使用qPCR定量环境微生物和病毒

1. 样品采集

1. 使用土钻或铲子采集指定深度的土壤。若采集根际土壤，仅收集植物根部周围7 mm范围内的土壤，通过敲落根部多余的土壤，并将目标土壤刮入收集桶中。
2. 将无菌Nalgene瓶放入取样杆中，手持杆的一端，将瓶子浸入水中采集水样，并将样品瓶放入装有冰块的冷藏箱中。
3. 将样品转移至实验室。

2. 核酸提取

1. 如需从采集的样品中分离微生物并提取其 DNA 和/或 RNA，请参阅 JoVE 科学教育视频《群落核酸提取》。

3. 逆转录

1. 如果待检测的遗传物质是RNA，则必须先通过逆转录将其转化为互补DNA（cDNA），然后再进行PCR。详情请参见JoVE科学教育视频中关于RT-PCR的内容。

4. 建立 qPCR

1. 取出保存在 -20 °C 的试剂，在冰上或洁净工作台内室温条件下解冻。本示例中使用的试剂包括 qPCR 反应混合液（根据所用 qPCR 仪器而定；含有 DNA 聚合酶）、正向引物和反向引物，以及 TaqMan 探针。引物和探针序列针对待定量的生物体设计特异性序列。请参考当前文献以获取感兴趣的序列。本示例将使用 Roche Light Cycler 480 Probes Mix 试剂系统。水中样本中的辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus）将被定量。^1,2 引物和探针序列见表 1。
2. 在室温下解冻样品中提取的 (c)DNA 以及阳性对照 DNA（包含克隆至细菌质粒中的目标生物特异性序列）。
3. 准备一个与 96 孔 qPCR 板相对应的 96 格表格模板。为每个格子标注将要加入的反应类型。每份样品和标准品均需设置三个重复孔，并包括阳性对照和阴性对照（如无 DNA 的空白对照反应）。
4. 根据制造商说明书和文献资料，计算“主混合液”所需的试剂体积，主混合液包含所有反应中共有的恒定试剂。主混合液的配制量应满足所有样品及对照的三重复反应所需，并额外增加 10% 以补偿移液误差。主混合液配方示例见表 2。
5. 在洁净工作台内操作，待所有试剂完全解冻后，按照计算量将各试剂依次加入一个 1.5 mL 低吸附微量离心管中以配制主混合液。添加前每种试剂均需涡旋振荡并短暂离心。每次更换试剂时均需更换移液器吸头，以防污染并确保浓度准确。所有试剂加入后，对主混合液管进行涡旋振荡并短暂离心，以确保混合均匀。
6. 将适量主混合液分装至 96 孔 PCR 板中对应的各个孔位。
7. 向指定孔中加入相应体积的 (c)DNA 样品、阳性对照质粒以及阴性对照（分子级水）。
8. 所有样品和对照加样完成后，用封板膜密封反应板。使用封板工具将膜下空气挤出，避免产生气泡。小心撕去封板膜边缘多余部分。
9. 将密封好的 96 孔 PCR 板放入配备板架的离心机中离心，使各孔中的反应液聚集于孔底。离心时务必使用配重板，确保离心机运转过程中保持平衡。以不超过 1000 rpm 的速度瞬时离心，随后让离心机在不使用刹车的情况下缓慢停止。

5. qPCR 操作

1. 将密封的96孔板放入qPCR仪中，确保仪器显示已准备就绪，可以开始运行。
2. 按照qPCR仪的操作说明，在软件中正确输入所需的所有信息，然后启动qPCR仪运行程序。
3. 仪器完成运行后，软件将利用已知浓度的阳性对照计算每个反应中cDNA的含量。随后可根据样品在稀释、过滤、浓缩、扩增和/或提取过程中所经历的处理步骤，推算出原始样品中病毒的含量。

试剂	序列 (5’ → 3’)	体积 (μL / 孔)	终浓度
正向引物	GAGTGGTTTGACCTTAACGT­TTGA	2.25	900 nM
反向引物	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 nM
探针	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 nM

表1. 检测辣椒轻斑驳病毒的示例引物和探针序列。

试剂	体积 (μL / 孔)	孔数	总反应混合液体积 (μL)
LC 480 Mix	12.5	26	325
分子级 H2O	4.5		117
正向引物	2.25		58.5
反向引物	2.25		58.5
探针	1.0		26
总计	22.5		585

表2. 单个反应和总反应混合液的试剂体积。