柱层析

1. 硅胶悬浊液

1. 将硅胶倒入锥形瓶中。所用填料的质量应约为待分离样品质量的50倍。如果待分离化合物的R_f值非常接近，则可能需要每份样品使用更多的硅胶，本示例即属于这种情况。
   1. 由于需分离的样品为50 mg（含45 mg芴酮和5 mg四苯基卟啉），因此在锥形瓶中加入10 g硅胶。
2. 向装有硅胶的锥形瓶中加入洗脱溶剂体系（正己烷/二氯甲烷，70% : 30%）。加入足够的溶剂，确保所有硅胶均充分溶剂化。硅胶不会溶解，但溶剂化后的混合物在视觉上可明显观察到变化。加入溶剂后，轻轻旋动锥形瓶，以确保所有硅胶充分溶剂化。

2. 色谱柱的制备

1. 选择合适尺寸的色谱柱。通常情况下，硅胶悬浮液应填充至色谱柱约一半高度。待纯化的样品量越大，所需的色谱柱也越大。
2. 用一小团玻璃棉塞住色谱柱底部。使用长杆将玻璃棉牢固地压入柱底，位置应在活塞上方紧邻处。
3. 待玻璃棉固定后，在其上方铺一层薄薄的沙子。
   注意：如果色谱柱在活塞上方已配有玻璃砂芯，则应省略此步骤。
4. 将色谱柱用夹子固定在铁架台上，保持垂直状态。
5. 使用漏斗将预先制备好的硅胶悬浮液轻轻倒入色谱柱中。可能需要加入额外溶剂，以将烧瓶中的悬浮液完全转移至柱内。用移液管冲洗附着在柱壁上的任何硅胶。
   1. 当硅胶在柱内沉降时，轻轻敲击柱壁，确保硅胶紧密填装，并排除任何气泡。
6. 打开活塞，让溶剂流入干净的锥形瓶中，直至溶剂液面接近但尚未与硅胶层接触。在整个操作完成前，硅胶层绝不能干涸。
7. 在硅胶层上方铺一层薄沙（图1）。用移液管冲洗可能粘附在柱壁上的沙粒。
8. 继续排去多余溶剂，直至沙层变干，但溶剂液面不得降至硅胶层表面。

图1. 在加入样品前，柱层析实验的正确装置示意图。

3. 将样品加入层析柱

1. 用尽可能少的溶剂溶解样品（使用与制备硅胶浆时相同的溶剂）。
2. 用移液管将样品轻轻加至层析柱顶部。
3. 待样品加至层析柱顶部后，打开活塞，使溶剂通过砂层排出，但不能通过硅胶层。用极少量溶剂冲洗可能附着在柱管内壁的样品，并将此部分溶剂也通过砂层排出。

4. 通过色谱柱洗脱样品

1. 使用移液管非常轻柔地加入 4–5 mL 溶剂，注意不要扰动砂层。
2. 在柱子顶端放置一个漏斗，然后非常缓慢而轻柔地用溶剂填满柱子的其余部分。
3. 打开活塞，使溶剂流经柱子。
4. 开始收集从柱子中流出的流动相，并将其导入试管中。
   1. 试管应按顺序放置在试管架中。
5. 根据需要向柱顶添加额外的溶剂，直到所有目标化合物均从柱子中洗脱出来。

5. 回收组分

1. 如果化合物有颜色，则可以通过视觉直接识别。但如果化合物无色，则必须使用紫外光（UV）（若化合物含有共轭结构）或适当的染色剂进行检测。化合物的纯度可通过薄层色谱法进行验证。
2. 确定含有目标化合物的试管。
3. 将所有含有目标分离化合物的组分合并至一个预先称重的圆底烧瓶中。每种待分离的化合物均需进行此操作。
4. 将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪上，蒸发溶剂。
5. 待溶剂完全除去后，称量含有干燥产物的圆底烧瓶重量，减去圆底烧瓶的初始重量，即可得到产物的收率。