个预先准备好的甘油-酪蛋白板，并将它们标记为 B、C 和 D。使用前面显示的技术，从悬浮液 B、C 和 D 中铺展 0.1 mL 板。使用较低的稀释度是因为放线菌通常占细菌种群的 1/10。

最后，将这些板倒置并在室温下储存两周。

孵育后，仔细检查所有细菌板，并注意菌落大小和形状的差异。当在琼脂上生长时，细菌会产生从无色到亮橙色、黄色或粉红色的粘稠菌落。相比之下，放线菌菌落是白垩状的、坚硬的、坚韧的，并且在压力下会破裂，而其他细菌菌落会涂抹。这允许通过触摸无菌环来区分菌落。

计数并记录细菌菌落的数量，包括任何放线菌。仅计数每个板 30-200 个菌落的板。

要培养特定单个细菌的培养物，请从任何平板中选择离散的菌落，选择与相邻菌落分离良好的菌落。对扩散环进行消毒，然后打开板并将环接触空位以冷却。接下来，将少量感兴趣的菌落选择到环上。

取新鲜的蛋白胨酵母板，在一侧画几厘米长的条纹。再次消毒和冷却，然后仅在第一遍时制作一条穿过初始条纹的条纹。以相同的方式再重复此过程两次。这种条纹"稀释"导致环上的细胞彼此分离。将板放在黑暗的地方，在室温下孵育两周。

根据细菌和放线菌菌落计数，可以确定每克土壤的菌落形成单位。每克土壤的菌落数等于平板上计数的菌落数乘以平板稀释液的倒数。例如，如果在 10-5 的稀释板上用 0.1 mL 接种剂计数 46 个菌落，则每克土壤的 CFU 等于 46 的 10-6，或每克土壤 4600 万 CFU。

进行细菌计数和培养是许多科学研究或方案中关键的第一步。

健康的土壤每克含有 106 到 108 个细菌。土壤的细菌计数可用于确定感兴趣土壤的健康状况，每克细菌计数少于 106 到 108 个表明土壤不健康或贫瘠。这可能是由于缺乏养分或有机物、极端土壤 pH 值引起的非生物胁迫或土壤污染引起的。

当今医学中使用的许多类型的抗生素最初是从土壤中的细菌或真菌中鉴定出来的。从土壤培养物中分离纯菌株可能有助于科学家识别新的抗生素化合物。在这里，可以将测试细菌或分离的感兴趣化合物添加到与细菌草坪一起生长的板中，并记录它们对草坪生长的影响。细菌草坪上生长被测试细菌或化合物抑制的透明斑块可能表明具有抗生素活性。

包括豌豆和豆类在内的豆科植物依赖于与固氮细菌的共生关系。这些细菌自由生活在土壤中或根系的根瘤内，并产生植物利用的氮化合物。在贫瘠的土壤中，用土壤中培养的固氮细菌补充豆科作物可能会促进植物的生长和健康。这可以产生更大、更耐寒的植物，从而带来更高的作物产量。

您刚刚观看了 JoVE 的细菌计数简介。您现在应该了解如何对土壤样品进行稀释，如何进行菌落计数和菌落分离，以及如何计算土壤样品中的细菌数量。感谢观看！