重结晶法纯化化合物
来源：Jimmy Franco 博士实验室 - Merrimack 学院
重结晶是一种用于提纯固体化合物的技术。1 固体在热液体中的溶解度通常高于在冷液体中的溶解度。在重结晶过程中，将不纯的固体化合物溶解于热液体中直至溶液达到饱和，然后让液体冷却。2 此时该化合物应形成相对纯净的晶体。理想情况下，任…
所有步骤均需在通风橱中进行，以避免接触溶剂蒸气。
1. 选择溶剂
- 将50 mg样品（N-溴代琥珀酰亚胺）置于锥形瓶中。
- 加入0.5 mL沸腾的溶剂（水）。如果样品完全溶解，则表明其在冷溶剂中的溶解度过高，不适合作为良好的重结晶溶剂。
- 如果样品在冷溶剂中不溶解，加热试管直至溶剂沸腾。
- 如果样品尚未完全溶解，可逐滴加入更多沸腾溶剂，直至所有固体溶解。若在热溶剂中溶解样品所需溶剂量超过3 mL，则表明该溶剂对此样品的溶解度可能过低，不适合作为重结晶溶剂。
- 如果首选溶剂不是一种良好的重结晶溶剂，则尝试其他溶剂。若无法找到合适的单一溶剂，可尝试使用两种溶剂体系。
- 如果无法找到合适的单一溶剂体系，则可能需要使用混合溶剂。在选择混合溶剂时，需考虑以下几个关键因素：1）第一种溶剂应能良好溶解目标固体；2）第二种溶剂必须与第一种溶剂互溶st 溶剂，但对溶质的溶解度要低得多。
- 一般而言 "相似相溶" 这意味着极性化合物倾向于溶于极性溶剂，而非极性化合物通常更易溶于非极性溶剂。
- 常用溶剂对（表1)
- 确保溶剂的沸点至少为 40 °C，以便沸点溶剂与室温溶剂之间存在合理的温差。
- 确保溶剂的沸点低于约 120 °C，以便更容易去除晶体中残留的微量溶剂。
- 还需确保溶剂的沸点低于化合物的熔点，以便化合物形成固体晶体而非不溶性油状物。
- 确认杂质要么在热溶剂中不溶（因此在目标化合物溶解后可通过热过滤除去），要么在冷溶剂中可溶（因此在整个过程中保持溶解状态）。
2. 在热溶剂中溶解样品
- 将待重结晶的化合物放入锥形瓶中。相比烧杯，锥形瓶是更合适的选择，因为其倾斜的瓶壁有助于截留溶剂蒸气，减缓蒸发速率。
- 将溶剂（水）置于另一个锥形瓶中，并加入沸石或搅拌子以保持平稳沸腾。在加热板上加热至沸腾。
- 将热溶剂分小份加入盛有化合物且处于室温的锥形瓶中，每加一次后轻轻旋摇，直至化合物完全溶解。
- 溶解过程中，应始终将溶液放在加热板上保持高温。不要加入过量的热溶剂，仅需加入恰好能溶解样品的量即可。
- 如果部分固体在加入更多热溶剂后仍无法溶解，则可能是由于存在极难溶的杂质。若出现此情况，应停止添加溶剂，并在继续下一步前进行热过滤。
- 进行热过滤时，将一张滤纸折叠成褶状圆锥形，放入无茎玻璃漏斗中。
- 向热溶液中加入10–20%过量的热溶剂，以补偿操作过程中的溶剂蒸发损失。
- 将溶液倒入滤纸进行过滤。若在过滤过程中有晶体析出，可加入少量温热溶剂将其溶解。
3. 冷却溶液
- 将含有已溶解化合物的烧瓶置于不易快速导热的表面上，例如放在实验台面上的纸巾上。
- 在冷却过程中轻轻覆盖烧瓶，以防止溶剂蒸发并避免灰尘落入溶液中。
- 静置烧瓶，直至其冷却至室温。
- 待晶体形成后，将溶液放入冰浴中，以确保获得最大量的晶体。溶液应在冰浴中静置 30 分钟至 1 小时，或直至化合物似乎已完全从溶液中结晶析出。
- 若未观察到明显的晶体形成，可通过用玻璃棒轻轻刮擦烧瓶内壁，或加入少量相同化合物的晶种来诱导结晶。
- 如果仍无法诱导结晶，则可能是使用了过多的溶剂。将溶液重新加热，使部分溶剂蒸发，然后再次冷却。
4. 分离与干燥晶体
- 将装有新形成晶体的冷烧瓶置于实验台面上。
- 轻轻覆盖烧瓶，以防止溶剂挥发并避免灰尘落入溶液中。
- 使用布氏漏斗或赫氏漏斗通过减压过滤分离晶体（先将烧瓶用夹子固定在铁架台上）。
- 用少量新鲜的冷溶剂（与重结晶所用相同的溶剂）冲洗布氏漏斗上的晶体，以去除可能附着在晶体表面的杂质。
- 为干燥晶体，可将其留在滤漏斗中，抽气数分钟以通过空气；也可将晶体置于开放环境中静置数小时至数天进行自然风干。更高效的干燥方法包括真空干燥或置于干燥器中。
| 极性溶剂 | 弱极性溶剂 |
| Ethyl acetate | Hexane |
| Methanol | Methylene chloride |
| Water | Ethanol |
| Toluene | Hexane |
表1. 常见溶剂对。
重结晶是一种用于纯化固体化合物的方法。
进行重结晶时，将不纯的固体化合物与热溶剂混合，形成饱和溶液。随着该溶液冷却，化合物的溶解度降低，纯净的晶体从溶液中析出。
重结晶通常用作其他分离方法（如萃取或柱层析）之后的最后一步。重结晶也可用于分离两种溶解度性质差异较大的化合物。本视频将演示重结晶中溶剂的选择、从溶液中纯化有机化合物的方法，并介绍化学领域中的若干应用。
结晶过程始于成核。溶质分子聚集形成稳定的微小晶体，随后进入晶体生长阶段。相较于在溶液中自发形成，成核在晶种、划痕或固体杂质等成核位点上发生得更快。搅拌也可能促进快速成核。然而，若未在最佳条件下生长，快速生长可能导致杂质被包埋进入晶体。
化合物的溶解度通常随温度升高而增加，并且在很大程度上取决于溶剂的选择。高温与低温下溶解度差异越大，溶质在冷却过程中越容易从溶液中析出并形成晶体。
所选择的溶剂其沸点应至少为 40??C，以便在沸点与室温之间存在显著的温差。溶剂的沸点还必须低于溶质的熔点，以利于结晶。快速冷却溶液会诱导形成大量成核位点，从而有利于生成许多细小的晶体。然而，缓慢冷却会诱导形成较少的成核位点，有利于生成更大且更纯净的晶体。因此，优先采用缓慢冷却。
此外，可以选择适当的溶剂以尽量减少杂质。如果溶液中的杂质比溶质本身更易溶解，则可用冷溶剂将已形成的晶体表面的杂质洗涤除去。然而，如果某种杂质的溶解度较低，它会首先结晶析出，随后可在溶质重结晶之前，通过过滤从加热的溶液中去除。
如果单一溶剂不具备所需的性质，可使用混合溶剂。对于溶剂对，第一种溶剂应能很好地溶解该固体，第二种溶剂对溶质的溶解度必须较低，并且与第一种溶剂互溶。常见的溶剂对包括乙酸乙酯和正己烷、甲苯和正己烷、甲醇和二氯甲烷，以及水和乙醇。
了解了重结晶的原理后，接下来我们进行通过重结晶纯化有机化合物的实验操作。
开始此操作时，将 50 mg 样品放入玻璃试管中。
加入0.5 mL室温溶剂。如果化合物完全溶解，则表明其在冷溶剂中的溶解度过高，不适合用于重结晶。否则，将试管中的混合物加热至沸腾。
如果化合物在沸腾的溶剂中未能完全溶解，可将另一部分溶剂加热至沸腾。逐滴加入沸腾的溶剂至试管中，直至固体完全溶解，或试管中溶剂体积达到 3 mL。若固体仍不能溶解，则表明该化合物在此溶剂中的溶解度太低。
确认杂质在热溶剂中不溶，以便在溶解后通过过滤去除，或在冷溶剂中可溶，以便在重结晶完成后仍保留在溶液中。若某种溶剂满足所有条件，则适用于重结晶。
开始重结晶时，将溶剂加入含搅拌子的锥形瓶中，在加热板上加热至沸腾。将待重结晶的化合物置于另一处于室温下的锥形瓶中。
接下来，向化合物中加入少量热溶剂。轻轻摇动烧瓶中的混合物，然后也将其置于加热板上。重复此过程，直至样品完全溶解，或继续添加溶剂不再引起进一步溶解为止。
加入过量10%的热溶剂以补偿蒸发损失。将滤纸放入布氏漏斗装置中。过滤溶液以除去不溶性杂质。如果在过滤过程中析出晶体，用几滴热溶剂将其溶解。
将溶液在实验台面上冷却。盖住烧瓶以防止溶剂因蒸发而损失，并避免颗粒物进入溶液。
将烧瓶静置，直至冷却至室温。冷却过程中若进行搅动，可能导致快速结晶，从而得到纯度较低的晶体。若冷却后仍未观察到晶体析出，可用玻璃棒轻轻刮擦烧瓶内壁，或加入少量待重结晶化合物的晶种，以诱发结晶。
如果无法诱导结晶形成，可重新加热溶液以蒸发部分溶剂，然后再次将溶液冷却至室温。
晶体形成后，准备一个冰浴。保持溶液覆盖，将溶液置于冰浴中冷却，直至结晶过程似乎已完成。
将过滤瓶夹在铁架台上，并将瓶子连接至真空管路。在瓶口放置布氏漏斗及适配器。
将溶液与晶体的混合物倒入漏斗中，开始抽滤。用冷溶剂将烧瓶中残留的晶体冲洗至漏斗中。用冷溶剂洗涤漏斗中的晶体，以去除可溶性杂质。
继续抽气通过漏斗以干燥晶体，然后关闭真空泵。如有必要，可将晶体置于室温下晾干，或放入干燥器中干燥，然后再储存结晶产物。
粗产物中存在的黄色杂质已被去除，得到白色至微带黄色的固体。根据化合物的性质及杂质的种类，可通过核磁共振波谱、熔点测定或目视检查来验证晶体的纯度。
通过重结晶进行纯化是化学合成与分析中的重要工具。
X射线晶体学是一种强大的表征技术，可确定分子的三维原子结构。该方法需要一个通过重结晶获得的高纯单晶。某些类型的分子（如蛋白质）难以结晶，但其结构对于理解化学功能至关重要。通过精心选择重结晶条件，即使是这类分子也可利用X射线晶体学进行分析。欲了解有关此过程的更多信息，请参见本合集中关于晶体生长用于晶体学研究的视频。
不纯的反应物可能导致不需要的副反应。通过重结晶纯化反应物可提高产物的纯度和产率。在固体产物被分离并洗涤后，还可通过从滤液中去除挥发性物质，并从所得固体中再次重结晶产物，进一步提高反应产率。抗冻蛋白（antifreeze proteins, AFPs）在许多生活在寒冷环境中的生物体内表达。AFPs 通过结合冰晶平面，抑制其重结晶为更大的冰晶，从而抑制体内冰晶的生长。不同类型的 AFPs 可结合不同晶面的冰晶。研究 AFPs 的结合机制通常涉及将其吸附到单个冰晶上。单个冰晶的良好生长对于获得清晰且具有信息性的实验结果至关重要。这类蛋白在耐寒作物的工程改造以及低温外科手术等领域具有应用前景。
您刚刚观看了 JoVE 关于通过重结晶纯化化合物的简介视频。现在，您应该已经熟悉该技术的基本原理、纯化步骤以及重结晶在化学中的一些应用。
感谢观看！
Q1: Why is solvent selection important for recrystallization?
Solvent selection determines recrystallization success. The ideal solvent has high solubility for the compound at high temperature but low solubility at room temperature, maximizing crystal formation. The solvent's boiling point must be at least 40°C above room temperature and below the solute's melting point to enable effective crystallization and temperature control.
Q2: What happens during the nucleation and crystal growth stages?
Nucleation occurs when solute molecules form stable small crystals, often faster on seed crystals, scratches, or impurities than spontaneously. Rapid cooling favors many small crystals, while slow cooling produces fewer, larger, and purer crystals. Slow cooling is preferred because rapid growth can trap impurities within the crystal structure.
Q3: How does recrystallization remove impurities from compounds?
Recrystallization exploits solubility differences. If impurities are more soluble than the solute in cold solvent, they remain dissolved and can be washed away. If impurities are less soluble, they crystallize first and can be filtered from the hot solution before the desired compound recrystallizes, leaving a purer product.
Q4: When should solvent pairs be used instead of single solvents?
Solvent pairs are used when no single solvent meets all recrystallization criteria. The first solvent dissolves the solid readily at high temperature, while the second solvent has lower solubility for the solute and is miscible with the first. Common pairs include ethyl acetate and hexane, or methanol and dichloromethane.
Q5: What is the role of column chromatography before recrystallization?
Column chromatography is often used as a preliminary separation method to remove most impurities before recrystallization. Recrystallization works best when most impurities have already been removed by another method such as column chromatography principle separation of compounds, allowing it to focus on final purification.
Q6: How can purity of recrystallized compounds be verified?
Compound purity can be verified using nuclear magnetic resonance nmr spectroscopy, melting point measurements, or visual inspection. These techniques confirm that impurities have been successfully removed and the recrystallized solid meets purity standards for further use in synthesis or analysis.
Q7: Why is recrystallization essential for X-ray crystallography studies?
X-ray crystallography requires pure single crystals to determine three-dimensional atomic structures. Recrystallization produces the high-purity crystals needed for accurate structural analysis. Even difficult-to-crystallize molecules like proteins can be analyzed through careful recrystallization conditions and growing crystals for x-ray diffraction analysis.