量化环境微生物和病毒使用 qPCR

定量聚合酶链反应 （qPCR） 的出现使得定量测定环境样品中任何微生物的量成为可能。

与标准 PCR 一样，qPCR 通过检测目标生物体特异性 DNA 序列的存在与否来鉴定微生物。这允许检测无法在实验室培养的微生物，从而可以检测更广泛的环境生物。此外，qPCR 允许定量评估 DNA 的量。但与此同时，PCR 方法可以检测所有死活生物体的 DNA，从而限制了仅在样品中寻找活跃生长的微生物的能力。

本视频将回顾区分 qPCR 与常规 PCR 的化学创新，解释如何使用 qPCR 定量测量 DNA，演示使用 qPCR 从土壤样品中检测 RNA 病毒的方案，最后，展示 qPCR 如何应用于当今的环境微生物学。

qPCR 的基本原理与常规 PCR 相同 - 引物退火到模板、PCR 产物延伸和产物从模板变性的重复循环，导致目标靶序列（称为扩增子）从起始材料池中呈指数级扩增。

qPCR 的创新之处在于在反应中添加了荧光化学物质，这使得专业的热循环仪可以直接"实时"观察每个循环中 PCR 产物的合成，从而可以量化原始样品中模板序列的量。通常根据阈值循环（缩写为 Ct，也称为定量循环或 Cq）来测量数量，Cq 是荧光产物量超过背景水平的 PCR 循环。

定量可以是相对的，其中将一个序列的 Ct 值与另一个标准品或对照序列的 Ct 值进行比较;相对量等于 2 的 Ct 差的幂。或者，如果在反应中将一系列已知数量的 DNA 与样品一起运行，则可以产生比较荧光值与 DNA 量的标准曲线，并允许对样品 DNA 进行绝对定量。

qPCR 中使用了两大类荧光分子。在一种情况下，反应中包括与双链 DNA 特异性结合的荧光染料。染料仅在与 DNA 结合时发出荧光，因此可以定量双链 DNA 产物的量。

在另一种方法中，针对感兴趣的特定靶序列设计一小段 DNA，称为探针。探针以化学方式连接到荧光染料以及"淬灭基"分子上，当靠近时，该分子会抑制来自染料的荧光信号。合成 DNA 产物的聚合酶具有 DNA 降解活性，会导致荧光分子从探针中"释放"出来，从而将染料与淬灭基团分离并允许检测荧光信号。

现在您已经了解了 qPCR 背后的原理，让我们看看使用该技术从土壤样品中鉴定感染植物的 RNA 病毒（辣椒轻度斑驳病毒）的方案。

在这个演示中，将从根际收集样本，根际是植物根周围约 7 毫米的土壤区域，受根及其共生微生物的影响。

要收集根际土壤，首先小心地从地面中提取感兴趣的植物，然后敲击它以尽可能多地去除多余的散装土壤。包装植物以便在实验室中进一步加工。

将样品带回实验室后，使用无菌刮刀将所需的土壤刮入收集容器中。然后，从土壤中收集病毒并提取 RNA。

从样品中收集 RNA 后，通过逆转录将其转化为互补 DNA 或 cDNA。有关此程序的详细信息，请参阅关于逆转录-PCR 的 JoVE SciEd 视频。

准备进行 qPCR 时，在专用层流罩内在室温下解冻冷冻试剂，解冻后置于冰上。含有 DNA 聚合酶的试剂组分应始终保存在冰上。

解冻样品 cDNA 和阳性对照 DNA，例如克隆了目标扩增子的环状 DNA，称为质粒。

在 96 孔 qPCR 板中组装反应之前，在纸上准备一个 96 单元的表格模板，并用将加载到板中的反应标记每个单元。包括每个样品和标准品的反应，以及阳性对照和阴性对照的反应，例如无 DNA 反应。

计算反应"预混液"所需的试剂体积，其中包括反应中恒定的所有试剂。为所有样品和对照准备足够的预混液进行三次重复反应，并额外准备 10% 的预混液以解决移液误差。

试剂解冻后，将预混液组装在 1.5 mL 低吸附微量离心管中。为此，请短暂涡旋每种试剂以彻底混合，使用微型离心机收集管侧面的任何液体，然后将试剂移液到微量离心管中。确保为每个反应组分使用新的移液器吸头。添加所有试剂后，涡旋混合并离心。然后，将适量的预混液分装到 PCR 板上的指定孔中。

接下来，用样品和对照 DNA 涡旋离心每个试管，并将适量移液到 PCR 板上的相应孔中。添加样品后，用密封膜密封板，并使用密封工具将密封件完全弄平并推出任何气泡。小心地从密封件的末端撕下非粘性标签。

为了将反应混合物完全收集到孔底部，请将反应板放入带有板架的离心机中，并用配重板适当平衡转子。将板脉冲离心至 1,000 rpm，然后让离心机在没有制动器的情况下缓慢停止。

将反应板放入 qPCR 机器中。根据制造商的规格设置 PCR 程序，根据所使用的引物对设置熔解温度。将反应程序设置为 run。

qPCR 程序完成后，软件将能够使用已知浓度的阳性对照来计算每个反应中 cDNA 的量。然后可以计算原始样品中的病毒数量。

qPCR 程序完成后，软件将能够使用已知浓度的阳性对照来计算每个反应中 cDNA 的量。

根据 qPCR 的结果、转移到孔中的体积、从土壤中提取以及逆转录的因子，可以计算出初始土壤样品中的病毒数量。

现在您知道了 qPCR 是如何进行的，让我们看看如何使用它来分析不同的环境样品。

qPCR 可用于量化从许多不同类型样本中回收的病毒数量。在本应用中，通过多种不同的方法从水样中浓缩了两种不同类型的腺病毒。然后从病毒中提取 DNA 并进行 qPCR，以评估浓度方法的相对效率。

基于 qPCR 的微生物计数的另一个应用是量化食品和农业样品中的细菌含量 - 在本例中，来自养鸡场的粪便和垫料样品。科学家们没有针对单个物种，而是使用针对所有细菌中发现的高度保守基因的引物进行了 qPCR，并量化了样本中发现的总细菌群落。

最后，如前所述，传统 qPCR 方法的一个缺点是无法区分活微生物和死微生物。然而，通过添加一种称为单叠氮化丙啶 （PMA） 的化学物质，该化学物质只能进入死细胞，在那里它与 DNA 结合以抑制随后的酶促反应，例如 PCR，这里的研究人员能够区分大肠杆菌 O157：H7 的活培养物和死培养物，这是一种在受污染的食物和水中发现的常见致病菌株。

您刚刚观看了 JoVE 关于使用 qPCR 定量环境微生物和病毒的介绍。您现在应该了解 qPCR 的工作原理、如何使用 qPCR 测量环境样品中的微生物含量以及该技术的一些应用。感谢观看！